プロデュース上皮損傷の解析赤痢アメーバ感染症

この手順の全体的な目標は、初期の宿主病原体の相互作用とTBAの浸潤可能性を評価することです。ヒストリティカ。まず、無傷の栄養型、栄養型、総溶解物、または分泌された栄養型を調製します。次に、宿主上皮細胞を適切な濃度の異なる栄養型細胞でインキュベートします。

現在、AM免疫蛍光法を使用して、上皮細胞のタイトジャンクションと相互作用する特定のABAヒストリチカタンパク質について処理された上皮培養物を分析し、トランス上皮電気抵抗による傍細胞バリアの変化も測定します。まとめると、TBA Histolyticaによるタイトジャンクション分解を実証でき、このプロセスへの選択した複合体の関与も特定できます。この技術の主な利点は、寄生虫のさまざまな製品を使用して、Eva histo因子の宿主上皮への転座を評価し、これらのEvaの関与を実証することです。

感染の非常に早い時期に全細胞の接合部が開く彼の要因。この方法は、上皮寄生虫とdiva isli寄生虫の間の分子相互作用の理解など、アメーバの領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな人は、コインキュベーションのための2つの細胞の適切なインキュベーション時間の割合、また、異なるELI産物の入手方法、TERの測定方法がわからないため、苦労するでしょう。

この技術の意味は、E-H-C-P-A-D-H 112複合体などのこれらのvir因子が新しい治療戦略の標的として利用できるため、AMIの治療にまで及びます。4。このin vitro法は、病院施設の初期相互作用におけるアニカウイルス因子の関与に関する洞察を提供することができます。また、inbivo、ハムスターマウス、モルモットの感染モデル、およびヒト腸生検などの他のシステムにも適用できます。文化。

10ミリリットルの相補型DMEM培地中のMDCK細胞を、二酸化炭素5%、摂氏37度で溶解した。真に1回10から5番目の栄養型に成長します ベントアメーバヒストリチカ TYIS 33の15ミリリットルで、摂氏37度で中程度。栄養型を取り外すには、チューブを氷水浴で5〜10分間冷やします。

次に、培養物を円錐形のチューブに無菌的に移し、Gの360倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上澄みを慎重にデカントします。氷冷したPBSをペレットに加え、チューブを数回反転させて、遠心分離後に細胞を分散させます。

ヘモサイトメーターを使用して栄養価を決定し、栄養型を灰汁にし、液体窒素で1分間凍結し、摂氏4度で解凍し、激しく渦巻きます。次に、ライセート中に存在するプロテアーゼを0.02%βメルカプトエタノールで活性化します。3ミリリットルの氷冷PBSで6つの栄養型に10の9倍を希釈し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。

次に、栄養懸濁液を摂氏37度のインキュベーターに5度傾けた水平角度で2時間置き、分泌された製品を収集するために、チューブをGの360倍で10分間遠心分離します。使い捨ての滅菌シリンジを使用して、ペレットからの栄養型によるサンプルの汚染を避けて、上清を慎重に収集します。次に、転移した細胞を除去するために、上清を0.22ミクロンの酢酸セルロース膜に通します。

次に、免疫蛍光培養のために0.02%βメルカプトエタノールでプロテアーゼを活性化します。滅菌ガラスカバー上のMDCK細胞は、24マルチウェル細胞培養皿の中に入ります。倒立顕微鏡で細胞を100%コンフルエントに達するまで検査します。

1ミリリットルの温かいPBSで希釈した栄養型のさまざまな条件を追加します。PBSおよびno e histolyticaを有するMDCK細胞の制御条件、ならびに栄養型とは異なる条件を有するMDCK細胞の制御条件を含め、一次抗体とのインキュベーションを放出します。培養プレートをインキュベーターに2〜30分間置きます。

次に、上皮細胞を冷たいPBSで5回洗浄して、結合していない分子や栄養型細胞を排除します。湿ったチャンバー内で、1ミリリットルの96%エタノールをマイナス20°Cで数分間細胞を固定し、透過します。カバーをウェルから慎重に取り出します。

濾紙を使用して端から余分な液体を取り除き、セルを下に向けてカバースリップを0.5%BSAブロッキング溶液に浸します。サンプルを室温で1時間インキュベートします。その間、PBS中の一次抗体の混合物を調製します。

ブロッキングソリューションからカバースリップを持ち上げます。濾紙で余分な液体を乾かします。細胞を抗体溶液に移し、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。

細胞を1ミリリットルのPBSで5回洗浄して、結合していない分子を取り除きます。次に、PBS中の2つの蛍光二次抗体の混合物を調製します。二次抗体中のサンプルを室温で1時間、暗所で核染色のためにインキュベートします。

暗所の室温で、200マイクロリットルの0.05ミリモルダッピー溶液で細胞を3分間インキュベートします。次に、共焦点顕微鏡でZack切片とXZ平面を通した共焦点顕微鏡で調製物を分析します。プロテアーゼ阻害剤または特異的抗体を使用して、各実験条件をプロテアーゼ阻害剤またはモノクローナル抗体培養物と摂氏4度で20分間インキュベートします。

上部コンパートメントの滅菌トランスウェル透過性支持体上のMDCK細胞は、100マイクロリットルの細胞懸濁液を置き、下部コンパートメントには600マイクロリットルの補充されたDMEM培地を置きます。調製したトランズウェルフィルターを倒立顕微鏡のインキュベーターに入れます。セルが 100% コンフルエントであることを確認します。

各トランズウェルの上部コンパートメントから培地を収集し、この培地混合物の50マイクロリットルにプールします。50マイクロリットルの栄養型懸濁液またはPBSコントロールを追加します。次に、混合物をMDCK細胞を含む各トランスウェルの上部チャンバーに移します。

すぐにSTX 2つの電極を各トランスウェルに浸して、経上皮の電気抵抗を測定します。長い方の電極が下部チャンバーの底部に接触し、短い方の電極が上部コンパートメントで媒体で覆われていることを確認してください。E histolyticaはアクセント条件下で培養され、成長の対数後期から初期定常期に収穫されました。

ここでは、タイトジャンクションマーカーゼロワンを使用して、タイトジャンクションと接着ジャンクションによって安定化される上皮細胞の細胞接触を視覚化しました。モノクローナル抗体による免疫蛍光法を用いて、アメーバ由来の複合体と、栄養型、全溶解物、または分泌産物の上皮単層への上皮表面への適用との相互作用を研究し、タイトジャンクションを持つ複合体の共局在化をもたらしました。30分後、不連続なZO 1染色が細胞境界および小胞の内在化で発生した。

この混乱は、MDCK細胞が栄養型および栄養型と接触したときに最も顕著でした。全溶解物共焦点レーザー顕微鏡法は、病原性複合体が細胞間空間に向かって浸透することを示しました。破壊されたze O one染色寄生虫接触と共局在すると、上皮バリア機能が破壊され、トランス上皮電気抵抗が90%低下しました。

栄養型を複合体に対する抗体またはプロテアーゼ阻害剤と事前にインキュベートすると、採取したTER滴に対する防御が得られました。一緒に。これらのデータは、タンパク質分解活性と接着特性の両方が、e histolyticaの侵入中にこの複合体の重要な病原性因子であることを示唆しています。このビデオを見た後、あなたはよく理解しているはずです メカニズムを分析する方法 EMBAヒストリチカウイルス 因子が早期感染時にタイトジャンクションを開くとき この上皮損傷の分析をマスターすると、lya製品と細胞培養の準備ができたら3時間で行うことができます。

この手順を取得する際には、この手順に従ってイオンの正確な相互作用時間を守ることを忘れないでください。免疫沈降アッセイのような他の方法は、enba、histolytica暴力因子および上皮タンパク質との間の可能な関連のような追加の質問に答えるために実行することができる それが開発された後。この技術は、アルサイド相互作用の分野の研究者が、ハムスターマウス、モルモット、およびヒト組織におけるAMSの病因を調査する道を開きました。