生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

本実験の目的は、透過電子顕微鏡で観察するために、生物学的材料またはその他の材料のカーボン・プラチナ標本レプリカを作製することである。これを実現するため、ダブルレプリカおよびシングルレプリカとして作製した標本を、氷結晶の形成を抑えるために超急速冷凍する。その後、高真空下で液体窒素温度において、リモート操作により凍結標本を破断させる。これにより、脂質二重層を通じて膜が分裂し、細胞外側と細胞質側に近い面が形成される。

オプションの追加ステップとして、冷却マイクロトームアームを試料ステージの上に配置して温度差を作り出し、表面から水を昇華させることで、破断試料の表面にある潜在的な構造を明らかにできます。次に、破断面にカーボンと白金を蒸着させてレプリカを作成します。

レプリカから元の試料を消化させ、透過電子顕微鏡用の試料グリッド上に回収します。最終的に、凍結破砕凍結エッチングを用いて、透過電子顕微鏡観察により細胞膜、分子配列、およびナノ材料の三次元的な構造詳細を明らかにします。超薄切片の観察などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、目的の対象物を電子顕微鏡分解能で三次元的に観察できることです。

この手法は、細胞膜の次元的および構造的特性や、分子およびナノ材料アレイの組織化など、細胞・分子生物学およびナノテクノロジー分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私がこの手法を考案したきっかけは、真核原生生物を用いた同様の研究で重要な発見がなされている一方で、ヒトの健康に関連するテーマへの注目が限られていることに気づいたことでした。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、凍結破断面および凍結エッジ観察用の生物学的試料の調製からこの手順を開始してください。

微細ピンセットまたは細ゲージの注射針を用いて、処理する試料に適したサイズと形状の金または銅の試料スタブを選択します。試料の小さな断片を金属試料スタブの上に配置します。シングルレプリカの場合は、フィルターペーパーでスタブの端から液体を吸い取り、試料の液体含有量を減らして、粘り気のある、わずかに接着剤のような硬さに調整します。

二重レプリカを作成する場合、細ゲージの注射針を用いて、スタブ上に組織を盛り上げます。別のスタブを反転させ、元のスタブの真上に正確に配置し、試料表面に軽く載せます。これにより、サンドイッチ構造を作成します。

2つのスタブの間から試料を押し出さないでください。次に、2つの断熱二重容器に液体窒素を満たします。1つ目の容器には、小さなウェルを備えた金属製ポストを収め、市販のシリンダーから少量のプロパンガスを液化させるために使用します。

2つ目の容器は、液体窒素下で凍結試料を短時間保持するための仕切り付き保存容器です。プロパンは、その使用が認定された化学用フード内でのみ使用してください。プロパンは爆発性があるため、外部の火気を避け、低温保護衣を着用し、適切な換気を維持するように注意してください。

接触により凍傷を引き起こす可能性があり、窒息性物質です。プロパンの中に配置したシリンダーノズルを使用し、シリンダーバルブを十分に開いて、ガスを1つ目の容器のウェルに流し込み、できるだけ速やかに液化させます。微細鑷子（ピンセット）で標本台を掴み、1つ目の容器内の液化ガスに数秒間浸します。

その後、速やかに2つ目の液体窒素保持容器に移します。試料が凍結したら、凍結破断装置へ移すまで液体窒素下で保存します。液体窒素下で、金コーティング試料スタブをブックレット型の二重レプリカ試料ホルダーまたはクランプ装置にセットし、試料室に設置するまでそのまま保持します。

チャンバー内が高真空になり、ステージが液体窒素温度に到達したら、ポンプを停止してチャンバーをベントし、マウントした試料スタブをできるだけ速やかに試料台に設置してください。その後、ポンプを再稼働させて高真空状態を復帰させ、電子ステージおよびアームの温度制御を用いて、試料台の温度を-100 °Cに調整します。また、ミクロトームアームに液体窒素を導入し、液体窒素温度まで冷却してください。

高真空に達した後、ステージ温度を-100°Cに、マイクロトームアームを液体窒素温度に設定し、遠隔操作でダブルレプリカ試料ホルダーを開くことで、試料マウント上の試料を破断させます。オプションの追加ステップとして、破断後にエッチングを行い、内部構造を露出させることができます。エッチングを行うには、マイクロトームアームのクランプに固定したカミソリを用いて、試料の表面を削ります。その後、冷却されたマイクロトームアームを破断面に1分から数分間 positioning し、水分を昇華させることで、実際の細胞表面、細胞外マトリックス、または分子集合体を露出させます。

次に、白金・カーボン電子銃または抵抗加熱銃を起動し、破断面に対して30度から45度の角度で白金カーボンの薄層を蒸着させます。通常、これには約15〜20秒を要します。続いて、同様の手順でカーボン電子銃または抵抗加熱銃を起動し、レプリカを支持するために、破断試料表面に対して真上（90度）からカーボンの薄層を蒸着させます。レプリカ作成、シャドウイング、およびカーボン安定化の完了後、この工程にも通常約15〜20秒を要します。

真空ポンプとチャンバーの電源を切り、装置から試料台を取り出します。精密ピンセットを用いて、ダブルレプリカブックレットクランプから各金試料スタブを取り出し、数秒間解凍させた後、スポットプレート内の水面にスタブをゆっくりと下ろします。細いワイヤーループまたは精密ピンセットで保持した標準的な銅製電子顕微鏡グリッドを用いてレプリカを操作し、5%重クロム酸ナトリウム／50%硫酸を含む別のスポットプレートに移し、1時間から数時間放置します。このバス処理により、レプリカから実際の生物試料物質が消化されます。

消化が完了したら、レプリカを再びきれいな水面に移し、標準的な銅製電子顕微鏡グリッド上に回収します。レプリカ支持グリッドは市販のグリッドボックスに保管してください。これにより、数年間にわたって安定した状態で保存されます。凍結破断エッチングレプリカの慎重な取り扱いまたは超微形態観察では、通常50から80 kilovoltsの加速電圧の透過電子顕微鏡でレプリカを観察します。

標準的なTEMフィルムまたは高解像度デジタルカメラを用いて、関連する画像を記録します。各真核生物の基部の細胞膜に、繊毛および鞭毛の膜結合粒子がストランド状に配列し、繊毛のシャフトを囲むように配置されており、これは繊毛ネックレスとして知られています。繊毛形成（Clio Genesis）過程にある上皮細胞の管腔境界には、特殊な膜粒子アレイが現れます。

これらの粒子配列は、新生した繊毛ネックレスを表しており、これは形成途上の繊毛および成熟した繊毛の基部に位置しています。さまざまな上皮細胞の凍結破断研究により、基底外側境界のアピカル側に囲む、吻合するストランド（線状構造）とグルーブ（溝状構造）の精巧な組織化が明らかになっています。上皮細胞膜を破断すると、密接結合の細胞膜側破断面がストランドとして現れ、一方で細胞外破断面にはそれと相補的なグルーブが現れます。

ギャップ結合は、さまざまな組織の凍結破断標本に見られ、細胞膜破断面上の高密度な粒子配列と、細胞外破断面上の相補的なピットとして表現されます。ここでは、ディープエッチングおよび回転シャドウイングを用いた急速凍結の例を示します。上皮細胞は細胞質で破断されており、矢印の先に細胞膜破断面が確認できます。

後続のエッチングにより、真の細胞表面が明らかになります。この手法を習得すれば、適切に実施することで、約3時間のサイクルで1〜3個の検体を製作することが可能です。この手順を行う際は、個々のステップが非常に密接に関連しており、ある1つのステップでのミスが、現像後の検査および評価に不十分な結果を招く可能性があることに留意することが重要です。

この手法により、細胞・分子生物学分野の研究者は、遺伝子変異がどのように細胞に構造的な異常をもたらし、それが病理学的状態や疾患を誘発するのかを探索することが可能となりました。