遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

この手順の全体的な目的は、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）センサーを用いて、生細胞内で異種発現させたトランスポーターによるグルタミン輸送をイメージングすることです。まず、Cause 7細胞にグルタミンセンサーとトランスポーターを導入することでこれを実現します。このセンサーは、細菌のグルタミン結合タンパク質に挿入されたFRETドナーと、同タンパク質のC末端に配置されたFRETアクセプターで構成されています。

第2ステップでは、灌流システムを構築し、倒立蛍光顕微鏡を用いて細胞をリアルタイムでイメージングします。最終ステップでは、画像を解析し、グルタミンの動態を可視化します。最終的に、これらのFRETセンサーを用いることで、単一細胞におけるトランスポーター活性を検出することが可能です。

クロマトグラフィーベースの測定などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、空間時間分解能が大幅に向上することです。この手法は、センサータンパク質の細胞への導入、リアルタイムイメージング、および実験後の解析コストという3つのパートで構成されています。本実験では、内因性のグルタミン輸送活性が低いため、7つの細胞が使用されます。

8ウェルガラスボトムディッシュに、10% cosmic calf serum (CCS) および 100 units/mL の Penicillin streptomycin を添加した DMEM を用い、70から80%のコンフルエンシーで細胞を播種します。37°C、5% CO2、100%湿度の条件下で24時間インキュベートします。

24時間後、培地を抗生物質を含まない10% CCS添加DMEMに交換し、37°C、5% CO2、100% 湿度の条件下で一晩培養します。トランスフェクション当日、グルタミンセンサーをコードするプラスミドDNAと、タグ付き必須アミノ酸交換輸送体mCherry-ASCT2をそれぞれ0.4 µgずつ、50 µLの無血清培地に加えます。

1 µLのトランスフェクション試薬を50 µLの無血清培地に加え、穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、DNAを含む溶液と希釈したトランスフェクション試薬を混合し、室温で20分間インキュベートします。20分後、トランスフェクション試薬混合液をcost seven細胞の上に穏やかに加え、チャンバーをロッキングして穏やかに混合します。

37°C、5% CO2、100%湿度の条件下で24時間インキュベートします。24時間後、培地を10% CCSおよび100 unitsのペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEMに交換します。灌流を開始する前に、細胞をインキュベーターに戻します。

付属の原稿にある処方に従って、灌流バッファーAからFを調製します。50 milliliterシリンジにストップコックを取り付けます。ストップコックを閉じて、シリンジに灌流溶液を満たします。

ストップコックを短時間開き、ストップコック内のヘッドスペースをバッファーで満たします。次に、パーフュージョンペンシルを備えた8チャンネル重力灌流システムを起動し、マニュアルモードを選択します。

選択機能オプションの下で操作します。灌流ペンシルの下に廃棄容器を設置してください。本実験を成功させるためには、ドリフトと溶液のキャリーオーバーを最小限に抑えるように灌流をセットアップすることが重要です。

対応する番号を押してポートを手動で起動し、チューブ内に水を満たします。10 milliliterのシリンジを使用してポートを閉じ、バッファーAからFを含むシリンジを灌流システムのポート1から6にセットし、ストップコックを開きます。その後、

ポートを再度開き、チューブ内の水をバッファーに置換します。流速は毎分約0.8 millilitersに設定してください。灌流コントローラーのキャンセルボタンを1回押し、機能選択メニューに戻ります。

編集プログラムオプションに切り替え、この表に示された灌流プロトコルを入力します。灌流プログラムを保存します。細胞のイメージングは、トランスフェクションの48〜72時間後に行います。

細胞を洗い流さないように注意しながら、ガラスボトムディッシュのウェルを灌流バッファーAで2回洗浄します。ガラスボトムディッシュを蛍光顕微鏡のステージに設置します。灌流システムをチャンバーに接続します。

オープンチャンバーを使用する場合は、チャンバーから灌流液を排出するための別のポンプを設置します。スライドブックイメージングソフトウェアを開きます。フォーカス機能を使用して新しいスライドを開始し、適切なフィルターセットを用いて、センサーとA SCT two M cherryを共発現している細胞を探します。

カメラタブをクリックし、ゲインの下にあるスライドバーを動かしてゲインを調整します。また、ニュートラル密度フィルターのドロップダウンメニューから、ニュートラル密度フィルターの設定を調整してください。「image capture」をクリックし、取得ウィンドウで、使用するフィルターを指定します。

画像は3つのチャンネルで取得します。ドナー励起・ドナー蛍光、およびアクセプター励起・アクセプター蛍光です。テストボタンをクリックし、フィルター設定の隣にあるボックスに希望の露光時間を入力して、露光時間を調整してください。3つのチャンネルすべてを同じ時間だけ露光させる必要があります。

領域ツールを使用して関心領域（ROI）を描画します。キャプチャタイプのボックスでタイムラプスを選択します。次に、実験の間隔とタイムポイントを指定します。

次に、背景減算に使用するために、蛍光細胞が存在しない領域を囲んで指定します。描画した領域を右クリックし、それを背景として設定します。カメラで検出される自家蛍光と背景蛍光の両方を考慮するため、理想的にはセンサーを発現していない細胞を背景領域として使用してください。

「select function run programs」オプションから目的のプログラムを選択し、保存済みプログラムに切り替えてから、灌流コントローラーのEnterキーを押します。これでプログラムがロードされました。灌流とイメージング実験を同時に開始させるため、任意のキーを押すと灌流が始まります。灌流コントローラーのキーを押すと同時に、キャプチャウィンドウのスタートボタンをクリックしてください。

ここでは、sCT2トランスポーターと、親和性が8 mMおよび100 µMのFRETグルタミンセンサーを共発現させた細胞を用いた典型的なタイムコース実験を示しています。グルタミンの流入は、ドナーであるmtfp1とアクセプターであるVenusの間の蛍光強度比の変化として検出されます。また、アラニン存在下におけるグルタミンの流入によって、基質競争も実証されています。

トランスポーターの特異性についても、これらのセンサーを用いて検討することが可能です。ここでは、細胞にグルタミンを事前に負荷し、その後、細胞外灌流液にさまざまなアミノ酸を添加しました。予想通り、8つの基質がグルタミンのフラックスを誘導した一方で、非基質のアミノ酸では誘導されませんでした。

基質の添加によってFRET効率の変化が見られない理由としては、8 mMセンサーまたは100 µMセンサーを発現している細胞で示されたように、テストした基質に対する取り込み能が低いことなどが考えられます。しかし、FRET効率の変化が他のパラメータの変化ではなく、実際に基質が変化したことによるものであることを確認するためには、sCT2トランスポーターを発現していない細胞での検証が必要です。同様の灌流プロトコルを、実験条件下で飽和することが予想されるセンサーを発現している細胞を用いて実施します。

この例では、センサーの親和性は1.5 micromolarです。このビデオを視聴することで、FRETセンサーを用いて代謝物のダイナミクスをイメージングする方法について十分に理解できたはずです。曝露のリスクを最小限に抑えるため、細胞培養は標準作業手順書に従って適切に取り扱う必要があることを忘れないでください。