主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

この手順の全体的な目的は、MHCクラスIIデクスメリマーを用いて、高い特異性で自己反応性T細胞を検出することです。本ビデオでは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）誘導・実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスの脳から脳脊髄液を採取します。これは、まず慎重に組織を採取し、アロウブロックを準備することによって行われます。

第2ステップでは、ビブラトームを用いて、埋め込まれた組織を200 µmの厚さの切片に切断します。次に、これらの切片を24ウェルプレート内の組織チャンバーに移し、染色および固定を行います。最後のステップは、組織切片を顕微鏡スライドにマウントすることです。

最終的に, 共焦点顕微鏡を用いて, dexトリマーおよびCD4抗体に結合した細胞を示します。私たちは, MHCクラスII dextro ERsが, 抗原特異的な自己反応性CD4 T細胞の検出において, 従来のMHCクラスIIテトラマーよりも感度が高いことを初めて示した際に, このアイデアを考案しました。一般的に, この手法に不慣れな方は, 新鮮組織の切片作成およびその取り扱いが非常に困難であるため, 苦労することになるでしょう。

切片作成、マウンティング、および解析のステップは非常に繊細で習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。私のグループの博士研究員であるChandy氏とAaron氏、およびDr. Zoeの研究室のChristian氏が、この手順を実演します。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）マウスを安楽死させた後、曲がった鋏を用いて頭蓋骨を円形に切り出し、ピンセットで慎重に頭蓋骨を反転させて除去します。清潔なメスを用いて鈍的に剥離し、脳を採取します。

小脳からrerumを分離します。rerumを冷やした1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含むチューブに入れ、処理まで氷上で保持します。その後、rerumを氷上の使い捨て深底型組織用カセットに配置します。

次に、溶融した4% PBS緩衝低融点アガロースをカセットに注ぎます。直ちにピンセットで大脳を軽く押し下げて組織を完全に浸し、凝固が完了するまでカセットを氷上に置いておきます。凝固後、包埋した組織の周囲から余分なアガロースを取り除き、大脳の腹側表面がわずかに露出するように整えます。

次に、Vibram組織ブロックにシアノアクリレート系接着剤を塗布し、横断切片を作成するため、aros埋込組織の露出した腹側表面を接着剤が塗布された面に接するように転写します。組織をブロック上に固定した後は、動かさないでください。aros埋込組織を固定したVibram組織ブロックを氷上に置き、接着剤を15分間乾燥させます。

その間に、準備した組織チャンバーを24ウェルプレートに1ウェルにつき1チャンバーずつ配置します。組織チャンバーが入ったウェルに、冷えた1 XPBSを1 mL注入し、プレートを氷上に置いたままにします。接着剤が乾いたら、バイブラムブレードを組織の上面の高さまで下げます。

Vibramの速度を0.22 millimeters per secondに設定し、前方への動きでセクショニングを開始して、厚さ200 micrometerの切片を作成します。水彩用のソフトブラシを使用して、脳切片を各組織チャンバーに1枚ずつ移します。組織の分解を防ぐため、セクショニングが完了するまで24ウェルプレートを氷上に置いて保持してください。

次に、もう1枚の24ウェルプレートを用意し、3つのウェルにS myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextroおよびCD4抗体を含むカクテル液を300 µLずつ添加します。続いて、別の3つのウェルに、コントロールであるS Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextroおよびCD4抗体のカクテル液を300 µLずつ添加します。その後、各ウェルにラベルを貼ります。

次に、特異的dexトリマーで染色する予定の切片が入った3つの組織チャンバーを、24ウェルプレートの指定された3つのウェルに、1ウェルにつき1チャンバーずつ移します。同様に、対照群のdexストリーマーで染色する予定の切片が入った3つの組織チャンバーを、それぞれのウェルに移します。1ウェルに1チャンバーずつ配置した状態で、プレートに蓋をします。

プレートをアルミホイルで包み、室温・暗所で緩やかな回転に設定したロッキングプラットフォーム上に1.5時間置きます。インキュベーション後、組織切片を1 mLの冷たい1 XPBS洗浄液を含む新しいウェルに移し、ロッキングプラットフォーム上で少なくとも10分間洗浄します。この洗浄操作を計3回繰り返します。

組織切片が乾燥するとチャンバーの側壁に付着する可能性があるため、乾燥させないように注意してください。組織チャンバーを新しいウェルに転送して切片を固定します。ろ過済みの4% PBS緩衝パラホルムアルデヒド 1 mLを含む24ウェルプレートに入れ、ロッキングプラットフォーム上で緩やかに回転させながら2時間インキュベートします。

切片をさらに3回洗浄した後、染色および固定済みの切片を清潔な顕微鏡用スライドガラス上に載せます。水彩用の柔らかい筆を使用して、切片に触れないように余分な水分を拭き取り、封入剤を用いて切片を封入します。顕微鏡用カバーガラスで覆い、スライドガラスを室温で一晩乾燥させます。

暗室にて、日常的なスキャニングおよび画像取得にはNikon A1 Eclipse 90i共焦点顕微鏡システムを使用します。まずNIS-Elements ARソフトウェアを起動し、パネルからテトラエチルルミジンイソチオシアネート（TRITC）およびCyan5またはCy5チャネルを選択します。TRITCおよびCy5チャネルの励起・蛍光波長はデフォルトで表示されます。

Trit Seaチャネルに擬似カラーの緑を、SCI fiveチャネルに赤を割り当てます。観察するスライドを顕微鏡ステージに設置し、100倍の倍率で手動でピントを合わせます。HVを10に、オフセットを0に設定し、フォーカスをクリックして電圧を調整します。

レーザーを最適化するため、フォーカススキャンを用いて切片を上から下まで走査し、画像取得のためのZレベルを設定します。次に、CHシリーズをクリックし、順次画像を撮影します。赤色および緑色の両チャンネルから生成されたシグナルの共局在に基づき、黄色の点状の細胞として現れるdextroまたは陽性CD4陽性T細胞を同定します。

Dextro陽性またはCD4陽性T細胞を容易に定量的に計数するために、Olympus FV 500 BX 60共焦点顕微鏡を使用します。まず、flu ovuソフトウェアを起動します。ドロップダウンメニューから染料のS SI 3およびSCI 5を選択し、「apply」をクリックしてそれぞれのレーザーをロードします。

観察するスライドを顕微鏡ステージに設置し、SI 3レーザーをオンにした状態で、低倍率でのクリックフォーカスを用いて手動でピントを合わせ、炎症部位にフォーカスを合わせます。対物レンズを100倍に変更します。ドロップダウンメニューからファイルサイズを512×512に設定し、クリックフォーカスを行い、SI 3とSI 5のレーザーを個別に最適化するためにPMTゲインとオフセットの値を調整します。Zステージをクリックし、両方のレーザーがオンの状態でフォーカスをクリックします。

上下の矢印をクリックして、Zステージの厚さを設定します。Z間隔を2 µmに設定します。[Stop]をクリックし、選択します。

1、2、3を探索します。次にX、y、Zをクリックし、炎症 foci 内の選択領域についてZシリーズ画像の取得を開始し、Z連続画像をVIファイルとして保存します。画像ファイルを保存するには、Z連続画像から画像を選択し、TIFF形式で保存してください。

マルチTIFF形式で常に画像を保存してください。まずデータを保護し、次に、2組のdexトリマーで染色された3枚のペア切片を検討します。まず、同一焦点内でのZシリーズの重複を避けるため、スライドを水平・垂直・上・水平・垂直・下の順に動かしてスキャンし、Z系列画像を取得します。

Zスタック画像を撮影した後、スライド番号、切片名、および撮影したZスタック画像の番号を明記してファイルに名前を付けます。ImageJソフトウェアを使用して、CD4陽性T細胞の総数に対するdextro陽性CD4陽性T細胞の数をカウントします。ImageJでカウンターの種類を選択し、「Show All」にチェックを入れ、各細胞の中心をクリックしてカウントを開始します。サイド矢印を使用して、異なるZスタック画像へと移動しながらカウントを継続してください。

すべてのCD4 T細胞を計数した後、別のカウンターを選択し、デクストラン陽性のCD4陽性T細胞を計数します。結果タブをクリックして、2つの異なるカウンターで計数された細胞の総数を確認します。髄鞘プロテオリピドタンパク質（PLP）特異的CD4 T細胞の検出は、EAEマウス由来の新鮮な脳切片を用い、抗CD4抗体およびPLP 139-151デクストラン、またはコントロールのTMEV 70-86デクストランを含むカクテルで染色し、LSCMを用いて行いました。

脳切片の共染色解析の結果、赤色でPLP 1 39 to 1 51 dexトリマー陽性細胞が、緑色でCD4抗体陽性細胞が示され、二重陽性細胞は黄色として認められた。共染色された細胞では、周辺部に点状のドットが観察された。このような特徴は、コントロールのTMEV 70 to 86で染色した切片では認められなかった。

心筋ミオシン特異的なCD4 T細胞を検出するため、心筋ミオシン重鎖α3 34-352 デクステリマーを用いたin situ染色も実施した。これらの画像をLSCMで解析した結果、MYHC 3 34-352 デクステリマー陽性細胞が赤色に、CD4陽性細胞が緑色に、そしてデクステリマーとCD4の両方に結合した細胞が黄色の点状細胞として観察された。コントロールRNA 43-56 デクステリマーによる背景染色は無視できる程度であった。適切に実施すれば、本手法は他の既報のプロトコルの3日間に対し、約8〜10時間で完了させることができる。

この手順を実施する際は、あらかじめ試薬を準備し、各ステップを体系的に進めることが重要です。このビデオを視聴することで、標的組織におけるC-reactive CD4 T細胞を計数するための組織切片作成および染色の方法について、十分に理解できるはずです。