腹足類軟体動物に産卵に男性付属腺製品の効果

このプロトコルの全体的な目標は、同時雌雄同体の種の産卵行動に対する精液タンパク質の影響を特徴付けることです。これは、最初に標準化された実験室培養から個人を分離し、次に標的臓器を解剖することによって達成されます。次に、収集された精子と治療溶液が作られます。

この後、カタツムリは人工授精されます。その後、彼らはバイオエッセイに入れられます。標準的な条件下では、卵塊を採取し、スキャンし、個々のBSに入れて孵化させます。

数週間後、孵化したばかりの子ガメを数えてスキャンし、その後、すべての写真をフリーソフトウェアを使用して分析できます。このプロトコルは、精液タンパク質を介して媒介される性選択のプロセスに関する質問に答えるのに役立ちます。ここでは同時雌雄同体を見ているので、これらのプロセスが別々の性種の場合と同様に機能するか、異なる方法で機能するかについても説明できます。

このプロトコルでは、アムステルダムのVU大学で維持しているles in lesの優れたILを使用しました。私たちはこの種を使用して、性選択と生殖に関する問題を研究しています。雌雄同体では、その比較的大きな体の大きさのために、実験的に非常にアクセスしやすいです。

さらに、モデル種として多くの異なる生物学分野で使用されているため、これらの動物の基本的な生物学について多くのことがわかっています。私の名前はユミです。私は生態科学部の博士号を持っています。

フルユニバーシティでは、次のプロトコルを実演します。さっそく始めましょう。信頼性の高いバイオーサを実行するために、潜んでいる変数を除外するためにラボ培養が最も一般的に使用されます。

低銅水は摂氏20度に保たれ、明暗サイクルは12×12時間です。VU大学では、実験室の培養物は繁殖施設のタンクで維持され、継続的な水交換が行われます。標準的な条件下では、成体のカタツムリは性欲でレタスを与えられ、年齢層に応じて分離されます。

カタツムリが繁殖施設から取り除かれると、それらは使用中と見なされ、繁殖タンクに戻すことはできません。手順を開始する前に、実体顕微鏡、ピン付きの解剖プレート、小さな手術用ハサミ、鉗子、塩化マグネシウム溶液で満たされた注射器、およびカタツムリを安楽死させるためのペーパータオル、注射針で45度の角度で足を貫通し、カタツムリがリラックスして伸びたままになるまで静かに圧力をかけ続けます。注射針を取り外し、カタツムリが安楽死していることを確認します。

次に、鉗子を取り、シェルを慎重に取り外します。曲率の半分に続いて、シェルから正筋をそっとこすり落とします。次に、カタツムリを殻からゆっくりとねじります 殻の巻き方向に沿って殻から出します。

これでカタツムリが殻から取り除かれ、殻を捨てることができます。その後、カタツムリを解剖プレートに置き、足の後端にピンを通します。次に、ヘッドにピンを通します。

カタツムリにテンションをかけ、ピンをプレートに入れます。これでカタツムリは解剖の準備が整いました。実体顕微鏡のライトをオンにし、顕微鏡を調整します。

最初の切開を行う前に、女性のporをローカライズすることが重要です。これは後で参照ポイントになります。マントルの端のすぐ下に最初の切開を行い、メスのporに向かって切り込みます。

ボンノの毛穴を頭に向かって回します。皮膚のみをカットし、臓器に当たらないようにして直線的にカットしてください。この研究では、前立腺と精液と精子の精嚢をそれぞれ解剖します。

完全な精子と精液の貯蔵のためには、カタツムリは性欲を与えられて1週間隔離されるべきであることに注意してください。解剖は前に説明したものと同じです。精嚢は動物の後部に位置しています。

次に、前立腺を生理食塩水で吊り下げて氷の上に置きます。今後の。これらは治療液と混合されます。

膣内注射の前に、収集された精子は、関連する用量で精液または個々のタンパク質に追加されます。この人工授精技術では、1ミリリットルの注射器が必要になります 試験液を含む注射針を注射器に取り付け、注射用の注射器に気泡が付着していないことを確認し、シリコンチューブを慎重に使用してください。シリコンチューブを注入針の上にスライドさせます。

チューブに穴が開いていることを確認し、チューブから空気を取り除きます。注射の前に、カタツムリを鎮静する必要があります。これは、第 2 章と同じプロトコルに従います。

カタツムリには、塩化マグネシウムの50マイクロモルの2〜3ミリリットルの用量が与えられます。カタツムリが適切に鎮静してリラックスしたら、型に置き、安定した位置に保ちます。次に、シリコンチューブの端を細い鉗子でつかみ、メスのporにそっと押し込みます。

次に、シリンジに静かに圧力をかけ、規定の量の試験溶液を慎重に注入します。チューブ内の圧力が女性の臓器に広がるまで30分待ちます。この後、チューブを慎重に取り外し、カタツムリを専用の容器に入れます。

結局のところ、カタツムリは人工授精されています。彼らは実験タンクに輸送することができ、バイオバイオアッセイを開始することができます。カタツムリは数時間後に鎮静から回復します。生物 検定。

性淘汰の場合、実験は通常、バイオーサが開始されるまでに2週間かかります。すべての個人を自分の容器に入れ、ラベルを付けることが重要です。次に、各カタツムリの殻の長さを測定します。

これは、性行動に影響を与える可能性のある彼らのサイズの良い指標です。この後、カタツムリは実験タンクに入れられます。この水槽は飼育施設と同じ標準条件です。

第1章で説明したように、開口部がタンク内の水の流れに追従するように、コンテナを正しい向きに配置することが重要です。バイオアッセイ中、カタツムリには定期的に餌を与える必要があります。レタスのレタスディスクの標準量を金属製の穴あけ器でカットします。

十分な投与量は、一日おきに2枚のディスクです。モデル種では、 lumia stauss、 カタツムリは一日おきに卵塊をチェックする必要があります。これらの卵塊は、測定のために収集されます。

卵のスキャンには、スキャナードライバー、フラットベッドスキャナー、標準ミリメートルスケール、卵塊スプーン転写プレート、卵塊の上に置くガラスプレートを含むラップトップが必要になります。まず、スプーンを取り、容器の壁から卵塊をこすり落とします。不透明な卵塊は産卵されたばかりで使用できません。

この測定イベントでは、卵塊をトランスファープレートに置き、プレートがいっぱいになるまでこれらの手順を繰り返します。この後、卵塊を転写プレートと同じ順序でガラスタイルに置きます。卵塊はガラスタイルにくっつき、逆さまにして、スケールのすぐ下のフラットベッドスキャナーに慎重に置きます。

次に、プレートに圧力を加えて卵塊を押しつぶします。これにより、今でもすべての卵が追加されるため、卵子は等しくスキャンされます。スキャンする前に、最良の結果を得るために設定を調整することをお勧めします。

スキャンでは、解像度を最大に調整してプレビュースキャンを行うことが重要です その後、作業領域をトリミングし、最後に、最終的なスキャンを行う前に明るさとコントラストを調整します。スキャン後、卵塊は独自のラベル付きバイアルに入れられ、成熟して孵化します。これらのバイアルは、酸素を適切なレベルに保つために、一日おきに水がリフレッシュされます。

カタツムリが孵化するにつれて、水をリフレッシュするためにさまざまな技術を使用する必要があります。最良の順序は、最初に注ぐかオーバーフローし、後でピペットオープン画像JAスプレッドシートプログラムで水を吸い出すことです。最初に画像J内からデータと写真を記録するには、ズームツールを使用してミリメートルスケールに移動します。

ズームインしてウィンドウを調整し、1ミリメートルが画面いっぱいに表示されるようにします。2つのインジケーターラインの間にラインツールを使用して線を引きます。次に、解析に移動し、スケールを設定します。

ポップアップメニューには、測定された長さが既知の距離を1に、単位をミリメートルに調整されていることがわかります。グローバルのチェックボックスをオンにして、ウィンドウを閉じます。スケールが設定されたので、最初の卵塊に向かってズームできます 最大 800% 楕円形ツールを使用して、卵の円周を描画します。

Dを押して円周を描画します。これにより、同じ卵子を2回測定するのを防ぐことができます。Mを押して円周を測定します。

十分なデータが収集されると、ウィンドウがポップアップ表示されます。データウィンドウはExcelファイルとして保存できます。データをワークシートに直接コピーすることもできます。

優先測定値がポップアップウィンドウに表示されない場合は、これを調整して分析できます。卵塊あたりの個々の卵子を数える測定の設定は、セルカウンタープラグインを使用して行うこともできます。プラグインに移動します。

次に、分析してセルカウンターを選択します。セルカウンターウィンドウがポップアップします。「Keep original (原文を保持)」チェックボックスをオンにして、「initialize (初期化)」を押します。

新しいカウンターウィンドウが表示されました。ツールバーから「ここに十字」ツールを選択します。次に、セルカウンターメニューでカウンタータイプを選択します。

セルカウンターウィンドウをクリックすると、卵子がカウントされます。合計数は、セルカウンターメニューのカウンタータイプの横に表示されます。セルカウンターで複数の卵塊を数えることができます。

カウンタータイプは必要に応じて追加および削除できますが、この番号はスプレッドシートに手動でコピーするか、結果を押す必要があり、ウィンドウがポップアップ表示されます。すべての結果を表示します。この方法では、精液タンパク質を収集する方法と、これらを有意義な方法でテストする方法を示しました。

これは完全な前立腺抽出物を使用して示しましたが、もちろん、個々の精液タンパク質も同じ方法でテストできます。さらに、他のプロセスや産卵を見ることが可能です。私たちの実験の結果、卵子レーンの減少を媒介するアビオススタチンと呼ばれる単一の精液タンパク質が存在することが示されています。

さらに、精液の移動はサイズまたはポストを増加させることがわかっています。スタチンは、同時雌雄同体で初めて完全に特徴付けられた精液タンパク質です。精液の影響は、性別が異なる種でしばしば報告されていますが、私たちの結果は、精液が雌雄同体でも同様に重要であることを強調しています。