3Dグラフェン電極誘電泳動デバイスの開発

本プロトコルでは、3D積層グラフェンペーパーおよび電極マイクロデバイスの作製手順と、デバイス内でのDI電気泳動またはDEPによるポリスチレンビーズや生物学的細胞の操作に関する実験方法について説明します。以下、誘電泳動（dielectrophoresis）をDEPと表記します。デバイスの作製は、50 µmのグラフェンペーパーとN-1層の100 µm感圧ポリマーテープを交互に積層させることで行い、これにより信号電極と接地電極が交互に配置されます。

各層を圧着してトリミングした後、構造体に向けてマイクロウェルをドリルで開けます。最後に、銀エポキシを用いて、デバイスの両端に2本の銅リード線を取り付けます。次のステップは、目的の導電率を持つDEP培地を調製することです。

次に、ポリスチレンビーズをこの緩衝液に特定の体積比で懸濁させます。第3段階にして最終ステップは、調製したビーズ懸濁液をデバイスに注入し、顕微鏡ステージに設置して、デバイスを関数発生器に接続し、最終的にDEPを開始することです。最後に、顕微鏡を用いてDEP応答を記録し、さらなる解析によって細胞または粒子の特性を研究します。

グラフェンは、その強度に加えて熱的および電気的特性により利用される汎用性の高い材料です。本プロトコルでは、安価なグラフェンペーパーを導電性電極層として用い、血液型判定や疾患細胞の医学的診断などのアプリケーションに向けて粒子や細胞を識別できる三次元ダイエレクトロフォレシス（誘電泳動）マイクロデバイスを利用します。このグラフェンペーパー電極マイクロデバイスの利点には、作製の容易さ、サンプルのスループットの向上、および幾何学的な汎用性が挙げられます。

3D不均一電場は、分極可能な粒子や細胞をその固有の化学的および形態的特性に基づいて識別できるという独自のDP（誘電泳動）力を用いて、大容量のサンプルを操作できます。グラフェンペーパーとテープを用いて、積層デバイスを組み立てます。ここでは、市販の厚さ75 µmの疎水性グラフェンペーパーと、厚さ100 µmの感圧性両面テープを使用します。

まず、外科用メスと直定規を用いて、グラフェンペーパーを6.7 cm × 1.5 cmの長方形に切り出します。次に、ハサミを使って、両面感圧テープを1.3 cm × 約5 cmのストリップ状に5枚切り出します。清潔なガラススライド上に、1枚目のグラフェンペーパーを配置します。グラフェンペーパーの端の一方をテープ1枚でゆっくりと覆いますが、隣接するグラフェンペーパー層間の絶縁を確実にするため、約2 mmのマージンを残してください。

2枚目のグラフェンペーパーをテープの上に配置します。このとき、1枚目のグラフェンペーパーからずらして配置してください。上から適度な圧力を加え、層間の密着を確実にします。

以上の2つのステップを残りの層に対しても繰り返し、最上層と最下層の両方がグラフェンペーパーになるようにします。ハサミを使用して、デバイス端面から余分なテープを取り除きます。この際、グラフェンペーパー層間の絶縁封止を確実にするため、約1 mmのわずかなマージンを残してください。マルチメーターを用いて、デバイスの反対側にある電極リードに正極および負極プローブを当て、迅速に絶縁テストを行います。

数百kΩ程度の高い抵抗値は、層間の絶縁状態が良いことを示しています。これで、積層構造はマイクロウェル掘削の準備が整いました。マイクロフライスを用いて、積層構造にマイクロウェルを掘削します。

ここでは、直径700 µm、刃長が約2.1 mmのマイクロエンドミルを使用します。マイクロエンドミルの選択は、マイクロウェルの直径およびデバイスの厚さに合わせて行います。積層構造をクランプでマイクロドリルステージ上に固定し、コンピューター制御を用いてエンドミルの先端を構造の真上に配置します。デバイスに加圧空気を吹き付けながら、エンドミルを回転させ、ゆっくりと積層構造の中心に向かって貫通するように下げていきます。

新しい穴から切り屑を完全に除去するため、積層構造の深さよりもわずかに深い位置まで停止させます。エンドミルをマイクロウェル内で数回上下に動かし、内壁を滑らかにします。

マイクロウェルの内壁は、可能な限り垂直で清潔である必要があります。最適な電界勾配とマイクロウェルへの光透過を得るため、標準的な32ゲージの銅線を3 cmの長さに2本切り、2 cmのところで直角に2回折り曲げます。銀導電性エポキシのパートA約0.75 mmとパートB約0.75 mmを手動で混合します。

小さな容器の中で、3枚のグラフェンペーパー層の先端および層間にシルバーエポキシを慎重に塗布して配線を接続し、層間の良好な接触を確保します。次に、1 cmのワイヤーを任意の2層間に配置し、層を軽く押さえて余分なエポキシを取り除き、良好な電気的接触を確認します。積層構造の反対側についても同様に繰り返します。

装置全体をラックに載せ、70 °C、1気圧のオーブンで一晩乾燥させます。オーブンから装置を取り出し、電極リード間の電気絶縁を確認します。ここで、あらかじめ調製した290 mOsm/Lのマンニトール溶液とPBSをさまざまな比率で混合し、導電率の異なる一連の溶液媒体を作成します。

これらは、細胞培養バッファーを簡略的に模倣するために選ばれた単純な溶液です。これら2つの溶液の体積比と、得られる溶液の導電率との間には線形相関があります。ピペッティングにより、Polystarビーズまたは生物学的細胞を、1:100（体積比）の割合で調製した導電性媒体と混合します。10 µLのPolystarビーズと1 mLの媒体溶液をサンプルバイアルに入れます。

ボルテックスミキサーを用いてサンプルを十分に混合します。改造した紙製クランプまたは同等品を使用して、デバイスをガラススライド上に適度な圧力で固定します。マイクロウェルに十分に近づけて固定し、ラミネート構造をガラススライドに密着させてサンプルの漏れを防いでください。

クランプの締め付け具合は、デバイスを変形させてウェルの形状や光路に悪影響を及ぼさないように制御する必要があります。ダイヤモンドチップのガラスカッターを用いて、マイクロウェルをちょうど覆うのに十分な大きさで、厚さ 0.5 millimeter のカバーガラススライドをカットします。カバーガラスを適切なサイズに切り、取り置いておきます。このマイクロシリンジを用いて、ポリスチレンビーズ懸濁液を約 1 microliter、マイクロウェルにゆっくりと注入します。気泡の混入を避けるため、気泡が出た場合は注入をやり直し、鋭利な針でマイクロウェルの壁を傷つけないよう注意してください。マイクロウェルにわずかに過剰に注入し、直ちに準備したカバーガラスをマイクロウェルの上に滑り込ませて、余剰液を取り除き、蒸発を防止し、再現性のある液量を確保します。

各実験において、ラミネート加工を施したマイクロデバイス全体を顕微鏡ステージに固定し、ファンクションジェネレータを取り付けます。デバイスのワニ口クリップを銅線に接続し、顕微鏡ソフトウェアでフォーカスを調整して、マイクロウェルを鮮明に観察します。画面中央に、100 Hzから10 MHz、15 Vを表示します。

デバイスにピークトップ信号を印加しました。ガラススライド表面から1〜200 µm上のマイクロウェル内を10倍の倍率で観察しました。ボタンをクリックして、カメラの録画およびデータ取得を開始します。

カメラの録画開始から2秒後に、ファンクションジェネレーターの信号を開始します。後の強度解析のため、画像は1〜5 fpsで約5分間デジタル保存されます。実験完了後、デバイスを取り外し、クランプを解除します。

ガラススライドとデバイスの両方を石鹸水で洗浄します。その後、十分にすすいでください。電場がない状態では、粒子は重力によってデバイスの底にのみ沈殿します。1 kHz付近の電場を印加すると、電場勾配に沿ってグラフェンペーパーに近づく動きが見られ、正のDEP挙動が示されます。

100 kHz以上の電界およびMHz帯域において、マイクロウェルの端に電極が観察されます。マイクロウェルの中心に向かう電界勾配に沿ったビーズの移動によって、負のDEP（誘電泳動）が確認されました。この3Dグラフェンペーパー電極マイクロデバイスは、理論的な予測挙動および以前に報告された実験結果の両方と密接に一致する実験結果をもたらしました。

デバイスの作製は非常に汎用性が高いです。提供されたプロトコルは、より層数の多いデバイスや他の材料を用いるデバイスに容易に適応させることができます。このビデオでは、バッチ処理による3D DEPマイクロデバイスについて詳しく解説します。

しかしながら、今後の応用においては、粒子または細胞懸濁液をデバイスのマイクロウェルに連続的に流すことで、より高いスループットを達成できる可能性があります。DEPソートの汎用性の一例として、吸水性グラフェンペーパーが、粒子または細胞濃縮器の電極およびフィルターとして、あるいは電気動力学的な生化学センサーとして同時に機能させることが挙げられます。このビデオを視聴することで、視聴者は多層グラフェンペーパー電極マイクロデバイスの作製方法、および粒子または細胞の実験を行うためのデバイス操作方法について十分に理解できるはずです。