成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

この手順の全体的な目標は、造血幹細胞と前駆細胞を含む高解像度の3Dスタックを取得し、マルチポイントタイムラプスイメージングを通じてそれらを経時的に監視することです。これは、まず造血幹細胞と前駆細胞、またはHSCを親油性色素で標識することによって達成されます。次に、HSCをレシピエントマウスに注入します。

マウスは、動物の安定した位置決めのためにカスタマイズされたヘッドピースと標本ホルダーを使用して顕微鏡検査用に準備されます。次に、造血幹細胞と前駆細胞ニッチの高解像度スタックを取得し、HS PCを含む複数の骨髄位置のタイムラプスイメージングを最終的に生体内共焦点で行い、2光子顕微鏡を使用して骨髄空間におけるHSCの局在と動きを示します。骨髄切片の免疫蛍光法などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、4次元スケール、3次元プラス時間で情報をキャプチャできることです。

この技術の意味は、造血幹細胞が正しい機能を保証するために骨髄内のどこに向ける必要があるかを理解するのに役立つため、血液疾患の治療にまで及びます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、HS PCを経時的に追跡できることが最初に重要であることに気付いたときでした。この方法は、幹細胞がどこに存在し、時間の経過とともにどのように振る舞うのかを知りたい幹細胞ニッチ分野に関する質問に答えるのに役立ちます。

血幹細胞と前駆細胞の採取を開始するには、この研究室が以前のジオビデオで示し、テキストプロトコルで参照しています。次に、親油性色素DIDを最終濃度5マイクロモルで細胞懸濁液に加えます。すぐに懸濁液をボルテックスして、色素が溶液から沈殿したり、細胞の標識に失敗したりしないようにします。

細胞を摂氏37度で10分間インキュベートし、細胞を洗浄します。まず、Gの500倍で5分間回転させ、液体をデカントします。次に、細胞を200マイクロリットルのPBSに再懸濁し、インスリン注射器に集めます。

インスリン注射器は、針のデッドスペースがないため、従来の注射器よりも推奨されます。細胞懸濁液全体をマウスに投与し、尾静脈注射により致死的にIを照射したマウスに細胞を注入する。まず、マウスを暖かい部屋に入れます。

尾静脈が現れ、血管が拡張したら、マウスを拘束装置に移動します。針を尾静脈に慎重にスライドさせます。細胞を静脈に注入します。

注射に対する抵抗に遭遇してはなりません。.マウスを一晩放置します。細胞が骨髄腔に移動するようにするには、マウスに麻酔をかけ、花弁反射を介して深部麻酔の開始を監視します。

頭皮の上部を70%エタノールでティッシュに綿棒で拭きます。マウスの目にエタノールが入らないように注意してください。画像化するカルバリウム領域を露出させるには、皮膚を持ち上げながら鉗子で皮膚を持ち上げ、耳の間の後頭部に小さな切開を行います。

はさみを皮膚の下にスライドさせ、目的のイメージング領域の外側に沿ってそっと切ります。露出した骨を滅菌PBSで湿らせた滅菌綿棒で拭き取り、骨を湿らせます。これにより、画像の品質に影響を与える可能性のある過度の乾燥や瘢痕化を防ぐことができます。

次に、ホエーボートで適量の歯科用セメントをペースト状になるまで混ぜます。頭蓋骨に取り付けられるオートクレーブヘッドピースの底面にすばやく適用します。セメントが固まる前に、ヘッドピースをマウスの頭蓋骨に置き、イメージング領域に歯科用セメントが付着しないようにして、固まるのを待ちます。

頭蓋骨を湿らせておくイントラハイドロゲルを少量塗布し、セメントが乾くときにセメントを乱さないように注意してください。次に、ヘッドピースをホルダーに取り付けて所定の位置に固定します。ネジを使用して、溝がホルダーのノッチ内に収まるようにします。

顕微鏡に移す前に、滅菌綿棒でハイドロゲルを取り出します。次に、ホルダーを顕微鏡ステージに挿入し、加熱マットをマウスの下に配置します。直腸体温計プローブを挿入し、粘着テープでステージ上の所定の位置にすべてを固定します。

用軟膏を少量垂らして、麻酔薬を服用している間にマウスが乾かないようにします。麻酔下でのイメージングプロセス中は、マウスを放置してはなりません。アイピースを介して頭蓋骨に焦点を合わせます。

まず、水浸漬レンズを使用して、カルバリウムイメージングウィンドウに精製滅菌水を入れます。水滴に触れるように下げます。顕微鏡のアイピースを使用して頭蓋骨の上部に焦点を合わせます。

イメージング領域を中央縫合糸に配置し、頭の後方に向かって移動して冠状縫合を見つけます。開始位置として、ソフトウェアをXY画像と3つのDZスタックをキャプチャするモードにします。イメージング速度を 400 ヘルツに、解像度を 512 x 512 ピクセルに設定します。

複数のチャンネルがキャプチャされるようにソフトウェアを設定し、スタック間またはフレーム間で設定を変更するための収集方法を設定します。3つの独立したキャプチャ設定を設定します。各スタックの取得終了時にレーザー照明をオフにします。

次に、2光子の第2高調波発生骨信号の最初のシーケンシャルスキャンを設定します。多光子レーザーのシャッターを開き、多光子レーザーのゲインとオフセットが正しく設定されていることを確認します。また、レーザー出力が12.5〜25%で、レーザーがオンになっていることを確認してください。

検出器のみとして適切なPMTを選択し、色を白に変更します。2番目の設定で自家蛍光とDIDを組み合わせるためのチャネル設定手順を繰り返します。2つの適切なp mtsを使用してスキャンします。

チャンネルの色を自家蛍光の場合は緑に、DIDの場合は赤に変更します。最後に、GFP検出の3番目と最後のスキャンを設定します。488ナノメートルのレーザーラインのレーザー出力を約15%に設定し、適切な光電子増倍管またはPMTを唯一のアクティブ検出器として選択し、その疑似色を緑色に変更します。

ライブイメージングモードをアクティブにして、選択したチャンネルのプレビュースキャンを開始し、検出器のゲインとオフセットを調整して最適な露出を実現します。シーケンシャルウィンドウのスキャンごとにこれを繰り返し、これらのマルチチャンネルスキャンの設定を保存して再利用できるようにします。次に、このソフトウェアでマークアンドファインと呼ばれるマルチポジションキャプチャをアクティブにして、座標点をリセットします。

次に、中央縫合糸と冠状縫合糸の交点から始まる骨イメージング領域をスキャンします。自家蛍光とDIDの両方を使用して、骨髄領域の深さを複合ビューでスキャンします。セルが検出されたら、マークとウィンドウの左側にある新しい位置の追加アイコンをクリックして、これを新しい座標位置としてマークします。

現在の視野が調べられたら、ステージを 1 つの視野の距離だけ動かします。ビューの各フィールドに対してこのプロセスを繰り返します。中央縫合糸の左側にあるイメージングウィンドウ全体を徐々に回り込み、マウスの鼻に向かって移動します。

中央の縫合糸の分岐部が見えてきたら、縫合糸の右側に移動して手順を繰り返します。左側を逆方向にスキャンします。マークと検索ツールを使用して、関心のある新しいセルの座標をマークします。

ポイントを確認するには、各位置の各セルの周囲にZsスタックの上部と下部を設定します。各ポイントについて、上下にピントを合わせ、3つのDZスタックキャプチャの上下のZ位置を設定します。マークと検索の個々のポイントを更新し、ザック間隔を5マイクロメートルに設定し、各シーケンシャルスキャンチャネルの平均を適切な品質に設定します。

スキャン手順全体を開始することにより、各対象ポイントの高品質な参照スタックを取得します。高品質のスキャンが終了したら、キャプチャのタイムラプス設定とタイムラプス設定をアクティブにします。時間間隔を 5 分に設定し、全体の実行時間を目的の長さに設定します。

これらの設定をスキャン全体に適用します。この例では、3点を超える集録を実行する方法を示します。これらの設定を変更することにより、平均化に使用されるスキャンの数を減らして解像度を512 x 512ピクセルに制限することにより、スキャン時間を短縮して5分間のタイムラプス間隔を許容できます。スキャンを双方向に変換したり、スキャン速度を600ヘルツ以上に上げたりして、スタートボタンとデモされたソフトウェアをクリックすることで、以前と同様にイメージングを開始します。

イメージングが完了したら、テキストプロトコルに詳述されているようにマウスの安楽死を実行します。カスタムメイドの高精度マウスホルダーは、カルバリウムイメージングウィンドウを含み、致死的に照射されたレシピエントマウスに注入された標識HS PCの長時間イメージングを可能にします ここに示されているのは、コラーゲンからの約90〜120マイクロメートルの厚さの骨髄領域を含むHSPCの単一細胞解像度3Dスタックの2Dスライスです。骨は白で表示され、DIDラベルの付いたセルは赤で示されます。

自己蛍光細胞は黄色、骨芽細胞細胞は緑色で示されています。ここに示されているのは、同定されたHS PCの40タイムラプスムービーで、赤色でHSCと標識されたDIDを示し、緑色で骨芽細胞の近接性を移動させるとマスタリングされる。この技術は、手術と初期イメージング、その後のタイムラプスイメージングに十分な時間で約1時間で実行できるはずです。

このビデオを見れば、マウスのカルバーのイメージングを設定し、複数のHS PCを経時的に見ることができることにかなり自信を持つはずです。