Name: 主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶMHCクラスIIデクストラマーを用いた脳および心臓における自己反応性CD4 T細胞のその場検出法。この方法は抗原特異的T細胞頻度の包括的解析を可能にし、自己免疫疾患の理解に貢献します。

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この作品は、アメリカ心臓協会と子供の心筋症財団（SDG2462390204001）、および国立衛生研究所（HL114669）によってサポートされていました。 CMは心筋炎財団、ニュージャージー州によって授与ポスドク研究フェローシップ助成金の受取人である。

倫理声明： 全ての動物手順は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに沿って行われ、ネブラスカ大学リンカーン、リンカーン、ネブラスカ大学によって承認された。 EAEの1。誘導<ol><li> 工程1.1：EAEを誘導するために、以下の改変を伴う11に記載のようにペプチド/完全フロイントアジュバント（CFA）エマルジ ​​ョンを調製する。1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中1 mg / mlの濃度でPLP 139-151を調製するステップ1.4：動物1匹当たりのPLP 139-151100μgのを含むCFA乳化液200μlを使用する1.4.1ステップ ：10動物を免疫するために、PLP 139-151の1ミリリットル1Xにおける（1 mg / mlのを混合することにより、エマルジ ​​ョンの2ミリリットルを用意。PBS）とCFAを等量の1.5ステップ ：2鼠径領域（〜75μLずつ）と5対6週齢の胸骨領域（〜50μL）に皮下分割用量でエマルジ ​​ョン200μlのを注入FEMAルSJL / Jマウス。 1.7と1.8は、EAEの誘導には適用されません繰り返します。 </li></ol> EAEマウスと大脳の収穫の2。臨床スコアリング<ol><li>臨床徴候の出現のために動物を監視し、次のように9日目免疫後から毎日疾患の重症度をスコア：0 - 健康的な; 1 - 尾または後肢の脱力両方ではなくぐったり。 2 - 尾と後肢の脱力ぐったり。 3 - 後肢の部分的な麻痺; 4 - 後肢の完全な麻痺; 5 -瀕死または死んだ12。 </li><li>それらはCO 2を用いて、3又は4の神経学的スコアに達したときにマウスを安楽死させる。マウスを安楽死させるべきではない6 PSIを超えるCO 2タンクのレギュレーターを回すことで、CO 2を最初に安楽死室を事前に記入し、動物が完全に窒息を達成するために約5分間、チャンバ内に滞在することができます。 70％アルコールで安楽死させた動物を浸す。すぐに、吸収パッド上に動物を配置し、無菌のペアを使用してCEPSとハサミは胸腔を通して切断することによって心を公開します。右心耳を穿刺し、心の左心室に冷たい1×PBSを10ミリリットルを注入することにより灌流。 </li><li>湾曲したハサミを使用して循環的に頭蓋骨を切り取ることで頭蓋骨を掘削し、慎重に、鉗子で頭蓋骨を反転。鈍的切開によって脳を収穫し、小脳からのきれいなメスで、別々の大脳を使用。冷たい1X PBSを含む試験管に大脳を配置して処理するまで氷上にチューブを残す。 </li></ol> 3。MHCクラスII（IA S）/ PLP 139-151 Dextramersと脳切片のその場染色 <ol><li> 50°Cに加熱して溶融し、使用するまで40℃の水浴に入れたまま、4％PBS緩衝低融点アガロースを調製する。 </li><li>使い捨ての深いベースモールドの組織学カセットに大脳を置き氷の上に保たれ、溶融した（40℃）、アガロースを注ぐ。すぐに、優しく大脳を押してください鉗子は、組織を沈めるようにして。凝固が完了するまで15〜20分間、氷上でのカセットのままにしておきます。 </li><li>チルド1X PBSでビブラトーム槽を埋める。 0と2の間のPBSの温度を維持するために氷浴でビブラトームの周りの空間を充填 ℃、ビブラにきれいなカミソリの刃を固定し、15℃にブレード角度を設定。 </li><li>ビブラトーム内の組織の配置。包埋組織のすべての側面からの過剰なアガロースをトリミングして、わずかに大脳の腹側表面を露出。 <ol><li>スーパー接着剤でビブラ組織ブロックを塗抹し、横方向切片化のための接着剤を介して大脳の露出腹面を配置することにより、接着表面にアガロース包埋組織を移す。組織がブロックの上に設定されると、組織を移動しないでください。 </li><li>氷上アガロース包埋組織を含むビブラトームブロックを置き、接着剤が15分間乾燥させます。 </li></ol></li><li>一方、組織を配置チャム24ウェルプレートのウェルごとに1つのBER。冷たい1X 1mlのPBSで組織チャンバーを含むウェルを記入し、氷の上にプレートを残す。 <ol><li>薄いナイロンスーパー接着剤を用いて、25 mlのポリプロピレンピペットのカット最後にメッシュを取り付けることにより、組織の室を準備し;ピペットの周りに余分なメッシュをトリミングした後、メッシュから1cmの長さにピペットを切る。 </li></ol></li><li>組織の上面のレベルまでビブラトームブレードを低下; 0.22ミリメートル/秒にビブラトーム速度を設定し、200μmの厚さの切片を作るために前進して切片を開始。 24ウェルプレートのウェル内に配置された組織室内に水彩柔らかいブラシを使用してごとに1つの脳のセクションを転送します。切片は、組織の劣化を防止するために、完了するまで氷上にプレートを保管してください。注意：腹面に脳の背側の3種々の領域（ 図2）から、合計、3ペアのセクションで入手する手順は、次のとおりです。から1つのセクション3個々の組織チャンバー内に配置、各ペア（計3つのセクション）は、特定のdextramers（IA S / PLP 139-151）および抗CD4で染色するために指定されています。同様に、3つの個別の組織チャンバ内に配置された3つのセクションの別のセットは、制御dextramers（IA 秒 / TMEV 70-86）および抗CD4で染色するために指定されている。 </li><li> 、中のウェルあたり1室と24ウェルプレートの3ウェルに特定dextramersで染色するための指定区間を含む3組織チャンバーを転送コシアニンを含むカクテルを300μl（APC）結合PLP 139-151 dextramers（2.5 μg/ ml）を、および抗CD4-フィコエリトリン（PE、2％正常ヤギ血清、5μg/ ml）をブロッキング溶液中で（1×PBS）を予め加えた。ウェルに蓋をして。 </li><li>同様に、我々ごとに1つのチャンバーを24ウェルプレート中の3つのウェルに制御dextramersでの染色のために指定されたセクションを含む3つの組織チャンバーを転送するLLここで、APC結合TMEV 70から86 dextramers（2.5μg/ ml）をし、ブロッキング溶液中の抗CD4-PE（5μg/ mlの）を含むカクテル300μlのは、以前に追加されました。ウェルに蓋をして。注：。、Massilamanyらを参照してくださいdextramersの製造のための8、およびdextramersを準備するデキストラン分子が親切にImmudex、コペンハーゲン、デンマークから提供された。 </li><li>井戸にラベルを付けて、アルミホイルでプレートをラップし、室温で暗所に1.5時間、穏やかな回転に設定ロッキングプラットフォーム上でプレートを置き。 </li><li>インキュベーション期間の後、ウェルの冷1×PBS 1 mlを含む新鮮な、組織チャンバを転送することによって、ロッキングプラットフォーム上で組織切片を洗浄し、そして他に一方の内容をドリブル避ける。洗浄あたり少なくとも10分を許可する、三度洗濯を繰り返してください。彼らは、チャンバの側面に固執することができますように組織切片を乾燥されないように確認してください。 </li><li>組織チャムを転送することにより、セクションを修正穏やかな回転に2時間ロッキングプラットフォーム上で濾過4％のPBS-緩衝パラホルムアルデヒド液（pH7.4）の1ミリリットルを含む24ウェルプレート内の新鮮なウェルにBERが。 </li><li>ステップ3.10で説明したように三度の洗浄を繰り返します。 </li><li>水彩柔らかいブラシを使用して清潔な顕微鏡スライドガラスに染色し、固定部を配置します。セクションに触れることなく余分な水分を拭いて、封入剤を使用してセクションをマウントします。微細なカバーガラスで覆い、スライドを暗い部屋でのRTのO / Nで乾燥させます。 </li><li> 4℃で、遮光性のスライド収納ボックス内のスライドを保存する</li></ol> EAMと心のコレクション4。誘導<ol><li>参照文献11に記載されるようにEAMを誘導する。 </li><li> CO 2ガスボンベを取り付けた清浄室を使用して、免疫後21日目にマウスを安楽死させると、70％アルコールで動物を浸す。すぐに、吸収パッド上で動物を配置し、鉗子やハサミを使用して心臓を露出胸腔を切断することによってS。右心耳を穿刺し、心の左心室に冷たい1×PBSを10ミリリットルを注入することにより灌流。冷たい1X PBSを含む試験管内の心と場所を収集します。 </li></ol> 5。MHCクラスII（IA K）/ MyHCの334から352 Dextramersと心臓切片のその場染色 <ol><li>準備4％低融点アガロース、50℃に加熱して溶融し、40でそれを残して、PBS緩衝化&#160;使用するまで、Cの水浴を°。 </li><li>使い捨ての深いベースモールドの組織学カセットに心を置き、氷上に維持し、ステップ3.2で説明したように、組織が完全に水没するまで溶融40℃でアガロースを注ぐ。 </li><li>ステップ3.3に従ってください。 </li><li>包埋組織のすべての側面からの過剰なアガロースをトリミングして、わずかに心の底を公開します。スーパー接着剤でビブラ組織ブロックを塗抹しの露出面を配置することにより、接着表面上アガロース包埋組織を転送のりの上の心。組織がブロックの上に設定されると、組織を移動しないでください。 <ol><li>氷上アガロース包埋組織を含むビブラトームブロックを置き、接着剤が15分間乾燥させます。 </li></ol></li><li>ステップ3.5および3.6に従ってください。 </li><li> 24ウェルプレートのウェル内に配置された組織チャンバー内に水彩柔らかいブラシを使用して、心臓切片を転送する。切片は、組織の劣化を防ぐために完了するまで氷上にプレートを保管してください。注：心の底（ 図2）に頂点から合計8ペアのセクションで入手する手順は、次のとおりです。室あたりの3の項までの割り当て、組織チャンバー内のすべてのセクションを配置します。 （合計8つのセクション内の）各ペアから1つのセクションは、特定のdextramers（I-A K / MyHCの334から352）および抗CD4で染色するために指定されている。同様に、8つのセクションの別のセットは、制御dextramers（IA k個 / RNアーゼ43-56）および抗CD4で染色するために指定される。 </li><li>転送中のウェルあたり1室で、24ウェルプレートの3ウェルに特定dextramersで染色するための指定区間を含む3組織チャンバー、APC結合MyHCの334から352 dextramers（2.5μg/ mlの）を含むカクテルを300μlとブロッキング溶液中の抗CD4-PE（5μg/ mlの）を予め加えた。ウェルに蓋をして。 <ol><li>同様に、1ウェルあたり1室、APC結合アーゼを43-56 dextramers（2.5μgのを含むカクテル300μlで24ウェルプレートの3ウェルに制御dextramersでの染色のために指定セクションを含む3組織チャンバーを転送/ ml）および抗CD4-PE（5μg/ ml）をブロッキング溶液中に予め添加した。ウェルに蓋をして。 </li></ol></li><li>井戸にラベルを付けて、アルミホイルでプレートをラップし、室温で暗所に1.5時間、穏やかな回転に設定ロッキングプラットフォーム上でプレートを置き。 </li><li> 3.10から3.11、手順に従ってください</li><li>繰り返し洗濯THRステップ3.10で説明したように氷。 </li><li>水彩柔らかいブラシを使用して清潔な顕微鏡スライドガラスに染色し、固定部（最大3つのセクション/スライド）を配置します。のセクションに触れることなく余分な水分を拭いて、封入剤を使用してセクションをマウントします。微細なカバーガラスで覆い、スライドを暗い部屋でのRTのO / Nで乾燥させます。 </li><li> 4で光防スライド収納ボックスでスライドを保存する ℃、 </li></ol> 6。Dextramer +の解析（脳と心臓切片の両方に共通）レーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）によって（DEXT +）CD4 + T細胞<ol><li>ルーチンスキャンおよび画像の取得のためのニコンA1〜エクリプス90I共焦点顕微鏡システムを使用してください。開始するには、オープン、NISの要素ARソフトウェア（バージョン4.13）をクリックします。 <ol><li> 「TRITC」パネルから「Cy5の「チャンネルを選択してください。 TRITCおよびCy5のチャネルのそれぞれの励起/発光波長、561.5ナノメートル/ 553から618 nmおよび640.7 nmの/ 663から738 nmのデフォルトで表示されます。 </li><li>それぞれ、TRITC（CD4-PE）のための「緑」と「赤」擬似カラーおよびCy5（dextramer-APC）チャネルを割り当てる。 </li><li>微視的ステージに検査されるスライドを置き、100倍の倍率で、手動で焦点を当てています。 110に「HV」に設定し、「0」へのオフセット。 「フォーカス」をクリックして、レーザーを最適化するために、「電圧」を調整してください。 </li><li> 「フォーカス」をクリックします。上から下にセクションをスキャンし、画像取得のための &#39;Z&#39;レベルを設定します。 「CHシリーズ」をクリックし、画像を順次取得する。 DEXTを識別+ CD4 + T細胞は、赤色（dextramers）および緑色（CD4）チャネルの両方から発生するシグナルの共局在化に基づいて、黄色斑点状細胞に現れる。 </li></ol></li><li> DEXT + CD4 + T細胞の容易な定量的な計数のためにオリンパスFV500-BX60共焦点顕微鏡を使用してください。開始するにはオープンをクリックし、FLUOVIEWソフトウェア（バージョン4.3）。 <ol><li>ドロップダウンメニューから染料」のCy3」と「Cy5の」を選択し、各レーザをロードするために、「適用」をクリックします。 （543ナノメートル/疑似カラー「グリーン」、CD4-PE）のCy3の励起/発光波長およびCy5（633 NM /疑似カラー &quot;赤&quot;; dextramer-APC）チャンネル：注意してください。 </li><li>顕微鏡スライドガラス上で検査されるスライドを置き、低倍率（4倍または10倍）の下で、手動で焦点を当てています。 Cy3のレーザーがオンになっている間は「フォーカス」をクリックして、炎症フォーカスを当てる。 </li><li> 100X倍率に目標を変更します。ドロップダウンメニューから「512分の512」に、ファイルサイズを設定します。 「フォーカス」をクリックして、「PMT」、「ゲイン」の値を調整し、Cy3およびCy5で別々にレーザーを最適化するためのパラメータを「オフセット」。 </li><li> 「Zステージ」をクリックして、レーザーの両方がオンになっている間「フォーカス」をクリックしてください。セット「アップ」および「ダウン」矢印をクリックして、「Zステージ」の厚さ。 2μmの「Z」の間隔を設定します。 </li><li> 「停止」をクリックし、「Seq123 &quot;を選択します。その後、「XYZ」をクリックして、炎症焦点内の選択されたエリアに対して「Z」シリーズの画像の取得を開始。 AVIファイルなどの「Z連続画像」を保存します。画像ファイルを保存する「Zシリアル画像」から画像を選択して、「TIFF」形式として保存します。 </li></ol></li><li>三つのセクションの1セットが実行するために、IA S / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4およびIA S / TMEV 70から86 dextramers/anti-CD4と3節で、他の組で染色した大脳から3ペアのセクションを調べて、定量分析。 <ol><li>同様に、ここで、8つのセクションの1セットは、IA K / MyHCの334から352 dextramers/anti-CD4し、別のSEで染色し、心臓に8ペアのセクションを分析アーゼ43-56 dextramers/anti-CD4と8つのセクションのトン。 </li></ol></li><li>大脳内のセクションごとに10から15の炎症性病巣を調べ、それぞれの焦点で、15から25連続画像を順次セットを取得する。 <ol><li>心のすべての8つのセクションから、各焦点から20の炎症性病巣の合計を調べるには、順次10から15連続画像を取得する。同じ焦点内「Z」シリーズの繰り返しが回避されるように、「水平 - 垂直アップ水平 - 垂直ダウン」の動きでスライドをスキャンすることによって、「Z」のシリアル画像を撮影する。 </li><li> 「Z」のシリアル画像が取り込まれると、スライド番号、セクション名、および撮影「Z」のシリアル画像の数を特定することにより、ファイルに名前を付けます。 <ol><li> CD4 + T細胞の総数に対するDEXT + CD4 + T細胞を計数する「ImageJの「ソフトウェアを使用。 ImageJの「中」のカウンタの種類」を選択し、確認してください＆＃8216;すべてを表示」し、各セルの中心をクリックして、カウントを開始し、別の中で数え続ける &#39;側の矢印を使用して、Z&#39;連続画像。すべてのCD4 T細胞をカウントした後、カウンターの別のタイプを選択し、+ T細胞、CD4 + DEXTを数える。 2異なるカウンタで計数した細胞の総数を取得するには、[結果]タブをクリックします。 </li><li>合計数を取得するには、3つすべての脳のセクション、またはすべての8心臓切片を表すすべての「Z」のシリアル画像内のセルの数を追加します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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利害の競合が宣言されなかった。

MHCクラスIテトラマーとは違って、日常的なアプリケーションのためのMHCクラスII四量体の使用は、特にそれらの活性化の依存関係6,15-17に一部起因低親和性自己反応性CD4 T細胞の前駆体頻度を列挙するために、挑戦的であり続けている。最近では、この問題は、PLP 139-151、MOG 35〜55およびMyHCの334などの自己抗原の数の抗原特異的CD4 T細胞を検出するために、私達を許可する」、dextramers」と呼ばれる、四量体の次の世代を作成することによって回避されました - 352 8。本報告では、初めて、 その場で自己反応性CD4 T細胞を検出及び定量するためのMHCクラスII dextramersの有用性は、EAEマウス由来の脳切片、及びEAMマウスからの心臓切片を用いて実証されている。反応に基づいて、dextramersはMHC /ペプチド複合体の少量を必要とするという利点を提供する。このプロトコルでは、各反応は、0.75μgのMHC /ペプチドモノマーのを必要とする。また、STAdextramersとiningはdextramers抗CD4と共インキ...

抗原特異的CD4 T細胞の検出のための主要組織適合性複合体（MHC）クラスII四量体を使用することは挑戦であった1-7。 MHCクラスII四量体の検出感度を高めるために、研究チームは、次世代のテトラマー、指定された「dextramers「8を作成した。 Dextramersは、複数のストレプトアビジン-フルオロフォア部分は、いくつかのペプチドテザー、ビオチン化MHCモノマー一つデキストラン分子9に取り付けることができるようにコンジュゲートしたデキストラン骨格を含有する。このように、いくつかのMHC-ペプチド複合体が含まれているのMHC dextramersの大きな集合体は、複数のT細胞受容体（TCR）と対話することができます。 このグループは、最近、様々な自己抗原に対するdextramersを生成し、dextramersの検出感度は、約8四量よりも5倍であることを示した。実験システムは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAを含むE）、プロテオリピドタンパク質（PLP）SJLマウスにおける139-151で誘導し; C57BL / 6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）35-55を用いて誘導EAE;心臓ミオシン重鎖α（MyHCの）A / Jマウスにおける334から352で誘導し、実験的自己免疫性心筋炎（EAM）。この研究は、PLP 139-151の使用を示す- 、それによってフルオロフォア抗体を用いからの信号を増幅する必要がなくなり、直接染色プロトコルを開発することにより、特異性を有するその場で抗原特異的CD4 T細胞を検出するためのMyHCの334から352 dextramers、アプローチは、一般的に四量体の使用に採用。また、組織を包括的に評価する方法はまた、確実にその場 10 における抗原特異的CD4 T細胞の頻度を列挙するために考案されている。 その場での抗原特異的T細胞の検出は、バイスタンダー活性化によって引き起こされるものから、特定の抗原刺激によって引き起こされる事象の描写を可能にする。同様に、 その場での技術ではまた、提供します：標的器官における抗原特異的T細胞の浸潤の動態を追跡する機会エス。

<table><tbody><tr><td>CFA</td><td>シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ</td>州<td>5881</td>ストア<td>4&#176;C</td></tr><tr><td>MTB&nbsp;H37Rv抜粋&nbsp;</td><td>Difco Laboratories、デトロイト、ミシガン州</td><td>231141</td><td>4 &#176 でストア。C</td></tr><tr><td>PT</td><td>リスト生物製剤研究所、キャンベル、カリフォルニア州</td><td>181</td>ストア<td>4&#176;C</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>コーニング、マナッサス、バージニア</td>州<td>21-040-CV</td><td>ストア4&#176;C</td></tr><tr><td>雌型A/Jマウス&nbsp;</td><td>ジャクソンラボラトリーズ、バーハーバー、ME</td><td>646</td><td></td></tr><tr><td>メス SJL/J マウス</td><td>ジャクソンラボラトリーズ、バーハーバー、ME</td><td>686</td><td></td></tr><tr><td>Leur-lok 滅菌 1 ml シリンジ</td><td>BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Leur-lok 滅菌 3 ml シリンジ</td><td>BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州 <td>309657</td><td></td></tr><tr><td>滅菌針、18 G</td><td>BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>滅菌針、27 1/2 G</td><td>BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td><td>州305109</td><td></td></tr><tr><td>3方向活栓&nbsp;</td><td>Smiths Medical ASD, Inc. オハイオ州ダブリン</td><td>MX5311L</td><td></td></tr><tr><td>Kerlixガーゼ包帯ロール&nbsp;</td><td>Covidien、マンスフィールド、マサチューセッツ</td>州 <td>6720</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional、ロズウェル、ジョージア</td><td>州 34155</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、低融点、分析グレード</td><td>Promega corporation、ウィスコンシン州マディソン</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>免疫純度の正常なヤギ血清</td><td>Thermo Scientific、Waltham、MA</td><td>31873</td><td>-20 &#176 で保存。</td></tr><tr><td>C Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td><td>eBioscience, San Diego, CA&nbsp;</td><td>12004185</td><td>4 &#176 でストア。C</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア</td><td>州 19202</td><td>4 &#176;C</td></tr><tr><td>Faramount 水性マウンティング メディウム</td><td>Dako, Carpinteria, CA</td><td>10073021</td><td></td></tr><tr><td>コニカル チューブ (15 ml)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>コニカル チューブ (50 ml)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル平底組織培養プレート</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>356775</td><td></td></tr><tr><td>水彩 #2 ブラシ</td><td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td><td>73502</td><td></td></tr><tr><td>Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>1255010</td><td></td></tr><tr><td>Premium Cover glass, 22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Disposable deep base mold histology cassettes</td><td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td><td>M-475-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 瞬間接着剤</td><td>ヘンケルコーポレーション、ウェストレイク、オハイオ州</td><td>1471879</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>ジレットスーパー</td>シルバーMyhc-A <td></td><td></td></tr><tr><td>334-352(DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td><td>ネオペプチド、ケンブリッジ、マサチューセッツ</td><td></td>州<td>4&#176で店舗。C</td></tr><tr><td>PLP 139-151(HSLGKWLGHPDKF)</td><td>Neopeptide、ケンブリッジ、マサチューセッツ州</td><td></td><td>4&#176で保存。C</td></tr><tr><td>MHCクラスII / IA<s>PLP 139-151またはTMEV 70-86デキストラマーは、APC染料</td><td></td><td></td>と結合し、<td>4&#176で保管します。C</td></tr><tr><td>MHCクラスII / IAkMyhc 334-352または&nbsp;またはRNase 40-56デキストラマーは、APC染料</td><td></td><td></td>と結合し、<td>4&#176で保管します。C</td></tr><tr><td>DextranはSA-APC</td><td>Immundex、コペンハーゲン、4</td> &#176でDemark <td></td> Storeを結合しました<td>。C</td></tr><tr><td>滅菌手術用ハサミと鉗子</td><td>INOX tool Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro oven</td><td>GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica VT 1200 Vibratome</td><td>Leica Microsystems, Inc. イリノイ州</td><td></td><td></td>バッファローグローブ</tr><tr><td>Olympus BX 60&nbsp;レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Olympus America, Inc. ペンシルベニア</td><td></td><td></td>州センターバレー</tr><tr><td>Nikon A1-Eclipse 90i 共焦点顕微鏡</td><td>Nikon Inc. ニューヨーク</td><td></td><td></td>州メルビル</tr></tbody></table>

主要組織適合遺伝子複合体クラスii dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性cd4 t細胞のその場検出に

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

この報告は、SJLマウスにおけるミエリンタンパク質タンパク質(PLP)139-151誘発実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)およびA/Jマウスにおける心筋ミオシン重鎖α(Myhc)334-352誘発実験的自己免疫性心筋炎(EAM)における自己反応性CD4 T細胞in situの検出のための主要な組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIIデキストラマーの使用を示しています。 デキストラマー試薬の2セットのカクテルを使用し、デキストラマー+細胞をレーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で分析しました:EAE、IAs / PLP 139-151デキストラマー(特異的)/抗CD4およびIAs / Theilerマウス脳脊髄炎ウイルス(TMEV)70-86デキストラマー(コントロール)/抗CD4;およびEAM、IAk/Myhc 334-352デキストラマー/抗CD4およびIAk/ウシリボヌクレアーゼ(RNase)43-56デキストラマー(コントロール)/抗CD4。EAEマウスから得られた脳切片のLSCM分析では、CD4およびPLP 139-151デキストラマーに陽性の細胞の存在が示されましたが、TMEV 70-86デキストラマーには陽性ではありませんでした。 同様に、EAMマウスから調製した心臓切片もMyhc 334-352の存在を明らかにしましたが、予想されたRNase 43-56-デキストラマー+細胞の存在は明らかではありませんでした。 さらに、「Z」シリアル画像中の抗原特異的CD4 T細胞の頻度を定量的に解析するための包括的な方法も考案されました。

本報告書では、MHCクラスII dextramersとの直接染色による抗原特異的、自己反応性CD4 T細胞のin situ検出に記述されている。新たに切断した脳のセクションでは、EAEマウス由来し、PLP 139-151（特定）またはTMEV 70から86（コントロール）dextramersおよび抗CD4を含むカクテルで染色した。 図1のトップパネルは、二重陽性細胞が出現し、黄色のPLP 139-151 dextramers（赤）とCD4抗体（緑）で同時染色脳切片のLSCM分析を示す。このような特徴はTMEV 70から86（コントロール）dextramers（下パネル）で染色した切片には存在しなかった。共染色（DEXT + CD4 +）細胞が周囲に点状のドットを示した。脳切片におけるPLP特異的T細胞の定量分析は、以下のステップ（ 図2）関与する：1）三組の切片を作製し、各対からの1つのセクションは、抗CD4およびPLP 139から15で個別に染色した1 dextramers。同様に、三つのセクションの別のセ...

主要組織適合性複合体クラスII dextramersとの直接染色により脳及び心臓における自己反応性CD4 T細胞を検出するためのプロトコルは、このレポートに記載されている。総合的な分析のために、 その場での抗原特異的CD4 + T細胞の頻度を列挙するための信頼できる方法も考案されている。

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

この手順の全体的な目的は、MHCクラスIIデクスメリマーを用いて、高い特異性で自己反応性T細胞を検出することです。本ビデオでは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）誘導・実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスの脳から脳脊髄液を採取します。これは、まず慎重に組織を採取し、アロウブロックを準備することによって行われます。第2ステップでは、ビブラトームを用いて、埋め込まれた組織を200 µmの厚さの切片に切断します。次に、これらの切片を24ウェルプレート内の組織チャンバーに移し、染色および固定を行います。最後のステップは、組織切片を顕微鏡スライドにマウントすることです。最終的に, 共焦点顕微鏡を用いて, dexトリマーおよびCD4抗体に結合した細胞を示します。私たちは, MHCクラスII dextro ERsが, 抗原特異的な自己反応性CD4 T細胞の検出において, 従来のMHCクラスIIテトラマーよりも感度が高いことを初めて示した際に, このアイデアを考案しました。一般的に, この手法に不慣れな方は, 新鮮組織の切片作成およびその取り扱いが非常に困難であるため, 苦労することになるでしょう。切片作成、マウンティング、および解析のステップは非常に繊細で習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。私のグループの博士研究員であるChandy氏とAaron氏、およびDr. Zoeの研究室のChristian氏が、この手順を実演します。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）マウスを安楽死させた後、曲がった鋏を用いて頭蓋骨を円形に切り出し、ピンセットで慎重に頭蓋骨を反転させて除去します。清潔なメスを用いて鈍的に剥離し、脳を採取します。小脳からrerumを分離します。rerumを冷やした1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含むチューブに入れ、処理まで氷上で保持します。その後、rerumを氷上の使い捨て深底型組織用カセットに配置します。次に、溶融した4% PBS緩衝低融点アガロースをカセットに注ぎます。直ちにピンセットで大脳を軽く押し下げて組織を完全に浸し、凝固が完了するまでカセットを氷上に置いておきます。凝固後、包埋した組織の周囲から余分なアガロースを取り除き、大脳の腹側表面がわずかに露出するように整えます。次に、Vibram組織ブロックにシアノアクリレート系接着剤を塗布し、横断切片を作成するため、aros埋込組織の露出した腹側表面を接着剤が塗布された面に接するように転写します。組織をブロック上に固定した後は、動かさないでください。aros埋込組織を固定したVibram組織ブロックを氷上に置き、接着剤を15分間乾燥させます。その間に、準備した組織チャンバーを24ウェルプレートに1ウェルにつき1チャンバーずつ配置します。組織チャンバーが入ったウェルに、冷えた1 XPBSを1 mL注入し、プレートを氷上に置いたままにします。接着剤が乾いたら、バイブラムブレードを組織の上面の高さまで下げます。Vibramの速度を0.22 millimeters per secondに設定し、前方への動きでセクショニングを開始して、厚さ200 micrometerの切片を作成します。水彩用のソフトブラシを使用して、脳切片を各組織チャンバーに1枚ずつ移します。組織の分解を防ぐため、セクショニングが完了するまで24ウェルプレートを氷上に置いて保持してください。次に、もう1枚の24ウェルプレートを用意し、3つのウェルにS myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextroおよびCD4抗体を含むカクテル液を300 µLずつ添加します。続いて、別の3つのウェルに、コントロールであるS Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextroおよびCD4抗体のカクテル液を300 µLずつ添加します。その後、各ウェルにラベルを貼ります。次に、特異的dexトリマーで染色する予定の切片が入った3つの組織チャンバーを、24ウェルプレートの指定された3つのウェルに、1ウェルにつき1チャンバーずつ移します。同様に、対照群のdexストリーマーで染色する予定の切片が入った3つの組織チャンバーを、それぞれのウェルに移します。1ウェルに1チャンバーずつ配置した状態で、プレートに蓋をします。プレートをアルミホイルで包み、室温・暗所で緩やかな回転に設定したロッキングプラットフォーム上に1.5時間置きます。インキュベーション後、組織切片を1 mLの冷たい1 XPBS洗浄液を含む新しいウェルに移し、ロッキングプラットフォーム上で少なくとも10分間洗浄します。この洗浄操作を計3回繰り返します。組織切片が乾燥するとチャンバーの側壁に付着する可能性があるため、乾燥させないように注意してください。組織チャンバーを新しいウェルに転送して切片を固定します。ろ過済みの4% PBS緩衝パラホルムアルデヒド 1 mLを含む24ウェルプレートに入れ、ロッキングプラットフォーム上で緩やかに回転させながら2時間インキュベートします。切片をさらに3回洗浄した後、染色および固定済みの切片を清潔な顕微鏡用スライドガラス上に載せます。水彩用の柔らかい筆を使用して、切片に触れないように余分な水分を拭き取り、封入剤を用いて切片を封入します。顕微鏡用カバーガラスで覆い、スライドガラスを室温で一晩乾燥させます。暗室にて、日常的なスキャニングおよび画像取得にはNikon A1 Eclipse 90i共焦点顕微鏡システムを使用します。まずNIS-Elements ARソフトウェアを起動し、パネルからテトラエチルルミジンイソチオシアネート（TRITC）およびCyan5またはCy5チャネルを選択します。TRITCおよびCy5チャネルの励起・蛍光波長はデフォルトで表示されます。Trit Seaチャネルに擬似カラーの緑を、SCI fiveチャネルに赤を割り当てます。観察するスライドを顕微鏡ステージに設置し、100倍の倍率で手動でピントを合わせます。HVを10に、オフセットを0に設定し、フォーカスをクリックして電圧を調整します。レーザーを最適化するため、フォーカススキャンを用いて切片を上から下まで走査し、画像取得のためのZレベルを設定します。次に、CHシリーズをクリックし、順次画像を撮影します。赤色および緑色の両チャンネルから生成されたシグナルの共局在に基づき、黄色の点状の細胞として現れるdextroまたは陽性CD4陽性T細胞を同定します。Dextro陽性またはCD4陽性T細胞を容易に定量的に計数するために、Olympus FV 500 BX 60共焦点顕微鏡を使用します。まず、flu ovuソフトウェアを起動します。ドロップダウンメニューから染料のS SI 3およびSCI 5を選択し、「apply」をクリックしてそれぞれのレーザーをロードします。観察するスライドを顕微鏡ステージに設置し、SI 3レーザーをオンにした状態で、低倍率でのクリックフォーカスを用いて手動でピントを合わせ、炎症部位にフォーカスを合わせます。対物レンズを100倍に変更します。ドロップダウンメニューからファイルサイズを512×512に設定し、クリックフォーカスを行い、SI 3とSI 5のレーザーを個別に最適化するためにPMTゲインとオフセットの値を調整します。Zステージをクリックし、両方のレーザーがオンの状態でフォーカスをクリックします。上下の矢印をクリックして、Zステージの厚さを設定します。Z間隔を2 µmに設定します。[Stop]をクリックし、選択します。1、2、3を探索します。次にX、y、Zをクリックし、炎症 foci 内の選択領域についてZシリーズ画像の取得を開始し、Z連続画像をVIファイルとして保存します。画像ファイルを保存するには、Z連続画像から画像を選択し、TIFF形式で保存してください。マルチTIFF形式で常に画像を保存してください。まずデータを保護し、次に、2組のdexトリマーで染色された3枚のペア切片を検討します。まず、同一焦点内でのZシリーズの重複を避けるため、スライドを水平・垂直・上・水平・垂直・下の順に動かしてスキャンし、Z系列画像を取得します。Zスタック画像を撮影した後、スライド番号、切片名、および撮影したZスタック画像の番号を明記してファイルに名前を付けます。ImageJソフトウェアを使用して、CD4陽性T細胞の総数に対するdextro陽性CD4陽性T細胞の数をカウントします。ImageJでカウンターの種類を選択し、「Show All」にチェックを入れ、各細胞の中心をクリックしてカウントを開始します。サイド矢印を使用して、異なるZスタック画像へと移動しながらカウントを継続してください。すべてのCD4 T細胞を計数した後、別のカウンターを選択し、デクストラン陽性のCD4陽性T細胞を計数します。結果タブをクリックして、2つの異なるカウンターで計数された細胞の総数を確認します。髄鞘プロテオリピドタンパク質（PLP）特異的CD4 T細胞の検出は、EAEマウス由来の新鮮な脳切片を用い、抗CD4抗体およびPLP 139-151デクストラン、またはコントロールのTMEV 70-86デクストランを含むカクテルで染色し、LSCMを用いて行いました。脳切片の共染色解析の結果、赤色でPLP 1 39 to 1 51 dexトリマー陽性細胞が、緑色でCD4抗体陽性細胞が示され、二重陽性細胞は黄色として認められた。共染色された細胞では、周辺部に点状のドットが観察された。このような特徴は、コントロールのTMEV 70 to 86で染色した切片では認められなかった。心筋ミオシン特異的なCD4 T細胞を検出するため、心筋ミオシン重鎖α3 34-352 デクステリマーを用いたin situ染色も実施した。これらの画像をLSCMで解析した結果、MYHC 3 34-352 デクステリマー陽性細胞が赤色に、CD4陽性細胞が緑色に、そしてデクステリマーとCD4の両方に結合した細胞が黄色の点状細胞として観察された。コントロールRNA 43-56 デクステリマーによる背景染色は無視できる程度であった。適切に実施すれば、本手法は他の既報のプロトコルの3日間に対し、約8〜10時間で完了させることができる。この手順を実施する際は、あらかじめ試薬を準備し、各ステップを体系的に進めることが重要です。このビデオを視聴することで、標的組織におけるC-reactive CD4 T細胞を計数するための組織切片作成および染色の方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

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