プロデュース上皮損傷の解析

この手順の全体的な目的は、初期の宿主病原体相互作用およびTBA.Histolyticaの侵入能を評価することです。まず、無傷の栄養体、栄養体、全溶出液、または栄養体分泌物の調製を行います。次に、適切な濃度の各種栄養体とともに、宿主上皮細胞をインキュベートします。

次に、AM免疫蛍光法を用いて、処理した上皮培養細胞を解析し、上皮細胞のタイトジャンクションと相互作用する特定のABA histolyticaタンパク質を分析します。また、経上皮電気抵抗（TEER）によってパラセルラーバリアの変化を測定します。これらの結果を総合することで、TBA Histolyticaによるタイトジャンクションの分解を実証し、さらにこのプロセスにおける特定の複合体の関与を特定することができます。本手法の主な利点は、寄生虫の異なる産物を用いて、ホスト上皮へのEva histo因子の移行を評価できること、およびこれらのevaの関与を実証できることです。

感染のごく初期段階における全細胞の接合部開口に関する要因。この手法は、上皮細胞とdiva isli寄生虫の間の分子相互作用の理解など、アメーバの浸潤分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、適切なインキュベーション時間や共インキュベーションにおける2種類の細胞の比率、また、異なるELI産物の取得方法およびTERの測定方法が分からず、苦労することがあります。

この手法の意義は、E-H-C-P-A-D-H 112 complexのようなウイルス因子が新しい治療戦略の標的として利用できる可能性があるため、アミロイドの治療法にまで及びます。また、このin vitro法は、初期の宿主部位との相互作用におけるAnicaウイルス因子の関与について知見を提供します。さらに、in vivoでのハムスター、マウス、モルモットを用いた感染モデルや、ヒトの腸管生検などの他のシステムにも適用可能です。培養。

MDCK細胞を、5% 二酸化炭素、37 °C の条件下で、10 mL の補完済み DMEM 培地にて培養します。1 × 10⁵ 個の Entamoeba histolytica トロフォゾイトを、37 °C で 15 mL の TYIS 33 培地を用いて正しく増殖させます。トロフォゾイトを剥離させるため、チューブを氷水バスで 5 〜 10 分間冷却します。

次に、培養液を無菌的にコニカルチューブに移し、4 °Cで360 ×g、10分間遠心分離します。その後、上清を慎重にデカンテーションで除きます。ペレットに氷冷したPBSを加え、チューブを数回反転させて、遠心分離後の細胞を分散させます。

ヘモサイトメーターを用いてトロフォゾイト数を算出し、トロフォゾイトを溶解させます。液体窒素で1分間急冷し、4 °Cで融解させた後、激しくボルテックスします。次に、0.02% β-メルカプトエタノールを用いて、溶解液中に存在するプロテアーゼを活性化させます。9 × 10⁶ 個のトロフォゾイトを3 mLの氷冷PBSで希釈し、細胞を50 mLコニカルチューブに移します。

次に、分泌物を回収するため、tropho懸濁液を37 °Cのインキュベーター内で水平から5度傾けた状態で2時間静置し、チューブを360 ×gで10分間遠心分離します。使い捨ての滅菌シリンジを用いて、ペレット中のトロフォゾイトによるサンプルの汚染を避けながら、慎重に上清を回収してください。その後、混入した細胞を除去するため、上清を0.22 µmの酢酸セルロース膜でろ過します。

次に、免疫蛍光染色の培養に向けて、0.02% beta mercaptoethanolでプロテアーゼを活性化させます。24ウェルマルチウェル細胞培養ディッシュ内の滅菌済みガラスカバーのスリップ上にMDCK細胞を播種します。倒立顕微鏡で細胞を観察し、コンフルエンスが100%に達するまで待ちます。

1 mLの温めたPBSで希釈した、異なる条件のトロフォゾイトを添加します。PBSのみでE. histolyticaを含まないMDCK細胞のコントロール条件、および一次抗体によるインキュベーションを省略した、異なる条件のトロフォゾイトを加えたMDCK細胞のコントロール条件を含めます。培養プレートをインキュベーターに入れ、2分間または30分間インキュベートします。

次に、未結合の分子や栄養体を除去するため、上皮細胞を冷たいPBSで5回洗浄します。加湿チャンバー内で、1 mLの96%エタノールを用いて-20 °Cで数分間、細胞の固定と透過処理を行います。ウェルからカバーガラスを慎重に取り出します。

ろ紙を用いて縁から余分な液体を取り除き、細胞面を下にしてカバーガラスを0.5%BSAブロッキング溶液に浸します。サンプルを室温で1時間インキュベートします。その間に、PBSで一次抗体混合液を調製します。

カバーガラスをブロッキング液から取り出します。フィルターペーパーで余分な液体を拭き取ります。細胞を抗体溶液に移し、4 °Cで一晩インキュベートします。

未結合の分子を除去するため、1 mLのPBSで細胞を5回洗浄します。次に、2種類の蛍光二次抗体をPBSで混合して調製します。核染色を行うため、サンプルを二次抗体とともに室温・暗所で1時間インキュベートします。

0.05 millimolarのdappy溶液200 µLを用い、室温・暗所で3分間細胞をインキュベートします。次に、共インキュベーション実験において、共焦点顕微鏡を用いてZスタックセクションおよびXZ平面で調製物を解析します。プロテアーゼ阻害剤または特異的抗体を用いて、各実験条件をプロテアーゼ阻害剤またはモノクローナル抗体培養液とともに4 °Cで20分間インキュベートします。

滅菌済みのトランスウェル透過性サポートの上段コンパートメントにMDCK細胞を播種し、細胞懸濁液を100 µL分注し、下段コンパートメントにサプリメント添加DMEM培地を600 µL分注します。準備したトランスウェルフィルターを、倒立顕微鏡を備えたインキュベーター内に設置します。細胞が100%コンフルエントであることを確認してください。

各トランスウェルの上部コンパートメントから培地を回収してまとめ、この培地混合液を50 µL分取します。ここに50 µLのトロフォゾイト懸濁液またはPBSコントロールを添加します。次に、これらの混合液をMDCK細胞を含む各トランスウェルの上部チャンバーに移します。

STXの2本の電極をそれぞれのトランスウェルにすぐに浸し、経上皮電気抵抗を測定します。長い方の電極が下室の底部に接触し、短い方の電極が上室の培地に浸かっていることを確認してください。E histolyticaは指数増殖期の後半から定常期の初期に、適切な条件下で培養し、回収しました。

ここでは、密着結合および接着結合によって安定化された上皮細胞の細胞間接触を可視化するために、密着結合マーカーであるZO-1を使用しました。単クローン抗体を用いた免疫蛍光染色により、アメーバ由来複合体と上皮表面との相互作用を検討しました。栄養形、全ライセート、または分泌産物を上皮単層に適用した結果、複合体と密着結合の共局在が認められました。30分後には、細胞境界におけるZO-1染色の不連続化と、小胞への内部移行が認められました。

この破壊は、MDCK細胞とトロフォゾイトの接触部位において最も顕著でした。全細胞溶解物の共焦点レーザー顕微鏡観察では、病原性複合体が細胞間隙に向かって浸透していることが示されました。これは、破壊されたZO-1染色の寄生虫接触部位と共局在し、上皮バリア機能を破壊し、経上皮電気抵抗（TEER）の90%低下をもたらしました。

トロフォゾイトを複合体に対する抗体またはプロテアーゼ阻害剤で前インキュベーションしたところ、TERの低下が抑制されました。これらのデータは、E. histolyticaの浸潤において、この複合体のプロテアーゼ活性と接着特性の両方が重要な病原性因子であることを示唆しています。このビデオを視聴することで、E. histolyticaの病原性因子が感染初期にタイトジャンクションを開口させるメカニズムをどのように分析するかについて、十分に理解できるはずです。この分析を習得すれば、解析産物と細胞培養の準備が整っている場合、上皮損傷の解析を3時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、イオンの正確な相互作用時間を遵守することが重要です。本手順の完了後、*E. histolytica*の病原性因子と上皮タンパク質の間の潜在的な関連性など、さらなる疑問を解消するために、免疫沈降法などの他の手法を実施することができます。この技術は、アルサイド相互作用分野の研究者が、ハムスター、マウス、モルモット、およびヒト組織におけるAMSの病原性を探索するための道を開きました。