Name: 成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 学ぶ 造血幹細胞と前駆細胞のin vivo 4次元トラッキング法。マウス頭蓋冠骨髄内の細胞動態を2光子・共焦点顕微鏡でリアルタイム観察し、幹細胞ニッチの挙動と治療応用への知見を得る。

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イメージングは​​、博士マーティンSpitalerによって管理インペリアル·カレッジ·ロンドンの膜施設内に位置直立ライカSP5共焦点顕微鏡上で実施した。 試料ホルダーおよびヘッドピースはサミュエル·ジョーンズ博士とサイモン·シュルツからの助言で、インペリアル·カレッジ·ロンドンの化学工学部門と共同で行われました。 ニコラRuivo、フランシスコ·ディアスとインペリアル·カレッジでのCBSのスタッフは、マウスの飼育上の支援や助言のため尽力した。 マーク·スコットはCRUK、KKLF、BBSRCとHFSPによってCRUKとクリスティーナ·ローセルソによりHFSPや映画、Olufolake Akinduroによって資金を供給されている。

動物の使用を含むすべての手順は現地の法律に従って行われる。私たちの仕事は、英国内務省だけでなく、インペリアルカレッジ倫理審査委員会によって承認されています。許可された手順は、プロジェクトのライセンスのドキュメントに記載され、常に動物の福祉を確保するガイドラインに従っています。作業が行われている国の動物実験に関する法律を遵守することを確認してください。 1標識およびHSPCsの注入： <ol><li>ローセルソ14-15によって記載されているように細胞を回収する。 </li><li> PBS中10 6細胞/ mlの濃度で細胞を調製する。注：細胞をカウントし、血球計数器やセルソーターによって提供された情報を使用します。標識し、注入される細胞数は、細胞型（ - 2万HSCは、100,000 - 例えば染色10,000〜300,000のHPC）に依存して変化する。 10未満の5個の細胞を扱う場合には、100μlのPBSに再懸濁;血清は染色を阻害するように、それは、いずれの血清を含まないPBS中で細胞を有することが重要である。 </li><li> 5μMの最終濃度で細胞懸濁液に行なったし、溶液から沈殿し、細胞を標識するために失敗しない染料を確実にするために、すぐに停止をボルテックス追加。 </li><li> （ - 150μlの〜100）、5分間500×gでスピンし、液体をデカントし、IV注射のために適切なボリュームにペレットを再懸濁することにより洗浄、次いで37℃で10分間インキュベートする</li><li> 200μlのPBSで細胞を再懸濁し、インスリン注射器に集める。注：それは針デッドスペースがないため、マウス全体の細胞懸濁液を投与することを可能にするので、インスリン注射器は、従来の注射器をお勧めします。 </li><li>尾静脈注射を介して、致死的に照射したマウスに細胞を注入する。注：TIにわたって開発して骨髄微小環境（造血および間質成分の両方）、上の照射が知られている、かなりのインパクト私。これは、照射、細胞注射（最高の生着のための照射から4〜24時間）、およびイメージングのための一貫性のあるタイミングを維持することが非常に重要である。ここで照射は、注射の前に6時間行われ、イメージングは​​、注射後20時間で行われる。 <ol><li>尾静脈を血管拡張表示されるまで、暖かい室内（37℃）でマウスを置きます。 </li><li>制止にマウスを移動し、慎重に尾静脈に針をスライドさせます。 </li><li>静脈内に細胞を注入 - 注入への抵抗に遭遇してはならない。 </li><li>細胞は、骨髄空間に移行することを可能にするために、マウスのO / Nのままにしておきます。 </li></ol></li></ol>イメージングのためのマウスを準備する2。 <ol><li>細かい鉗子の1対1の微細ハサミだけでなく、無菌環境での使用前にヘッドピースとストアをオートクレーブ。 </li><li>可能な限り新鮮なように麻酔薬を構成する、（0.38ミリリットルケタミン+ 0.25ミリリットルメデトミジン+ 4.47ミリリットルの水）。注：OTイソフルランおよび他の注射など、彼女の承認された麻酔薬としては、あまりにも効果的であろう。 1時間毎に45分間投与し、50μlの - に記載カクテルは、30のトップアップを、体重10g当たり0.1 mlの腹腔内に投与される。 </li><li>必要に応じてメッセージが表示されたら、ステージを校正、顕微鏡やソフトウェアを起動し、二光子レーザーのスイッチをオンにします。レーザーのスイッチを入れ、それらをウォームアップし、画像化のために、マウスを準備中に安定化させる。 </li><li>腹腔内注射を介して選択された麻酔薬のために準備された麻酔薬の混合物（ステップ2.2）を使用して、マウスを麻酔。今とプロトコルを通じて定期的にペダルレフを経由して深麻酔の開始を監視します。注：マウスは処置を通して注意深く監視し、麻酔を軽量化しているように見える場合は、しなければならない - （2.2で詳述）（通常は後に45〜60分）後、トップアップ用量を投与。異なる年齢と性別のマウスの間にいくつかの変化を期待しています。それはimporです適切な予防策を確実にするために、お近くの獣医官による麻酔プロトコルを議論するために重要、マウスの福祉を確保するために取られる。 </li><li>マウスの目にはどんなエタノールを取得しないよう確保し、組織上の70％エタノールで頭皮の上部を綿棒。 </li><li>滅菌ピンセットやハサミを使って、慎重に画像化される頭蓋冠面積を露出するように頭皮の中央部分を削除します。ピンセットで皮膚を持ち上げて耳の間の頭の後ろに小さな切開を行います。皮膚を上に押しながら、皮膚の下にハサミをスライドさせ、ゆっくりと所望の撮影領域の外側に沿ってカット。 </li><li>湿ったそれを維持するために滅菌PBSで湿らせ、滅菌綿棒を用いて露光骨を拭きます。 </li><li>イメージングのための準備ができて、マウスの頭蓋骨にメタルヘッドピースを取り付けます。 <ol><li>それはペースト状になるまで計量ボートに歯科用セメントを適量混合し、すばやくsに付着するヘッドピースの底面に適用されますカル。 </li><li>セメントのセットの前に、マウスの頭蓋骨にヘッドピースを配置し、撮像領域上の任意の歯科用セメントを得るためにわからないこと、それが設定するために、待ちます。 </li><li>湿った頭蓋骨を保持サイト内ハイドロゲルの少量を適用します。 </li></ol></li><li>ホルダーにヘッドピースを取り付け、ネジを使用して所定の位置に固定し、溝がホルダーの切り欠き内に収まることを確実にする。 </li><li>無菌綿棒で頭蓋からヒドロゲルを取り出し、顕微鏡に移す前に、滅菌PBSで洗浄してください。 </li><li>顕微鏡ステージにホルダーを挿入し、マウスの下に加熱マットを置き、直腸温度計プローブを挿入し、粘着テープでステージ上の場所ですべてのものを固定します。 </li><li>彼らは麻酔下ながら乾燥させないことを確認するには、マウスの目に眼軟膏の小滴を置きます。注：麻酔下でマウスが画像化プロセス中にいつでも放置してはいけません。 </li></ol>in vivoイメージング ：高解像度のスタックとタイムラプス獲得<ol><li>接眼レンズを介して、頭蓋骨に焦点を当てています。 <ol><li>精製され、滅菌水で撮像窓を記入し、水浸漬レンズを使用して、それが水滴に触れるようにそれを下げる。 </li><li>光源などの外部ランプを使用して、顕微鏡の接眼レンズを使用して、頭蓋骨の上部に焦点を当てています。 </li><li>中央の縫合糸上の撮像領域を置き、開始位置などの冠状縫合を見つけるために、ヘッドの後方に向かって移動。 </li></ol></li><li>励起と発光テーブルに指定され、関連するフルオロフォアの効果的な励起および検出を可能にするために顕微鏡を設定します。注：LAS-AFソフトウェアプラットフォームを実行して、従来のガルバノスキャンヘッドを備えたライカSP5直立共焦点がここで使用されている間は、手順は簡単に他の顕微鏡/ソフトウェア·プラットフォームで複製することができます。ここで使用されるレンズは、ライカHCX IRAPO L 25X W / 0.95 NA bである他のメーカーのUT同等のレンズは、適切な倍率と高NAで利用できます<ol><li> 512×512ピクセル、400 Hzから解像度にXYの画像だけでなく、3D Zスタックおよび設定された撮像速度の両方をキャプチャするモードにソフトウェアを配置します。注：ここでのセットアップとハードウェアは、620ミクロンの視野をもたらし、これは他のプラットフォームでは異なる場合があります。 </li><li>複数のチャネルは/トラック並びに収集方法は、最低でスタック可能な場合又はフレーム間の設定を変更するように設定されていることを確実に捕捉することがすることができるようにソフトウェアを設定する。各スタックの取得の終了時にレーザ照明のスイッチを切る、3つの独立したキャプチャ設定をセットアップします。注：3つのチャネルが、チャネル間のクロストークを低減するには、この手順のために必要となります。 </li><li>セットアップ2光子のSHG骨信号（840 nm励起、400から440 nmの発光）の最初の順次スキャンの設定。 MPレーザ用のシャッターを開けて、Mを確保25％レーザがオンになって - Pゲインおよびオフセットが正しく設定され、レーザパワーが12.5である。唯一の検出器として適切なPMTを選択し、色を白に変更します。注：使用可能な明るく、より深い信号を達成するために適切なときにフィルターを備えたNDD検出器は、骨の検出に使用されるべきである。 </li><li>リピート組み合わせた自家蛍光のために、GFPチャネルのために使用されるチャネルのセットアップ手順（543 nm励起、560 - 600nmの発光）とDID（633nmの励起、650から720 nm発光）は、第2の設定では、2つの適切な光電子増倍管を利用して、スキャンします。 DIDのための自己蛍光と赤緑色にチャンネルカラーを変更します。注：自家蛍光チャネルは2つのチャネルがオーバーレイされているDID陽性細胞の検出を容易にすることができますように、緑を用いて - 自家細胞による両方のチャネルのしばらくあることにイエロー/オレンジ色に表示されてなかった細胞は、それらがのみに表示されるので、赤で表示されますチャンネルをしました。自己蛍光チャネルユーザは、このGFPチャンネルとの混同を避けるために、表示目的のため異なる色に変更することができることを望むしかし場合のみ、この比較のために使用され、任意の最終的な分析で使用されていない。 </li><li>最後に、セットアップGFPについて3番目と最後のスキャン（488 nm励起、500から530 nmの発光）;必要に応じて、シャッターが開いていることを確認してから約15％まで488nmのレーザー線または使用されているレーザーのための適切なレベルのレーザパワーを設定、唯一の活性検出器として適切なPMTを選択し、緑色の擬似カラーを変更します。 </li><li>選択したチャンネルのプレビュースキャンを開始し、検出器利得を調整し、最適な露出のためにオフセットするように「ライブ」の撮像モードを有効にします。シーケンシャルウィンドウ内の各スキャンのためにこれを繰り返します。 </li><li>簡単に再利用するため、これらのマルチチャンネルスキャンの設定を保存します。注：これは、ユーザーが以降のセッションの設定を再ロードすることができます。 </li></ol></li><li> 「マークAと呼ばれる多位置キャプチャを活性化するND実証ソフトウェアで「検索し、座標点をリセットします。 </li><li>中央と冠状縫合の交点から出発して、骨の撮像領域をスキャンし、両方の自己蛍光を使用して、骨髄領域の深さをスキャンする（疑似緑色）とDID（疑似色の赤）複合ビューで。注：自家細胞は、両方のチャネルに存在することと、標識された細胞は、合成画像内の赤のみのセルとして表示されますDIDのに対し、合成画像において黄/オレンジ色が表示されます。 </li><li>細胞が検出されるとマークとの検索」ウィンドウ」の左側に新しい位置のアイコンを追加」をクリックすることで、新たな座標位置（x、y、およびz）としてこれをマークする「Markと検索」ツールを。 </li><li>現在の視野が検討されている場合には、アップ/ダウン/左/右どちらかのステージを1つの視野の距離を移動します。次第に目の左に全体イメージングウィンドウ領域の周囲で作業を、各視野のためにこのプロセスを繰り返しE中央縫合糸、マウスの鼻に向かって移動。中央縫合分岐が見えになると、縫合糸の右側に移動して（ すなわち 、冠状縫合に向かって）逆方向に、左側をスキャンする手順を繰り返します。マーク &#39;Markと検索]ツールを使用して、関心のある任意の新しいセルの座標。 </li><li>撮像窓のスキャンが完了すると、「マークし、Find &#39;を使用ポイントをレビューするためのツールを（所望の点を選択して、個別に各ポイントを確認）。各位置のための各セルの周囲Zスタックの上部と下部を設定し、（多くのソフトウェア·プラットフォームを使用すると、空の領域をキャプチャ低減し、各位置のための独立したZ-スタックを実行できるようになります）。各ポイントでは、最大焦点を当て、ダウンして、3Dのzスタックキャプチャの上部と下部のZ位置を設定し、「Markと検索 &#39;内の個別のポイントを更新。 5μmのにzスタック間隔を設定し、適切な品質への各シーケンシャルスキャンチャネルごとに平均化：ラインORフレームの平均。 NOTE：収集時間の長さの平均増加するスキャンの数を増やす。 </li><li>全体スキャン手順を開始することにより、各関心点に対して、高品質の基準スタックを取得する（多くの場合、かなりの「キャプチャー」よりも「開始」と呼ばれる）。注：このスキャンは、将来の高速撮像のための基準として作用することができる。 </li><li>一度高品質なスキャンが終了し、捕獲のためのタイムラプス設定を有効にします。 </li><li>タイムラプスの設定では、所望の長さ（ 例えば 5時間）に5分の時間間隔と全体の実行時 ​​間を設定します。全体的なスキャンにこれらの設定を適用]。注：5分の経過時間間隔を許可するには、このスキャン時間を短縮するために、人は、平均化に使用されるスキャンの回数を減らす512×512ピクセルの解像度を制限し、必要な位相補正を（双方向に走査変換する必要があり）両方のスキャン方向を揃える、かつ/または600 Hzまたは以上（600人以上にスキャン速度を向上させるHz）は実証したソフトウェアプラットフォーム用の撮像領域のズーミングが発生します。これは、シーケンシャル撮像モードが最初に高品質の画像スタックを取得するために使用しながら、同時取得をタイムラプスイメージング中の速度を増加させるために使用されることに注意することも重要である - これは余分な配置チャンネル間の若干のクロストークを生じ得る正確に分離されたリファレンス·スタックの最初のキャプチャを重視。 </li><li> （実証ソフトウェアの「スタート」ボタンをクリックして以前のように）イメージングを開始。注：乾燥してバイタルサインおよび加熱パッド温度を監視しません定期的に、必要​​なときに、マウスを過剰摂取にならないように注意しながら、さらに少ない用量を投与することにより麻酔の適切なレベルを維持する目標を確実にするために水を補充するようにしてください全体に。 </li><li>終了したら、ホルダーからレンズを調達した後、直腸プローブおよびhからの配線を確保し、顕微鏡ステージからホルダーを取り外すマットを食べて損傷していない。 </li><li>ステージホルダーからヘッドピースを外し、慎重にマウスを取り外します。頸椎脱臼を使用して、マウスを淘汰し、頭蓋骨から、それをスナップすることにより、メタルヘッドピースを削除します。ディスクにデータを保存し、後で分析するために、サーバに転送します。注：ヘッドピースは、理想的には数時間をアセトンに浸漬し、最終的に残留セメントをオフに擦ってクリーニングされる。 </li></ol>

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開示することは何もありません。

何が達成された？ プロトコルは、精製されたFACSの移動を監視するために、マウス頭蓋冠骨髄におけるex vivoで標識された、移植されたHSPCsをタイムラプス多次元イメージングを使用しています。単一の移植された細胞の同定が達成されており、これらは高精度に時間（hr）を長期間にわたって監視されている。呼吸誘発性運動アーチファクトが最小化され、細胞が繰り返し延長された時間経過にわたって再イメージされています。 今後の方向性は何ですか？ 技術の開発を短縮し、注意してください（マウス用リカバリプロセスを簡素化するために一週間以上かかるイソフルランなどのガス麻酔薬の使用の過程で、複数の日に撮影を可能にするために、回収実験に向けて進行できます。回収実験は、厳密に必要と無菌手術条件および適切な鎮痛薬の投与）。開発in vivoでの染料の大きなカラーパレットだけでなく、また、多標識実験を容易に骨髄内の細胞間相互作用により多くの洞察を提供し、将来的にはより複雑な実験を可能にする、造血細胞の効率的な遺伝標識elopment。さらに、複数の骨髄構造および間質成分の同時標識はHSPCニッチで起こるイベントのより完全な像を提供する。タイムラプスムービーの画像安定性は、さらに、顕微鏡の安定化、ならびに画像レジストレーションアルゴリズムを用いて試料とpostacquisitionに温度勾配を最小化することによって買収前を向上させることができた。 制限事項 ： 記載されている技術には、いくつかの制限を提示します。注射用麻酔薬の投与後のマウスの生存率は予測不可能であり、それはに対する個体の応答に応じて合併症を経験することは非常に容易である麻酔薬。マウスを麻酔から回復するために一般的に、撮像セッション長く、困難であり、それは、マウスは、理想的には、タイムラプス撮影の継続時間を制限する、回収される場合に慎重に計画することが重要である。注射用麻酔薬の使用は、各撮像セッションが続くことができる時間を制限する。それは麻酔薬のより少ない用量を再投与することによって麻酔を延長することが可能であるが、それは困難であり、正確かつマウスを過剰投与、これを実行するin vivoイメージングの早期終了の最も頻繁な原因の一つである。イソフルランの&gt; 2時間長い投与はめったに成功した後のガス麻酔は、マウスのしかし急速な回復、低毒性で、より長い初期撮像セッションが可能になります。技術の別の制限は、迅速に画像を取得する必要性、多点タイムラプス撮影中に得られる画像の解像度が限られている。焦点ドリフトやフィールドと相まってこれは、（ディスクをジャンプ上記ussed）、細胞の追跡を困難にすることができます。 代替的な方法と比較： HSPCsは通常DID親油性色素で標識されているが、[16]で検討としてDIRとのDiI色素には、同等の代替及び他の細胞色素は限り、十分に明るい使用することができます。 DIDの細胞のex vivoで標識化HSCの長期的な機能に影響を与えないことが示されているにもかかわらず、それがDID制限（または任意の他の化学色素）を有し、細胞分裂の際に希釈される。 HSCは、移植後最初の日の間に増殖しているので、これらの細胞のための信号対雑音比が急激に劣化する。遺伝子操作蛍光タンパク質の発現による細胞の内因性標識は、蛍光タンパク質は、頭蓋骨を通して検出可能なシグナルを生成するために十分に高いレベルで発現される限り、実行可能な代替法である。代替？と思ったらがいくつかあります骨髄空間内HSPCsの撮影を行うために利用可能iques、独自の利点と限界を持つ各。共焦点画像は、外科手術用ドリルで骨エナメルの脛骨および薄化の外科的露出に追従して、[8]長骨における骨髄再構成のイメージングのために許可された光ファイバベースのイメージングデバイスを挿入する[12]内に存在するHSPCsの詳細な画像を生成し長骨の周辺領域。しかしこれらの方法は、はるかに侵襲ここで説明するので、同じマウス内の同じ骨髄エリアに焦点を当てたイメージングセッションを繰り返すことが許可されていないものよりもある。また、これらの技術は、周囲の組織に豊富な損傷に応答不可避与えられた観察細胞に影響を及ぼす可能性がある。 HSPCsしかしHSPCs上の組織のこの過酷な準備の影響はクレアではないが、[11]切除した、骨折した大腿骨の上に配置されたカバースリップを通して短期間に結像されていますrおよび技術は、単一時点の観測を得るために一意的に使用された。固定された骨は染色され、連続切片に区分し、得られた画像は、血管のキャストを使用する特に優れた3次元分解能を提供する、3Dモデルに再構築された[17]は 、最近レーザー走査サイトメトリー（LASC）定量得るために使用されている免疫染色によって強調され、その場で HSPCs約措置、[18]が、細胞の挙動についての時間的情報を提供することはできません。したがって、骨髄と相互作用HSPCsの長期モニタリングを達成するために理想的なアプローチを提供し、この新たな技術に記載された技術は、4Dで細胞を監視するために、3D、十分な時間的サンプリングで良好な解像度との組み合わせを提供し、それらは比較的非侵襲的である微小環境。

幹細胞ニッチは、嗅球、筋線維、毛包バルジまたはCNS脳室下帯4-7として何十年3について認識し、多くの組織において特徴付けされたにもかかわらず、造血幹細胞（HSC）と骨髄微小環境との間の相互作用（ BM）はまだ不十分による直接骨を通る単一の細胞ならびに組織自体の非常に流動性を観察するのが困難に理解されている。これは、異なる細胞型および調節シグナルの複雑なネットワークが休止の間に微妙なバランスの調節に関与することを、アブレーションまたはHSCまたはその微小環境自体の間質細胞のいずれかにおける特定の遺伝子を過剰発現に基づく機能多数の研究を通して、示されたHSCは1-2の、増殖、拡大および分化。 HSCおよびそれらのニッチの間のクロストークは、直接観察を通して深く理解することができる。これはACHですのみならず、顕微鏡の観点で利用可能な技術を組み合わせた高度な画像処理プロトコルの開発にievableおかげで、だけでなく、試料ホルダソリューションと取得ソフトウェアの。 マウス頭蓋冠の骨の骨髄コンパートメント内移植した造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）の単一細胞の解像度のライブイメージングは、移植するHSPCsは、SDF-1およびVCAM-1陽性血管8-9とそのより未熟細胞の近傍に局在することが示された彼らの子孫は10より遠位であるがGFP陽性骨芽細胞（骨芽制限コラーゲン1αプロモーターは、GFPの発現を駆動するCol2.3-GFPトランスジェニックマウス系統）から20ミクロン- 15内に発見された。同様の観察を切開し、骨折した大腿骨11及び薄くtibeal骨12から得られた。頭蓋冠骨髄のイメージングは​​、目の中HSPCsの直接可視化を実現するために最も侵襲アプローチのままEIRネイティブ微小環境。 任意の生標本撮像に起因する試料の移動に不要なアーチファクトを回避することができる限り、サンプルを保持する固有の必要性がある。呼吸は、頭蓋冠、骨髄を撮像する場合に回避する必要があるマウスヘッドの振動運動を引き起こす。彼らは前頭骨を妨げているため、脳のイメージングと電気生理学のために、例えば使用される従来の定位保有者は、頭蓋冠イメージングには適していません。ライブイメージングと電気生理学的研究の13時の苦痛を最小化するために使用したマウスホルダーから出発し、2部品ホルダとの安定したホールド性を確保する大きなアームに接続されたイメージング·ウィンドウを作成するには、マウスの頭部に固定された小片で、開発されました顕微鏡ステージにしっかりと固定している重いベースプレート。まだ所定の位置にヘッドを固定し、十分メートルを排除し、マウスの頭蓋骨にヘッドピースの確保が無料で呼吸を可能にする呼吸によるovements。ホルダ本体にヘッドピースを連結する「鍵と鍵穴」メカニズムは、したがって、手術が簡素化ウィンドウのサイズが最小化ならびに位置決め精度を向上させることができるため、ステージにベースプレートのフィット顕微鏡での正確な位置合わせが可能になります。正確な運動性細胞をモニターするために、多点タイムラプスプロトコル時点間5分間隔で経時的に細胞の追跡を可能にするように設計された。ここでは、ラベルされたDID HSCはcol2.3GFPのosteoblasitcレポーターマウス10,14に注入し、約20時間後に撮像される。設計された、複数の時間の期間にわたって同じ分野の急速な多点タイムラプス撮影を実行するために必要なイメージング設定は詳細に記載されているマウスホルダー。

<table><tbody><tr><td>ケタミン(ナルケタン100 mg / ml)</td><td>ベトキノール</td><td>407575 0107 C</td>これ<td>の代わりに他の麻酔薬が使用される場合があります。.</td></tr><tr><td>メデトミジン(ドミトール1 mg / ml)</td><td>エランコ</td><td>134800-2</td>これ<td>の代わりに他の鎮痛薬を使用できます。.</td></tr><tr><td>鮮やかなDiD細胞ラベリングソリューション</td><td>Roche Products Ltd.</td><td>V22887</td><td>他の色もご用意しており、必要に応じてご使用いただけます。</td></tr><tr><td>Lacrilube点眼軟膏</td><td>アラガン</td><td>n / a</td>は<td>、地元の獣医</td></tr><tr><td>Kemdent「ダイヤモンドカーブ」グラスアイオノマーセメント</td><td>Associated Dental Products Ltd.を介してKemdentSUN527</td><td></td>を介して処方箋で利用可能です <td>私たちはシェードA3を使用していますが、セメントの任意のシェードを使用することができます。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>マルチ等価</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>テルモメディカルコーポレーション</td><td>SS10M3109 1</td><td>ml、31 G</td></tr><tr><td>マウス拘束具</td><td>ハーバード装置</td><td>340031</td><td>コーン型(小)</td></tr><tr><td>オートクレーブ鉗子とハサ</td>ミ <td>寒天科学</td><td>AGT577 AGT5034</td><td>アイリスハサミ - 90 mm;デュモンHPピンセット(0.06ミリメートル先端)</td></tr><tr><td>計量ボートとセメントスターラーVWR</td><td></td><td>611-1996/231-0370</td><td>5ミリリットル計量ボート(黒)/木製舌圧子</td></tr><tr><td>ライカSP5直立共焦点顕微鏡電動ステージと2光子レーザー</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td>ズ 見積もり<td>のための</td></tr><tr><td>呼び出し 25倍水浸対物レンズ(NA = 0.95)</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td>11506323 HCX IRAPO Lレンズ</td></tr><tr><td>カスタムデザインのマウスホルダー</td><td>インペリアルカレッジエンジニアリングワークショップ</td><td></td><td>詳細については図1を参照してください</td></tr><tr><td>直腸温度計プローブ付き加熱パッド</td><td>BASiインスツルメンテーション</td><td>FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td><td>ヒートマット/コントロールボックス/温度計プローブ</td></tr></tbody></table>

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

静止状態と増殖、自己再生と分化した子孫の生成との間の微妙なバランスにより、造血幹細胞（HSC）は、すべての成熟血液細胞系統の売上高を維持している。特定のHSCの運命につながる複雑な信号の調整は、HSCおよびまだ十分に理解されていない複雑な骨髄微小環境、[1-2]の間の相互作用に依存している。 私たちは、多段階の共焦点およびin vivoイメージング技術における二光子との安定した動物の位置決めのために新たに開発された試料ホルダを組み合わせることにより、高解像度の3D HSPCsを含むスタックとその周囲のニッチを取得し、時間をかけてそれらを監視することができる方法について説明多点タイムラプスイメージングを通して。高精細イメージングは、ex vivoでの検出を可能に骨髄内にある造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）を標識した。また、多点タイムラプス3Dイメージング、Oより速く取得設定でbtained、HSPCの動きとHSPCsと間質細胞との間の相互の相互作用に関する正確な情報を提供しています。 GFP陽性骨芽細胞に対するHSPCsの追跡は、この方法の応用例として示されている。この技術は、マウス頭蓋冠、骨髄空間内の関心のある任意の適切に標識された造血または間質細胞を追跡するために利用することができる。

特注は、頭蓋冠の観察窓を含む高精度なマウスホルダーは致死量の放射線を照射したレシピエントマウス（ 図1A）に注入され、FACS精製された、ラベルされたHSPCsの長期イメージングを可能にする。一般的に、15〜注射後 - 千20標識細胞、8から15の細胞は頭蓋骨の骨髄撮像領域内、通常、次の日認識可能である。特定さHSPCsの4Dタイムラプスムービー（ 図1Cおよび映画）に続いて120μmの厚さ、（ 図1B）、 -ここでは、約90のHSPC含有骨髄領域の単一細胞の解像度の3Dスタックを取得する方法を示します。 歯科用セメントを最適に準備ができていない場合、次善の結果が得られ、例えば、水、非密封領域から漏れる可能性があり、それは、ホルダの上部、レンズが浸漬されていない任意の期間から補充することができるにもかかわらず水の中に黒Fにつながる<html> rames。画像の一部のドリフトが、しかし、それはマウスの進行性の脱離​​につながる、次善のセメント接着によって強調され、セットアップイメージングの摂動によって、突然のジャンプにつながることができ、原因マウスホルダーの材料の熱膨張は避けられないタイムラプス撮影時の焦点。多点タイムラプスイメージングの間にドリフト以前に撮像された位置を再訪するときにも、ステージの動きの不正確によって引き起こされる場合があります。ドリフトおよび経時映画のスタッターアーチファクトが画像レジストレーションアルゴリズムを使用することによって補正することができる。 表1励起および発光の設定を行います。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> カラーチャンネル </td><td style="width:213px;"> 励起 </td><td style="width:208px;"> 放出 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488nmで</td><td style="width:208px;"> 500から530 nmの</td></tr><tr><td style="width:204px;">自己蛍光</td><td style="width:213px;"> 543 nmの</td><td style="width:208px;"> 560から610 nmの</td></tr><tr><td style="width:204px;"> DID </td><td style="width:213px;"> 633nmの</td><td style="width:208px;"> 640から700 nmの</td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840ナノメートル（MP） </td><td style="width:208px;"> 400から450 nmの</td></tr></tbody></table><img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> マウスの頭蓋冠におけるHSPCsの生体内の4Dイメージングでは 、図1。実験の（A）の概要（B - C）。得られた結果の例、（B）は 、3Dスタックからの2Dスライス（全体の深さは114μmで）、コラーゲン骨（白）からの信号を含む、ラベルされたなかった細胞（赤） 、自家CELLS（黄色）と、骨芽細胞（緑色）。スケールバー：骨芽細胞（緑色）の近くに移行するラベルされたDID HSC（赤色）を示す4Dタイムラプス映画から100μmの（C）は 、2Dスライス。点線は、セルの変位を強調しています。スケールバー：50μmの（B）及び100ミクロン（C）。注：（C）における経時的買収から得ムービーは、ビデオの記事中に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

本手順の目的は、造血幹細胞および前駆細胞（HSC）を含む高解像度3Dスタック画像を取得し、マルチポイントタイムラプスイメージングを用いてそれらを経時的に観察することである。まず、造血幹細胞および前駆細胞（HSC）を親油性染料で標識し、次いでこれらのHSCをレシピエントマウスに注入することでこれを達成する。マウスを顕微鏡観察に備え、動物を安定して固定するためのカスタムヘッドピースと試料ホルダーを用いて準備します。次に、造血幹細胞および前駆細胞ニッチの高解像度スタック画像を取得し、HSPCsを含む骨髄の複数の部位でタイムラプスイメージングを行います。最終的に、生体内共焦点および二光子顕微鏡を用いて、骨髄空間におけるHSCsの局在と移動を明らかにします。骨髄切片の免疫蛍光染色などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、3次元に時間を加えた4次元スケールで情報を捉えることができる点にあります。この手法の意義は、造血幹細胞が正しく機能するために骨髄内のどこに誘導する必要があるかを理解することに役立つため、血液疾患の治療にまで及びます。私たちがこの手法を考案したのは、造血幹細胞を長期的に追跡できることが極めて重要であると気づいた時でした。この手法は、幹細胞がどこに存在し、時間の経過とともにどのように振る舞うのかという、幹細胞ニッチ分野におけるあらゆる疑問に答える助けとなります。まず、当研究室が以前のgeoビデオで実演し、テキストプロトコルで言及している方法に従って、造血幹細胞および前駆細胞を回収します。次に、細胞懸濁液に親油性染料であるDIDを最終濃度5 µMとなるように添加します。染料が溶液から析出し、細胞の標識が不十分になるのを防ぐため、直ちに懸濁液をボルテックスします。細胞を洗浄するため、37°Cで10分間インキュベートします。まず500×gで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションで除去します。次に、細胞を200 µLのPBSで再懸濁し、インスリン用注射器に回収します。インスリン用注射器は針の死腔がないため、通常の注射器よりも推奨されます。これにより、致死量の中性子線を照射したマウスの尾静脈注入において、細胞懸濁液の全量を投与することが可能になります。まず、マウスを保温チャンバーに入れます。尾静脈が拡張して視認できたら、マウスを拘束具に入れます。針を慎重に尾静脈に挿入し、静脈内に細胞を注入します。注入時に抵抗感がないことを確認してください。マウスを一晩静置します。細胞を骨髄腔に遊走させるため、マウスを麻酔し、足底反射によって深い麻酔状態に入ったことを確認します。ティッシュに70% ethanolを浸し、頭頂部を拭きます。マウスの目にethanolが入らないように注意してください。イメージングを行う頭蓋冠領域を露出させるため、ピンセットで皮膚を持ち上げたまま、耳の間の後頭部で皮膚をわずかに切開します。皮膚の下にハサミを滑り込ませ、目的の撮像領域の外側に沿って慎重に切開します。露出した骨を滅菌PBSで湿らせた滅菌綿棒で拭き、骨の湿潤状態を維持します。これにより、撮像品質に影響を及ぼす可能性のある過度な乾燥や瘢痕形成を防ぎます。次に、歯科用セメントを適切な量とり、ウェーボートの中でペースト状になるまで混合します。これを、頭蓋骨に取り付けるオートクレーブ製ヘッドピースの底面に素早く塗布します。セメントが硬化する前に、イメージング領域にセメントが付着しないように注意しながら、マウスの頭蓋骨にヘッドピースを配置し、硬化するまで待ちます。頭蓋骨を湿った状態に保つため、少量のイントラハイドロゲルを塗布します。この際、乾燥中のセメントを乱さないよう注意してください。次に、ヘッドピースをホルダーに取り付け、固定します。ネジを使用し、溝がホルダーの切り欠きに適切に収まっていることを確認してください。顕微鏡に移す前に、滅菌綿棒でハイドロゲルを除去します。次に、ホルダーを顕微鏡ステージに挿入し、マウスの下にヒーティングマットを配置します。直腸温度計のプローブを挿入し、ステージ上のすべてのものを粘着テープで固定します。麻酔下で眼球が乾燥しないように、マウスの目に眼科用軟膏を少量塗布します。麻酔下でのイメージングプロセス中、マウスを一度も unattended（放置）にしてはいけません。接眼レンズを介して頭蓋骨に焦点を合わせます。まず、水浸レンズを用いて、頭蓋冠イメージングウィンドウを精製滅菌水で満たします。レンズを下げて、水滴に接触させます。顕微鏡の接眼レンズを使用して、頭蓋骨の頂点に焦点を合わせます。イメージング領域を正中縫合線上に配置し、頭部の後方へ移動させて冠状縫合線を探します。開始位置として、ソフトウェアをXY画像および3枚のDZスタックをキャプチャするモードに設定します。イメージング速度を400 hertzに、解像度を512 by 512 pixelsに設定します。ソフトウェアで複数チャンネルをキャプチャするように設定し、収集方法をスタック間またはフレーム間で設定を変更するように設定します。3つの独立したキャプチャ設定を構成します。各スタックの取得終了時にレーザー照明をオフにします。次に、2光子第二高調波発生（SHG）骨信号の最初のシーケンシャルスキャンを設定します。マルチフォトンのレーザーシャッターを開き、マルチフォトンのレーザーゲインとオフセットが正しく設定されていることを確認します。また、レーザー出力が12.5から25%であり、レーザーがオンになっていることを確認してください。唯一の検出器として適切なPMTを選択し、色を白に変更します。2番目の設定で、共存する自家蛍光とDIDに対してチャンネルセットアップ手順を繰り返します。2つの適切なPMTを利用してスキャンを行います。チャンネルの色を、自家蛍光には緑色、DiDには赤色に変更します。最後に、GFP検出のための3番目かつ最終のスキャンを設定します。488 nanometerのレーザーラインのレーザー出力を約15%に設定します。唯一のアクティブな検出器として適切な光電子増倍管（PMT）を選択し、その擬似カラーを緑色に変更します。ライブイメージングモードを有効にして、選択したチャンネルのプレビュースキャンを開始し、検出器のゲインとオフセットを調整して最適な露光量に設定します。シーケンシャルウィンドウ内の各スキャンについてこの操作を繰り返し、これらのマルチチャンネルスキャンの設定を保存して簡単に再利用できるようにします。次に、本ソフトウェアで「マーク＆ファインド（mark and find）」と呼ばれるマルチポジションキャプチャを有効にし、座標点をリセットします。次に、中心縫合と冠状縫合の交点から骨イメージング領域をスキャンします。複合ビューを用いて、自家蛍光とDiDの両方で骨髄領域の深さをスキャンしてください。細胞が検出されたら、マーク＆ウィンドウの左側にある「新しいポジションを追加」アイコンをクリックし、これを新しい座標位置としてマークします。現在の視野の観察が完了したら、ステージを視野1つ分だけ移動させます。各視野についてこの操作を繰り返してください。中心縫合の左側にある撮像ウィンドウ全体を、マウスの鼻に向かって徐々に走査します。正中縫合線の分岐点が見えたら、縫合線の右側に移動して同様の手順を繰り返します。その後、左側を逆方向にスキャンします。「マークおよび検索（mark and find）」ツールを使用して、新たに見つかった目的の細胞の座標をマークしてください。各ポジションの各細胞について、Zスタックの上下限を設定し、ポイントを確認します。各ポイントでピントを上下に合わせ、3つのDZスタックキャプチャのためのZ位置の上限と下限を設定します。「マーク＆ファインド」の個別のポイントを更新し、Z軸の間隔を5 µmに設定し、各シーケンシャルスキャンチャネルの平均化を適切な品質に設定します。全スキャン手順を開始し、各関心点について高品質なリファレンススタックを取得します。高品質スキャンが完了したら、キャプチャおよびタイムラプス設定でタイムラプス機能を有効にします。時間間隔を5分に、全体の実行時間を任意の長さに設定してください。これらの設定をスキャン全体に適用します。この例では、3点以上の取得方法を示しています。これらの設定を変更し、平均化に使用するスキャン回数を減らし、解像度を512 × 512ピクセルに制限することで、スキャン時間を短縮し、5分間隔のタイムラプス撮影を可能にできます。また、スキャンを双方向に変更するか、スキャン速度を600 hertz以上に上げることで、同様にソフトウェアのスタートボタンをクリックしてイメージングを開始します。イメージングが完了したら、テキストプロトコルに従ってマウスを安楽死させます。頭蓋冠イメージングウィンドウを備えた特注の高精度マウスホルダーを使用することで、致死量照射後のレシピエントマウスに注入した標識済みHS PCの長期間のイメージングが可能になります。ここに示しているのは、厚さ約90～120 µmのHSPCを含む骨髄領域の、単一細胞分解能の3Dスタックの2Dスライスです。コラーゲンからの信号による骨は白で、DiD標識細胞は赤で示されています。自家蛍光細胞を黄色、骨芽細胞を緑色で示しています。ここでは、赤色で標識されたDIDラベル付きHSCが、緑色の骨芽細胞の近傍を遊走する様子を示す、HS PCを特定した40倍のタイムラプス動画を示しています。習熟すれば、この手法は手術と初期イメージングに約1時間、その後タイムラプスイメージングに適切な時間をかけて実施できるはずです。このビデオを視聴することで、マウスのふくらはぎのイメージング設定および、時間の経過に伴う複数のHS PCの観察を自信を持って行えるようになるはずです。

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生物学

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成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

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