組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製
September 6th, 2014
哺乳動物の組織生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法が記載されている。ラット肝臓または骨格筋調製物は、商業的な組織解離をホモジナイズし、ミトコンドリアをナイロンメッシュフィルターを通して差動濾過により単離した。代替的な方法を用いて100分間 - ミトコンドリアの分離時間は60と比較して<30分である。
この手順の全体的な目標は、ラット組織から純粋で呼吸能力のあるミトコンドリアを迅速に分離することです。これは、最初に組織サンプルを関連付けて均質化することによって達成されます。次のステップは、スビンAをホモジネートに混合し、氷上でインキュベートすることです。
これに続いて、BSAでホモジネート混合をろ過し、再度ろ過します。最後のステップは、濾液をスピンダウンし、ミトコンドリアペレットを呼吸緩衝液に再懸濁することです。最終的に、結果は、呼吸分析とA TP発光アッセイを通じて、単離されたミトコンドリアが生存可能であり、呼吸能力があることを示すことができます。
この技術の主な利点は、60分から100分の範囲のミトコンドリア単離時間を報告する既存の方法と比較して、生存可能で呼吸能力のあるミトコンドリアを30分以内に単離できることです。Allison mackay, A technician from a collaboration lab will be demonstrating a TP luminescence assay Just before the beginning (アリソン・マッケイ, A 技術者が、開始直前に A TP 発光アッセイのデモンストレーションを行います。スビンAを1ミリリットルの均質化緩衝液に溶解し、BSAも1ミリリットルの均質化緩衝液に溶解します。
まず、6mmの生検サンプルパンチを使用して2つの新鮮な組織サンプルを採取し、50リットルの遠心分離チューブ内の氷上の1つのXPBSに保存します。準備ができたら、組織を5ミリリットルの氷冷ホモジナイジングバッファーを含む解離Cチューブに移します。次に、チューブを組織解離にフィッティングし、プリセットされたミトコンドリア単離サイクルを選択することにより、組織を均質化します。
完了したら、チューブを氷に戻し、250マイクロリットルのサブをストック溶液に加えます。これを反転で混ぜ合わせます。混合物が均一に分布しているように見える場合は、ホモジネートを氷上で10分間インキュベートします。
次に、40ミリリットルの円錐形遠心分離管に50ミクロンのメッシュフィルターを置き、これを氷に詰めます。フィルターを均質化バッファーで湿らせ、バッファーを廃棄物容器に廃棄します。次に、すべての準備ができたら、ホモジネートを濾液に注ぎます。
250マイクロリットルのBSA原液を加え、反転して混合します。ただし、ミトコンドリアタンパク質分析では、このステップはスキップする必要があります。次に、さらに2つ準備します。
氷上の50ミリリットルの円錐形遠心分離管は、1本には40ミクロンのフィルターを、もう1本には10ミクロンのフィルターを取り付けます。両方のフィルターを少量の均質化バッファーで濡らし、このバッファーを廃棄します。次に、最初にホモジネートを40ミクロンフィルターに注ぎ、次に10ミクロンフィルターに注ぎます。
これらのろ過ステップにより、ミトコンドリアの純度が大幅に向上します。次に、濾液を2つの予め冷却された1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに分割し、摂氏4度で10分間9, 000Gで遠心分離します。次に、上清を取り除き、精製した2つのミトコンドリアペレットを再懸濁して組み合わせます。
1ミリリットルの氷冷呼吸緩衝液では、全体の手順を摂氏4度で実施することが重要です。精製されたミトコンドリアを試験して、単離されたミトコンドリアの代謝活性を測定できるようになりました。A TP発光アッセイは、A TPアッセイキットを使用して実施できます。
まず、キット試薬を室温に戻します。次に、HT P原液を調製し、氷の上に置きます。次のステップは、凍結乾燥された基質溶液に5ミリリットルの基質緩衝液を添加することです。
これをやさしく混ぜて、暗所に置きます。次に、不透明な黒色の96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの呼吸緩衝液を追加します。調製したミトコンドリアを10マイクロリットルをA TP基準未満のウェルに加えます。
各固有のミトコンドリアサンプルは、ネガティブコントロールとして、呼吸バッファーの3ウェルのみのトリプリケートプレートに播種する必要があります。ロードしたすべてのウェルに50マイクロリットルの哺乳類細胞溶解液を添加して続けます。プレートを摂氏37度で5分間、オービタルシェーカーで120 RPMでインキュベートします。
インキュベーション中に、10マイクロモルから10マイクロモルまでの範囲のA TPスタンダードの希釈液を調製します。インキュベーション後、各A TP標準試料を10マイクロリットルずつ、プレートマップに示されている対応するウェルに加えます。次に、それぞれに50マイクロリットルの再構成基質溶液を加えます。
その後、前と同じようにプレートを再び5分間インキュベートします。プレートリーダーでプレートを調べて進めます。でソフトウェアを開きます。
新しいアイテムを作成します。[テスト] をクリックします。次に、デフォルトのプロトコルをクリックし、[OK]をクリックします。
左側の列で、プロトコルを選択します。次に、手順次に、遅延を選択し、10分に設定します。それでは、エントリーです。
次に、ドロップダウンメニューから発光を選択、読み取り、選択します。その他の設定を次のように調整します。読み取りタイプのエンドポイント統合時間。
ちょっと。フィルターは、1つの発光穴光学位置、上部感度100、上部プローブの垂直オフセット1ミリメートルを設定します。これらの設定変更を行った後、[OK]をクリックします。
プレートレイアウトをクリックし、それに応じて設定します。[OK]をクリックします。すべての設定が完了したら、一番上の行にある読み取りプレートのアイコンをクリックし、[読み取り]をクリックします。
分光光度計が開いたら、プレートをトレイに置き、ウェルAを左上隅に置きます。温度を表示するボックスが開くので、[OK]をクリックして、データの分析を続行します。約0.18グラムの重さの骨格筋サンプルを湿らせて、粒子サイズカウントに基づいて約240億個のミトコンドリアを産出しました。
同じサイズの肝臓サンプルは、数十億多くを与えました。ミトコンドリアヘモサイトメーターの測定値は、パーティクルカウンターを使用して過小評価されていました。代表的なトレースが得られ、単離されたミトコンドリアが平均直径が約10分の4ミクロンの1つのピークの下に局在していることが示されています。
これは、バイアシッドアッセイを使用した以前の報告と一致しています。ミトコンドリアタンパク質は、骨格筋と肝臓の組織1グラムあたり数ミリグラムで測定されました。製品は実行可能で、呼吸が有能でした。
ミトコンドリアは、臨床的および外科的治療介入に適した時間枠で分離されます。透過型電子顕微鏡写真は、単離されたミトコンドリアはすべて電子デントであり、損傷は10,000分の1未満であり、汚染は10万分の1未満であることを示しましたTPアッセイ。その結果、ミトコンドリアは生存可能であり、TP含量はミトコンドリアタンパク質1ミリグラムあたり約11または15ナノモルであることが明らかになりました。
クラーク型電極を用いてミトコンドリア呼吸解析を行ったところ、酸素消費量は毎分約180MLEsであることが明らかになりました。ミトコンドリアタンパク質のミリグラムごとに、RCI値はそれぞれ約2.5で、肝臓のスコアがわずかに高かった一方で、習得すると、この手法は適切に実行されれば30分以内に実行できます。
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概要
この記事では、ラットの組織生検から純粋で呼吸能のあるミトコンドリアを分離する迅速な方法について説明しています。この手順により、従来の方法と比較して分離時間を30分未満に大幅に短縮します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ミトコンドリア研究
背景
- ミトコンドリアは細胞呼吸とエネルギー生産に不可欠です。
- 従来のミトコンドリア分離方法は時間がかかる可能性があります。
- 迅速な分離技術は実験効率を向上させることができます。
- 生存可能なミトコンドリアは正確な代謝研究に不可欠です。
研究目的
- 哺乳類組織からミトコンドリアを分離するより迅速な方法を開発すること。
- 分離されたミトコンドリアが純粋で機能的に有能であることを確保すること。
- その後の呼吸分析とATPアッセイを容易にすること。
使用した方法
- ラットの肝臓または骨格筋サンプルのホモジナイゼーション。
- 効率的な混合のための商業的な組織分離器の使用。
- ナイロンメッシュフィルターを通した連続的な濾過。
- 呼吸緩衝液でのミトコンドリアペレットの再懸濁。
主な結果
- 分離時間が30分未満に短縮されました。
- 分離されたミトコンドリアは生存性と呼吸能を示しました。
- 結果は呼吸分析とATP発光アッセイによって検証されました。
- この方法は代謝研究における幅広い応用が可能です。
結論
- 迅速な分離方法は機能的なミトコンドリアを得るのに効果的です。
- この技術はミトコンドリア研究における研究プロセスを効率化できます。
- 将来の研究では、様々な哺乳類組織への応用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid mitochondrial isolation under 30 minutes enables timely functional assessment for preclinical metabolic studies and therapeutic screening. This method supports target validation by providing respiration-competent mitochondria from tissue biopsies, reducing biological variability in early discovery. The standardized tissue dissociation and filtration workflow improves reproducibility across labs, facilitating consistent data generation for go/no-go decisions in mitochondrial-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial function as a therapeutic target in metabolic disease models.
- Operational Value: Replaces manual homogenization with standardized tissue dissociation for uniform sample preparation.
- Predictive Value: Yields viable mitochondria for respiration and ATP assays, supporting mechanistic de-risking of lead compounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides purified mitochondria suitable for high-content respiration and luminescence-based assays.
- Operational Value: Eliminates repetitive centrifugation steps through differential filtration, increasing throughput.
- Assay Readiness: Delivers consistent mitochondrial yields (~2x10^10 per 0.18g tissue) for reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains mitochondrial integrity and respiration competence, critical for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Compatible with clinical timelines, enabling isolation within surgical intervention windows.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment via ATP content and oxygen consumption metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical mitochondrial assessment, offering a rapid, reproducible step before compound screening or efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mitochondrial dysfunction in disease models through functional readouts.
- Screening: Enables assay-ready mitochondrial preparations with improved purity via sequential 40µm and 10µm filtration.
- Analytics: Generates quantitative outputs for respiration analysis (oxygen consumption) and ATP luminescence, facilitating condition comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via respiration-competent mitochondria suitable for ex vivo testing.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol using commercial tissue dissociator allows cross-lab adoption and workflow integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial target engagement through validated respiration and ATP assays.
- Operational Value: Reduced isolation time (<30 min) and elimination of gradient centrifugation steps increase lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead identification by providing timely mitochondrial functional data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing false positives in mitochondrial-targeted screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and mitochondrial assay techniques.
- Dependent on access to a commercial tissue dissociator with preset mitochondrial isolation cycle.
- Necessitates sterile nylon mesh filters (40µm and 10µm) and temperature-controlled centrifugation (4°C, 9,000 x g).
- Standardization across tissue types (e.g., skeletal muscle, liver) may require optimization of dissociation parameters.
- Practical limitation: Method validated in rat tissues; extrapolation to human or other mammalian tissues requires additional validation.
