組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

この手順の全体的な目的は、ラット組織から純度が高く呼吸能を有するミトコンドリアを迅速に単離することです。まず、組織サンプルを結合させ、ホモジナイズすることでこれを達成します。次に、ホモジネートにsubin Aを混合し、氷上でインキュベートします。

続いて、ホモジネートをBSAで混合してろ過し、さらにもう一度ろ過します。最後に、ろ液を遠心分離し、ミトコンドリアペレットを呼吸緩衝液で再懸濁します。最終的に、呼吸分析およびATPルミネッセンスアッセイによって、単離されたミトコンドリアが生存しており、呼吸能を有していることを示すことができます。

ミトコンドリアの単離に60分から100分を要する既存の手法と比較した本手法の主な利点は、生存しており呼吸能を有するミトコンドリアを30分以内に単離できることです。共同研究先のラボの技術者であるAllison mackayが、開始直前にATPルミネッセンスアッセイを実演します。subin Aを1 mLのホモジナイズ緩衝液に溶解し、同様にBSAも1 mLのホモジナイズ緩衝液に溶解します。

まず、6 mmの生検パンチを用いて新鮮な組織サンプルを2つ採取し、50 mL遠心チューブに入れた氷上のXPBSに保存します。準備が整ったら、組織を5 mLの氷冷ホモジナイズ緩衝液を含む解離チューブに移します。次に、チューブを組織解離装置にセットし、プリセットされたミトコンドリア単離サイクルを選択して組織をホモジナイズします。

完了後、チューブを氷上に戻し、250 µL の sub to lyin ストックソリューションを加えます。転倒混和して混ぜ合わせます。混合物が均一に分散したところで、ホモジネイトを氷上で 10 分間インキュベートします。

次に、40 µmのメッシュフィルターを50 mLコニカル遠心チューブに装着し、氷上に設置します。フィルターをホモジナイズバッファーで湿らせ、バッファーを廃棄容器に捨てます。すべての準備が整ったら、ホモジネートをフィルターに通してろ液を回収します。

BSAストック溶液を250 µL加え、転倒混和します。ただし、ミトコンドリアタンパク質分析を行う場合は、このステップを省略してください。次に、さらに2つ準備します。

50 mLのコニカル遠心チューブを氷上に置き、一方に40 µmフィルターを、もう一方に10 µmフィルターを装着します。両方のフィルターを少量のホモジナイズ緩衝液で湿らせ、その緩衝液を捨てます。次に、ホモジネートをまず40 µmフィルターに通し、続いて10 µmフィルターに通します。

これらのろ過ステップにより、ミトコンドリアの純度が大幅に向上します。次に、ろ液をあらかじめ冷却した2本の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに分注し、4 °Cで10分間、9,000 Gsで遠心分離します。その後、上清を除去し、精製された2つのミトコンドリアペレットを再懸濁して合わせます。

1 mLの氷冷呼吸緩衝液を用い、全工程を必ず4 °Cで実施してください。精製したミトコンドリアを用いて、単離ミトコンドリアの代謝活性を測定できます。ATPルミネッセンスアッセイは、ATPアッセイキットを使用して実施可能です。

まず、キットの試薬を室温に戻します。次に、HT Pストック溶液を調製し、氷上に置きます。続いて、凍結乾燥された基質溶液に5 mLの基質バッファーを加えます。

これを穏やかに混ぜ、暗所に置きます。次に、不透明な黒色の96ウェルプレートの各ウェルに、100 µLの呼吸バッファーを加えます。準備したミトコンドリア 10 µLを、ATP標準品の直下のウェルに加えます。

各々のユニークなミトコンドリア試料を3連（triplicate）でプレートに分注し、陰性コントロールとして呼吸バッファーのみを3つのウェルに分注します。次に、ロード後のすべてのウェルに哺乳類細胞溶解溶液を50 µLずつ添加します。プレートを37 °Cで、120 RPMのオービタルシェーカーを用いて5分間インキュベートします。

インキュベーション中に、1/10 mMから1/10 µMまでの範囲でA TP標準液の希釈系列を調製します。インキュベーション後、各A TP標準液を10 µLずつ、プレートマップに示された対応するウェルに加えます。次に、各ウェルに再構成した基質溶液を50 µLずつ加えます。

次に、以前と同様にプレートをさらに5分間インキュベートします。その後、プレートリーダーでプレートの測定に進みます。以下のソフトウェアを開いてください。

新規アイテムを作成します。「experiment」をクリックし、次に「default protocol」を選択して「okay」をクリックします。

左側の列で「protocol」を選択します。次に「procedure」を選択し、「Next」をクリックします。次に「delay」を選択し、10分に設定します。その後、「okay」をクリックして入力を確定します。

次に、ドロップダウンメニューから「luminescence」を選択し、読み取り（read）を設定します。その他の設定を次のように調整してください。読み取りタイプ（Read type）を「endpoint」、積分時間（integration time）を設定します。

1秒に設定します。フィルターセットで1つのエミッションホールの光学位置を設定し、最高感度を100、トッププローブの垂直オフセットを1 mmに設定します。これらの設定変更を行った後、「OK」をクリックします。

プレートレイアウトをクリックし、適切に設定します。「OK」をクリックします。すべての設定が完了したら、最上段のプレート読取アイコンをクリックし、「読取（read）」をクリックします。

分光光度計が起動したら、ウェルA1が左上隅に来るようにプレートをトレイにセットします。温度を表示するボックスが開くので、「OK」をクリックし、データの解析に進みます。粒子径測定に基づくと、約0.18 g（湿重量）の骨格筋サンプルから約240億個のミトコンドリアが得られました。

同サイズの肝臓サンプルからは、さらに数十億個多く得られました。血球計数器によるミトコンドリアの測定値は、粒子カウンターを使用した場合に比べて低く見積もられていました。代表的なトレーシングデータを得たところ、単離されたミトコンドリアは、平均直径約0.4 µmの単一のピークに局在していることが示されました。

これは、bi acidアッセイを用いた先行報告と一致しています。骨格筋および肝臓組織1gあたり数ミリグラムのミトコンドリアタンパク質が測定されました。得られた産物は生存しており、呼吸能を有していました。

臨床的および外科的な治療的介入に適した時間枠内でミトコンドリアを単離した。透過電子顕微鏡写真により、単離されたミトコンドリアはすべて電子密度が高く、損傷したものは10,000個に1個未満であり、混入はATPアッセイにおいて100,000個に1個未満であることが示された。結果から、ミトコンドリアは生存しており、ATP含有量はミトコンドリアタンパク質1mgあたり約11〜15 nanomolesであることが明らかになった。

クラーク型電極を用いてミトコンドリア呼吸分析を行った結果、酸素消費量はミトコンドリアタンパク質1 mgあたり毎分約180 nmolの酸素であることが判明しました。また、RCI値はそれぞれ約2.5であり、肝臓のスコアがわずかに高い結果となりました。この手法を習得し、適切に実施すれば、30分以内に完了させることができます。