Name: 生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶフリーズフラクチャー/フリーズエッチング技術による生物試料の電子顕微鏡観察法。超速凍結と真空下での破断・エッチングにより、膜の超微細構造を三次元的に可視化し、細胞分子生物学と材料科学の研究に貢献します。

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このプレゼンテーションは、フライトアテンダント医学研究所からのJLCへのクリニカルイノベーター賞と、米国環境保護庁によって支援されました。 この記事で説明されている研究は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の環境医学、喘息、肺生物学センターとの協力協定CR83346301を通じて、米国環境保護庁によって全体的または部分的に資金提供されていますが、機関が要求するピアレビューやポリシーレビューの対象にはなっていません。 したがって、必ずしもIAEAの見解を反映しているわけではなく、公式の支持を推測すべきではありません。 商号または商用製品への言及は、使用を推奨または推奨するものではありません。

フリーズフラクチャー/フリーズ·エッチングのための生物試料の調製<ol><li>そのような1時間0.1 Mリン酸緩衝液中の2％グルタルアルデヒド+ 2％パラホルムアルデヒドのような従来のEM固定剤製剤を使用する。生体組織の主要な固定を行う。注：それは前に固定せず標本のいくつかのタイプを凍結することが望ましいかもしれないが、ユニバーサル血液媒介病原体の予防措置は、検体がヒトの組織で構成され、適切な固定を義務付ける。 </li><li>一次固定に続いて、わずか1時間、0.2Mのスクロースを補充した同じ緩衝液中の試料をすすぐ。 </li><li> 1時間を超えない、0.1 Mリン酸緩衝液中の25％グリセロールからなる凍結防止剤溶液に試料を移す。 </li></ol>凍結破砕の前に2。凍結と標本の保存<ol><li> （ 図4適切な大きさの金や銅試料スタブを選択して、処理中の試料について形状</st栄&gt;）。 </li><li>金属試料スタブの上に試料の位置の小さな断片が細かいグレードの鉗子および/または小ゲージの注射針を使用した。 <ol><li>少しろ紙とスタブの端から液体を抜き取ることにより、一貫性のような接着剤、粘着性の試料の液体含有量を減らします。 </li><li>単一レプリカの場合、スタブ上で組織のマウンドを作成するには、小さなゲージの注射針を使用しています。ダブルレプリカの場合は、それを正確にスタブを介して別のスタブと位置を反転し、サンドイッチ（ 図5A）を作成する試料面上に軽く置きます。 2つのスタブ間から外に標本を押さないでください。 </li></ol></li><li>液体窒素で2つの絶縁デュワー容器を埋める。注：最初の容器は市販のシリンダ（ 図5B）からプロパンガスの小容量を液化するために使用される小さなウェルを含む金属ポストを収容する。第二の容器は短いため、パーティションのストレージ/保持容器であるLY液体窒素下で凍結した標本を維持する。 <ol><li>プロパンウェル内に配置シリンダーノズルを用いて、シリンダーバルブを開き、ガスがそれを液化する最初の容器のウェル内に流れることを可能にする。注：注意！プロパンは触れた場合の傷害を凍結原因かもしれません、爆発され、窒息されています。唯一のそのような使用は、低温に対する防護服を使用し、また、外部からの発火源を避けるように注意しながら、十分な換気を維持するために認定された化学フード内でプロパンを使用してください。 </li><li>可能な限り迅速に、試料が細かいグレードの鉗子でマウントしてからすぐに液体窒素の第二の保持容器（ 図5B）に転送数秒間最初の容器内で液化ガスにそれを突入拾う。 </li><li>標本が凍結されると、直前まで、液体窒素下で店がフリーズフラクチャープラントへ転送します。拡張のための大規模なストレージ液体窒素デュワー容器にスタブを転送必要に応じて、しかし気にストレージはスタブが解凍させないように注意してください。 </li></ol></li></ol>凍結破砕装置と試料の処理の3。運用<ol><li>真鍮のホルダーにチャンバ内に検体をロード<ol><li>冊子型ダブルレプリカ標本ホルダーにゴールドの試料スタブをロードするか、液体窒素下でデバイスをクランプし、試料室（ 図6）に配置するために準備ができるまでそこに維持する。 </li><li>チャンバーは高真空（約2×10 -6ミリバール）を達成しており、ステージがチャンバーベント、ポンプの電源を切り、液体窒素温度まで冷却し、可能な限り迅速に試料台に取り付けられた試料スタブを配置している場合。 </li><li> 、ポンプの電源を入れ、高真空を再確立し、ミクロトームアームおよびBRIに試料台を-100℃までの温度と直接液体窒素を調整する電子ステージとアーム温度制御を使用液体窒素温度にngの。 </li></ol></li><li> 破壊過程 <ol><li>高真空、液体窒素温度で-100ºCとミクロトーム腕のステージ温度を達成すると、リモートで、それによって試料マウント（凍結fracture_movie1.mov）上の検体を破砕ダブルレプリカ試料ホルダーを開きます。 </li><li>エッチング後の骨折のために意図標本の場合には、（ すなわち、骨折）を剃ることミクロトーム腕にクランプで維持カミソリの刃を使用してステップ3.2.1の代わりに、試験片の表面（凍結etch_movie2.movを）。 </li><li>加え凍結エッチング工程が実行される場合には、数分に1ための破断面上に冷却したミクロトームアームを位置決めする。注：この機動は破断面から（ すなわち、エッチング）水を昇華されます。この手技の効果は、FRAに加えて、水の昇華によって真の細胞表面、細胞外マトリックス、および/または分子集合体を明らかにすることである影は、膜の脂質二重層を通過する対向する。 </li></ol></li><li> 電子銃を用いた金属シャドウイングとレプリカ支援蒸発 <ol><li>白金/炭素型電子銃や抵抗をアクティブにし、それが30°の角度から破断面の上に白金​​/カーボンの薄層（約2nm）を蒸発させる - 45°。 20秒 - これは典型的には約15を必要とします。 </li><li>ステップ3.3.1のように、炭素の電子や抵抗銃をアクティブにして、レプリカに支援を与えることを真上（90°）から破砕試料表面に炭素の薄い層を蒸発させる。 20秒 - これは典型的には約15を必要とします。 </li></ol></li><li>レプリカの検索<ol><li>レプリケーションのシャドーイングと炭素の安定化が完了すると、真空ポンプの電源を切り、チャンバーベント、試料が装置からマウント取り外します。 </li><li>細かいグレードのピンセットを使用すると、doubleから各金試料スタブを削除レプリカブックレット/クランプと静かにスポットプレート（ 図7）で水面上にスタブを下げる前に、数秒間に解凍することができます。注：接着性試料材料を含有する炭素/白金レプリカが水面上に浮遊する。 </li><li>細いワイヤループまたは微細グレードの鉗子と、1〜数時間のために50％硫酸中の5％重クロム酸ナトリウムを含む別のスポットプレートに移すことによって保持された従来の銅電子顕微鏡グリッドのいずれかを使用してレプリカを操縦。注：この浴はレプリカから実際の生体試料材料を消化する。完全な強度の家庭用漂白剤は、重クロム/硫酸溶液の代わりに用いてもよい。 </li><li>消化が完了すると、きれいな水の表面に戻って複製を転送し、標準的な銅の電子顕微鏡グリッド上に取り出す。 （注：レプリカは、消化中に小片に断片化するかもしれないが、でも非常に小さなレプリカが、実質的な情報を含んでいてもよく、RETRであるべき彼らは穏やかな取り扱いに年間安定残る市販のグリッドボックス内のグリッドをサポートしています。）お店のレプリカをievedと検討した。 </li></ol></li></ol>フリーズフラクチャー/エッチレプリカの4微細構造の検討<ol><li> 80 kVの - 典型的には50から加速電圧での透過型電子顕微鏡での表示のレプリカ。 </li><li>標準のTEM膜上または高解像度デジタルカメラで、関連する画像を記録します。 </li></ol>

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著者は開示するものは何もありません。

その導入および商業的入手次の年では、フリーズフラクチャー/エッチングの手順は、広く、生物学的膜構造の調査のために利用した。実際、膜の構造の専門分野のいくつかの最高の視点がフリーズフラクチャー/エッチ製剤において得られている。これらの研究は、膜の構造組織の理解に貢献しただけでなく、構造と機能がどのように関連しているかについての洞察を提供していないだけ。 日常的な生物学的電子顕微鏡の出現は、生物学的標本に差電子密度を付与するために必要なアルデヒド固定剤、反応性化学物質、重金属と化学処理自体がアーティファクトの生成に寄与していることを意識をもたらした。フリーズフラクチャー技術の開発は、処理アーティファクトを減少させるために部分的に基づいていた。それにもかかわらず、そのフリーズフラクチャーが認識されている/エッチ氷の結晶の損傷である主要な一つはアーティファクトの独自のセットが導入されています。組織に起因超微細ディテールを消し去る氷晶の形成をもたらす検体の周囲の窒素ガスの絶縁層の形成に液体窒素の経験に直接縮小冷却速度が急落した。この問題は、グリセロールなどの凍結保護剤を用いて、液体窒素冷却プ...

概念と生物学的標本の凍結破砕処理の実用化は、半世紀以上前スティア1によって導入された。初期の装置は、作業内蔵ユニット1内に異種のコンポーネントを流用。元の装置は遠隔操作、高真空の維持、および透過型電子顕微鏡による検査に適したレプリカを生成するために、炭素、金属の蒸発（ 図1および図ための重要な必要性に対応するために、市販の器具に変更し、精製した2）。 典型的な器具は、試料台及びミクロトームアーム調節性液体窒素スループットを有する（ 図1）と高真空チャンバから構成されている。室内には、試料ステージに90°の角度やプラティのための他に位置炭素の蒸発を安定化するための2つの電子銃、1を収容45°（ 図2） -調節可能な角度、通常は15°で、シャドーイングNUM /カーボン。ユニットへの電力は、温度調整及び電子銃制御を調節する真空ポンプおよび電子パネルを操作するために適用される。 本来のウイルスの改善されたイメージングを達成するために考え出され、凍結破壊は、細胞膜及びその特殊化2,3の検査および分析のための技術として、さらに多くの人気を得た。実際に、この手順では、細胞や組織内の構造/機能の関係を解明に不可欠であったと、これらの研究の多くは、細胞生物学および分子生物学4-9に古典的な貢献として立っている。フリーズフラクチャー法の開発のための主要な目標と原理は、従来の生物学、電子顕微鏡で使用される化学固定および処理に由来する電子顕微鏡の分解能で観測アーティファクトを制限することであった。ここでの目標は、化学物質を制限することです固定は、十分な速度で、頻繁に氷の結晶の形成やその他の冷凍アーティファクトを制限するために、凍結防止剤の存在下で試料を凍結すると。さらに最近では、この技術は、ナノ粒子とナノ材料の検査のための分子生物学者と材料科学の研究者からの関心の復活を発見した。 凍結破砕し、凍結エッチ画像が3次元キャラクタを示し、時には走査型電子顕微鏡写真を間違わある。しかし、フリーズフラクチャー製剤は、透過型電子顕微鏡によって検査され、高解像度の形態学的研究への主要な貢献は、細胞膜の構造/機能要素の独自の表現である。凍結破砕処理および/またはグリセロールなどの凍結保護剤を用いて氷の結晶化を制限するために十分な速度で、細胞および組織を凍結することによって開始される。標本を真空と担当者の下で破断しているLICAは破断面上に炭素と白金の蒸発によって生成される。オリジナルの標本は、標準のEM標本グリッド上に検索されるレプリカから消化される。フリーズフラクチャー画像の別の一般的な誤解は、それらが細胞表面を描写することである。フリーズフラクチャーの基本的な前提は、生体膜の破壊過程（ 図3）によって脂質二重層を通して分割されるということですが。生体膜のこのプロセスは、2つの破断面を、外に隣接する二分子膜のリーフレットの半分を明らかに細胞質、PF-面に隣接する膜の半分の編成を明らかにする一つを生じる環境、EF-顔。真の細胞表面は、フリーズフラクチャー画像に表さなく破壊手順に従って凍結エッチングの後に添加ステップが使用される場合にのみ表示されていない。効果的に表面detaiを明らかにするために以前に破断試験片をエッチングするためにlは、試験片を急速にかつunetchablecryoprotectantずに凍結されている必要があります。根本的な特徴を明らかに骨折した試料表面からの水のエッチングは、試料を保持するステージとの間の温度差を生成する試料ステージ上に冷却ミクロトームアームと、表面から昇華させる冷却水をミクロトームアームを位置決めすることによって達成される。水が凍結エッチング操作中、骨折片の表面から昇華した場合、実際の細胞表面、細胞外マトリックス、細胞骨格構造、および分子集合体の側面は、高解像度で明らかにすることができる。このように凍結破砕し、凍結エッチングは互換用語ではなく、むしろ特定の研究の必要性に応じて必要または望ましくないかもしれない後者は段階的なプロセスを反映している。 フリーズフラクチャー/凍結エッチ手順に従って、破断面が向けられevaporaに供されるレプリカへのサポートおよびイメージングのコントラストを提供するために、炭素と白金のコートを電性。白金/炭素イメージング蒸発は、単方向または回転式であってもよく、抵抗または電子銃のいずれかによって達成される。既知の角度からの単方向シャドウイングは、通常は30° - 45°、特定の形態学的計算を行うのに有用である。ディープエッチングが施された試験片は、一般的に陰に回転式であり、これらの検体の結果画像は、写真的に評価のために逆になっている。 フリーズフラクチャー/凍結エッチング技術の歴史だけでなく、現在の目標は、より従来型の透過型電子顕微鏡の手続きに関連している化学固定および処理試料アーティファクトを制限することである。しかしながら、この技術は、三次元ディテールを付与するため、生物学、材料科学における形態計測データの取得を容易にする能力において実質的な利点を提供し、そしてnanotechnology標本。骨折、凍結および凍結エッチ手順は複雑かつ多面的であり、その応用のいくつかの側面がカスタマイズされています。このプレゼンテーションでは、プロセスの主な機能の調査ビューを提供しており、読者は細部に対処し、特定の研究ニーズに合わせてプロセスをカスタマイズするために、包括的に公開されたプロトコル10、11と呼ばれている。

<table><tbody><tr><td>バルザース 凍結破壊/凍結エッチングプラント</td><td>バルザース</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>標準バッファー</td><td>各種サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>標準アルデヒド固定剤</td><td>各種サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重クロム酸ナトリウム</td><td>各種サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>各種サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨て用品プラチナ/カーボンエバポレーション</td><td>テクノトレード 国際</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>各種サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロパン</td><td>各種サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡用使い捨て用品</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

自然の中での試料、典型的には、生物学的またはナノ材料、骨折し、凍結し、カーボン/プラチナ &quot;キャスト&quot;透過型電子顕微鏡による検査のために意図を生成するために複製されることにより、フリーズフラクチャー/凍結エッチングは、プロセスについて説明します。試験片を液体窒素で試料のその後の破砕と、氷晶形成を制限するために凍結保護剤の存在下で、多くの場合、超高速凍結速度が施され、高真空下で高温に冷却した。生じた破断面には鋳造、表面の三次元詳細を与える角度から炭素と白金の蒸発によって複製され、安定化される。この技術は、細胞膜とその専門分野の研究に特に啓発証明していると、関連する細胞機能に対する細胞の形の理解にかなり貢献してきました。本稿では、実行するための機器の要件や技術的なプロトコルを調査凍結骨折、関連した用語と、破断面の特性、フリーズフラクチャー画像の解釈のための従来の手順のバリエーション、および判定基準。この技術は、広く細胞生物学の多くの分野での超微細構造の調査のために使用され、分子、ナノテクノロジーのための新たなイメージング技術として有望であり、材料科学の研究されています。

フリーズフラクチャーの読影の鍵前提は、破断面が規則PF-面（プラズマ破断面）とEF-面（外破断面）（ 図によっていわゆる二破断面を付与する膜の脂質二重層を通過することである3）。 PF-faceが細胞の細胞質およびEF面に隣接する膜脂質二重層の半分が細胞外環境に隣接した膜脂質二重層の半分である。フリーズフラクチャー法は、膜構造の調査のために特に有用であり、二つの面は、一般的にPF-面が少なく含まれているEF-顔とは対照的に、多くの膜会合粒子が取り込まれているとはっきり異なっている。凍結破砕細胞の細胞質の内容は、一般的に外観が粗く、そのような核やゴルジのような膜結合オルガネラが容易に識別できるが、特に明らかにされていません。特に興味深いのは、INVEするこの技術を使用stigatorsは、その機能のために解釈することができる膜構造の特殊化である。これらは膜結合粒子、繊毛膜の専門分野、および細胞間の接合部の特定のディストリビューションが含まれています。 繊毛関連構造 <p class="jo...

基本的な技術および透過型電子顕微鏡による検査のための生体試料とナノ材料のフリーズフラクチャー処理の改良が記載されている。この技術は、生体膜の超微細構造の特徴と専門性を明らかにするため、材料科学、ナノテクノロジー製品の超微細構造レベル次元の空間データを取得するための好ましい方法である。

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

本実験の目的は、透過電子顕微鏡で観察するために、生物学的材料またはその他の材料のカーボン・プラチナ標本レプリカを作製することである。これを実現するため、ダブルレプリカおよびシングルレプリカとして作製した標本を、氷結晶の形成を抑えるために超急速冷凍する。その後、高真空下で液体窒素温度において、リモート操作により凍結標本を破断させる。これにより、脂質二重層を通じて膜が分裂し、細胞外側と細胞質側に近い面が形成される。オプションの追加ステップとして、冷却マイクロトームアームを試料ステージの上に配置して温度差を作り出し、表面から水を昇華させることで、破断試料の表面にある潜在的な構造を明らかにできます。次に、破断面にカーボンと白金を蒸着させてレプリカを作成します。レプリカから元の試料を消化させ、透過電子顕微鏡用の試料グリッド上に回収します。最終的に、凍結破砕凍結エッチングを用いて、透過電子顕微鏡観察により細胞膜、分子配列、およびナノ材料の三次元的な構造詳細を明らかにします。超薄切片の観察などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、目的の対象物を電子顕微鏡分解能で三次元的に観察できることです。この手法は、細胞膜の次元的および構造的特性や、分子およびナノ材料アレイの組織化など、細胞・分子生物学およびナノテクノロジー分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私がこの手法を考案したきっかけは、真核原生生物を用いた同様の研究で重要な発見がなされている一方で、ヒトの健康に関連するテーマへの注目が限られていることに気づいたことでした。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、凍結破断面および凍結エッジ観察用の生物学的試料の調製からこの手順を開始してください。微細ピンセットまたは細ゲージの注射針を用いて、処理する試料に適したサイズと形状の金または銅の試料スタブを選択します。試料の小さな断片を金属試料スタブの上に配置します。シングルレプリカの場合は、フィルターペーパーでスタブの端から液体を吸い取り、試料の液体含有量を減らして、粘り気のある、わずかに接着剤のような硬さに調整します。二重レプリカを作成する場合、細ゲージの注射針を用いて、スタブ上に組織を盛り上げます。別のスタブを反転させ、元のスタブの真上に正確に配置し、試料表面に軽く載せます。これにより、サンドイッチ構造を作成します。2つのスタブの間から試料を押し出さないでください。次に、2つの断熱二重容器に液体窒素を満たします。1つ目の容器には、小さなウェルを備えた金属製ポストを収め、市販のシリンダーから少量のプロパンガスを液化させるために使用します。2つ目の容器は、液体窒素下で凍結試料を短時間保持するための仕切り付き保存容器です。プロパンは、その使用が認定された化学用フード内でのみ使用してください。プロパンは爆発性があるため、外部の火気を避け、低温保護衣を着用し、適切な換気を維持するように注意してください。接触により凍傷を引き起こす可能性があり、窒息性物質です。プロパンの中に配置したシリンダーノズルを使用し、シリンダーバルブを十分に開いて、ガスを1つ目の容器のウェルに流し込み、できるだけ速やかに液化させます。微細鑷子（ピンセット）で標本台を掴み、1つ目の容器内の液化ガスに数秒間浸します。その後、速やかに2つ目の液体窒素保持容器に移します。試料が凍結したら、凍結破断装置へ移すまで液体窒素下で保存します。液体窒素下で、金コーティング試料スタブをブックレット型の二重レプリカ試料ホルダーまたはクランプ装置にセットし、試料室に設置するまでそのまま保持します。チャンバー内が高真空になり、ステージが液体窒素温度に到達したら、ポンプを停止してチャンバーをベントし、マウントした試料スタブをできるだけ速やかに試料台に設置してください。その後、ポンプを再稼働させて高真空状態を復帰させ、電子ステージおよびアームの温度制御を用いて、試料台の温度を-100 °Cに調整します。また、ミクロトームアームに液体窒素を導入し、液体窒素温度まで冷却してください。高真空に達した後、ステージ温度を-100°Cに、マイクロトームアームを液体窒素温度に設定し、遠隔操作でダブルレプリカ試料ホルダーを開くことで、試料マウント上の試料を破断させます。オプションの追加ステップとして、破断後にエッチングを行い、内部構造を露出させることができます。エッチングを行うには、マイクロトームアームのクランプに固定したカミソリを用いて、試料の表面を削ります。その後、冷却されたマイクロトームアームを破断面に1分から数分間 positioning し、水分を昇華させることで、実際の細胞表面、細胞外マトリックス、または分子集合体を露出させます。次に、白金・カーボン電子銃または抵抗加熱銃を起動し、破断面に対して30度から45度の角度で白金カーボンの薄層を蒸着させます。通常、これには約15〜20秒を要します。続いて、同様の手順でカーボン電子銃または抵抗加熱銃を起動し、レプリカを支持するために、破断試料表面に対して真上（90度）からカーボンの薄層を蒸着させます。レプリカ作成、シャドウイング、およびカーボン安定化の完了後、この工程にも通常約15〜20秒を要します。真空ポンプとチャンバーの電源を切り、装置から試料台を取り出します。精密ピンセットを用いて、ダブルレプリカブックレットクランプから各金試料スタブを取り出し、数秒間解凍させた後、スポットプレート内の水面にスタブをゆっくりと下ろします。細いワイヤーループまたは精密ピンセットで保持した標準的な銅製電子顕微鏡グリッドを用いてレプリカを操作し、5%重クロム酸ナトリウム／50%硫酸を含む別のスポットプレートに移し、1時間から数時間放置します。このバス処理により、レプリカから実際の生物試料物質が消化されます。消化が完了したら、レプリカを再びきれいな水面に移し、標準的な銅製電子顕微鏡グリッド上に回収します。レプリカ支持グリッドは市販のグリッドボックスに保管してください。これにより、数年間にわたって安定した状態で保存されます。凍結破断エッチングレプリカの慎重な取り扱いまたは超微形態観察では、通常50から80 kilovoltsの加速電圧の透過電子顕微鏡でレプリカを観察します。標準的なTEMフィルムまたは高解像度デジタルカメラを用いて、関連する画像を記録します。各真核生物の基部の細胞膜に、繊毛および鞭毛の膜結合粒子がストランド状に配列し、繊毛のシャフトを囲むように配置されており、これは繊毛ネックレスとして知られています。繊毛形成（Clio Genesis）過程にある上皮細胞の管腔境界には、特殊な膜粒子アレイが現れます。これらの粒子配列は、新生した繊毛ネックレスを表しており、これは形成途上の繊毛および成熟した繊毛の基部に位置しています。さまざまな上皮細胞の凍結破断研究により、基底外側境界のアピカル側に囲む、吻合するストランド（線状構造）とグルーブ（溝状構造）の精巧な組織化が明らかになっています。上皮細胞膜を破断すると、密接結合の細胞膜側破断面がストランドとして現れ、一方で細胞外破断面にはそれと相補的なグルーブが現れます。ギャップ結合は、さまざまな組織の凍結破断標本に見られ、細胞膜破断面上の高密度な粒子配列と、細胞外破断面上の相補的なピットとして表現されます。ここでは、ディープエッチングおよび回転シャドウイングを用いた急速凍結の例を示します。上皮細胞は細胞質で破断されており、矢印の先に細胞膜破断面が確認できます。後続のエッチングにより、真の細胞表面が明らかになります。この手法を習得すれば、適切に実施することで、約3時間のサイクルで1〜3個の検体を製作することが可能です。この手順を行う際は、個々のステップが非常に密接に関連しており、ある1つのステップでのミスが、現像後の検査および評価に不十分な結果を招く可能性があることに留意することが重要です。この手法により、細胞・分子生物学分野の研究者は、遺伝子変異がどのように細胞に構造的な異常をもたらし、それが病理学的状態や疾患を誘発するのかを探索することが可能となりました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:Schönherr, S., et.al. は、マウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力特異的配置を調べるために、光遺伝学的免疫標識と凍結骨折レプリカ免疫標識を組み合わせました。J. Vis.

マウス脳組織の凍結破砕標本における神経膜タンパク質の免疫標識

超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。...

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。...

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

クライオ電子顕微鏡、走査型（SEM）のいずれか、または送信（TEM）は、広く高含水率1を有する生物学的試料または他の材料の特徴付けのために使用される。 SEM /集束イオンビーム（FIB）は、試料中の関心対象の特徴を識別し、クライオTEMへの転送のために薄い電子透過性のラメラを抽出するために使用される。...

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

高品質の透過型電子顕微鏡画像を取得することは、特に植物細胞の場合、水で満たされた大きな液胞と曝気された空間が豊富にあるため、困難です。タンデム高圧凍結と急速凍結置換により、TEM用の植物試料の調製時間が大幅に短縮され、超微細構造保存性に優れた試料が得られます。...

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。...

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。...

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

2 つのサンプル処理技術、高圧凍結を組み合わせることのためのプロトコルの紹介、マイクロ波試料処理は続いて集束イオンビームのビーム走査型電子顕微鏡 (FIB SEM)...

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

ここでは、細菌、酵母、培養細胞、単離細胞、動物およびヒト組織、ウイルスを含む生物学的標本の迅速凍結にサンドイッチ凍結装置を使用する方法を示す。また、急速凍結後の超薄切片用試料の調製方法もご紹介します。...

電子顕微鏡での生体試料の良好な超構造保存のためのサンドイッチ凍結装置を用いた急速凍結

この原稿は、単粒子低温電子顕微鏡用の生物学的標本を手動で凍結するブロット・アンド・プランジ法の概要を説明している。...

単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

我々は、癌性尿路上皮細胞に由来する細胞外小胞(EV)の単離および凍結破砕のためのプロトコルを提示する。凍結破壊技術は、EVの直径と形状、そしてユニークな特徴としてEV膜の内部組織を明らかにしました。これらは、EVがレシピエント膜とどのように相互作用するかを理解する上で非常に重要です。...

細胞外小胞分析のための凍結破壊電子顕微鏡

学ぶフリーズフラクチャー/フリーズエッチング技術による生物試料の電子顕微鏡観察法。超速凍結と真空下での破断・エッチングにより、膜の超微細構造を三次元的に可視化し、細胞分子生物学と材料科学の研究に貢献します。

生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

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