Name: 感染するためのプロトコル線虫（Caenorhabditis elegans）とネズミチフス菌 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学ぶ線虫Caenorhabditis elegansをSalmonella typhimuriumに感染させる方法。RNAiで宿主遺伝子を抑制し、生存率を測定して感染防御に関与する遺伝子を同定します。このプロトコルは宿主と病原体の相互作用を研究する上で有用です。

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私たちは、原稿の重要な読書のために博士ダイアンBaronas-ローウェルに感謝します。この作品は、FAUチャールズ·E.シュミット大学科学のシード·グラントとKJのエリソン医学財団からエージング奨学金によってサポートされていました

1。XLD（キシロースリジンデソキシコール）寒天プレート XLD寒天はXLD寒天プレート上で黒色コロニーとして現れるサルモネラ、のための選択的成長培地である。汚染の心配がない場合は、正規のLBプレートは、置換されていてもよい。 <ol><li> 5ミリリットルの脱イオン水に5.5グラムのXLD寒天再懸濁を量る。 </li><li>すべての寒天が濡れてまでよく混ぜる。すべての塊がなくなっているとメディアが完全に再懸濁されるまで脱イオン水を95ミリリットルを追加します。 </li><li> （オートクレーブしないでください）​​、完全に溶解する媒体が沸騰。 </li><li> 50℃の室温で培地を冷却</li><li>各95×15ミリメートル（直径×高さ）プレート（パラフィルムでシールしたプレートを1ヶ月まで4℃で保存することができる）中の25mlの寒天を注ぐ。 </li></ol> 2。線虫増殖培地（NGM）RNAiは、プレートの餌付け Cの準備エレガンス NGMプレートは、以前に記載されている19ここでの手順を簡単にするRNAi送り板を作るためにNGM培地に抗生物質アンピシリンおよびRNAi化学誘導物質イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することが記載されている。 <ol><li> 3グラムのNaClおよび1 Lの脱イオン水に2.5グラムバクトペプトンを溶かす。 </li><li>メディアへの17グラムバクト寒天を追加します。 </li><li> 45分間オートクレーブし、メディアを水浴中で50℃に媒体を冷却する。 </li><li>を1mlのコレステロール（95％エタノール中5 mg / ml）を1 mlの1 MのCaCl 2、1 mlの1 MのMgSO 4、および25 mlの1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）：以下の溶液を加える。よく混ぜる。 </li><li> 1ミリリットルの1M IPTGおよび500μlのアンピシリン（滅菌水に100ミリグラム/ ml）を追加します。 </li><li>よく溶液を混合し、滅菌手順に従ってピペットで援助と25ミリリットルの血清学的ピペットを用いて60×15ミリメートル（直径×高さ）ペトリ皿に注ぐ。 12ミリリットル寒天で各プレートを埋める。プレートを、1ヶ月まで4℃で保存することができる。 </li></ol> ベック-1オートファジー必須遺伝子はサルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の機能を調べるために例として使用される。実験手順は、 図1および表1に示されている。感染についてのRNAi処理動物を調製するためのプロトコルは、括弧内に与えられた各実験手順の日に、続く。 <ol><li> BEC-1のRNAi摂食に接種し、100 mg / mlのアンピシリン（1日目 ）を補足した2ミリリットルのLB培地には-80℃で凍結した細菌フレークを配置することによって、空のベクターL4440のRNAi摂食細菌を制御します。新鮮なRNAiの細菌を持っている全体の実験中に週一回、この手順を繰り返します。使用しない場合は4℃の冷蔵庫に文化を保存してください。 </li><li> RNAiのプレート上で一晩のRNAi細菌培養の100ミリリットルをシード。 3 BEC-1 RNAiおよび3コントロールの空のVを準備RNAiのプレートをエクター。 37℃で一晩（2日目 ）でプレートをインキュベートする。 </li><li> 37℃のインキュベーターからのRNAiプレートを取り外し、それらをベンチに室温まで冷却する。よく葉L4野生型N2雌雄同体をピックアップし、RNAiを1にBECと空ベクターのRNAiプレートを制御するためにそれらを転送します。三連のプレートに、プレート当たり3ワームを配置します。ステップ3.2（3日目 ）に記載したのと同じ日に、RNAiのプレートを準備します。 </li><li> 36〜40時間、20℃のインキュベーター内のワームとのRNAiプレートをインキュベートし、ステップ3.3で作成新鮮対応のRNAiプレートにワームを転送します。ワームが転送された後、64時間（4日目 ）、20℃のインキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li></ol> 4。感染のサルモネラを準備<ol><li>ストリークサルモネラ -80℃で凍結した1 XLD寒天プレート上の在庫と一晩（5日目 、37℃でプレートをインキュベート</st栄&gt;）。 </li><li>よく孤立黒サルモネラコロニーを採取し、（6日目 ）で一晩振とうしながら37℃で2 mlのLB培地中で、それを接種。 </li><li> 1 Cの種子80ミリリットルサルモネラ一晩培養虫 60×15ミリメートル（直径×高さ）NGM寒天プレート、計6枚を準備。 6時間室温で培養する。細菌培養プレート（7日目 ）に芝生を乾燥させ、形成すべきである。 </li></ol> 5。 サルモネラとのRNAi治療ワームに感染<ol><li> BEC-1のRNAi処理を移し、 サルモネラプレートに空のベクターのRNAi治療L4のN2雌雄同体（ステップ3で設定したワームの子孫）を制御する。各グループの3プレートにプレート当たり40ワームを配置します。 48時（7日目 ）、20℃でワームのプレートをインキュベートする。 </li><li>ステップ3.1および3.2（7日目で説明したように、新鮮なRNAiプレートの1セットを準備し、 <stroNG&gt; 8日目）。 </li><li> 48時間の感染後、ステップ5.2で作成、対応するRNAiプレートにサルモネラ菌に感染したワームを転送し、20℃（9日目 ）でインキュベートする。 </li></ol> 6。生存アッセイ<ol><li>日々のワームの生存をスコアと産卵期間中に新鮮な対応のRNAiプレートにワームを転送します。ステップ3.1および3.2で説明したように前に各ワーム転送に新鮮なRNAiプレートのセットを準備します。エンド平坦化白金線で軽くワーム本体（頭部、中間部と尾）をタッチします。ワームの体の動きが全く観察されない場合にワームが死んだとして採点される。 </li><li>日々のワームの生存または一日おきのスコア、およびワームが産卵を停止した後に週二回、新鮮対応するRNAiプレートにワームを転送します。 </li><li>すべてのワームが死んだ後、1​​データセットとして三重プレートからの生存データをプールする。例えば、グラフパッドPなどの適切な統計ソフトウェアへの入力の各群の生存データを生存曲線を生成し、Kaplan-Meier生存分析を実行するRISM。全実験は結論を確認するために、少なくとも1回繰り返される。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

線虫は、栄養源としてバクテリアを食べて、単純な遺伝的モデル生物である。従って、C.間の相互作用を調査するために、腸病原体にその正常細菌食品を代用することは容易である虫および選択した病原体。本明細書プロトコルは、 サルモネラ感染およびC.を組み合わせることが記載されているRNAiは、 サルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の役割を調べるために治療を供給エレガンス 。以前の感染プロトコルはC.を公開一生の20時にサルモネラなどの病原性細菌にワームエレガンス 。この議定書では、 サルモネラは 2日間の期間中にワームに感染します。その後、ワームは、 サルモネラにさらされなくなりました。このサルモネラ感染が著しくC.の寿命を低下させる野生型動物エレガンス 。このように、 サルモネラ内部ワームを複製し、動物1...

自由生活土壌線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、多くの生物学的な質問を研究するために使用されるシンプルかつ遺伝的に扱いやすいモデル生物である。C.虫が支配的自己施肥雌雄同体として存在する。雄配偶子形成を自発的に1,2の間にX染色体の非論理和によって生成される。豊富な食べ物、Cの存在下で虫は継続的に、成人に4幼虫の段階を経て発達する。温度も影響を与えるC.虫の開発;迅速な開発は、より高い温度で観察される。研究室では、C.エレガンスは、食品1,2播種し、細菌大腸菌 （菌株OP50）を含む寒天プレート上で20℃の標準温度で培養する。 過去10年間で、C.虫は宿主-病原体相互作用3-5を研究する無脊椎生物として浮上している。自然界では、C.虫は nutrienなどの細菌を食べるトン源1,2。その通常の細菌の実験室フード、OP50は、容易C.間の相互作用を調べるために他の病原体で置換することができる虫や任意の選択された病原体。これらの条件下で、腸の感染の主要部位である。実際に、細菌性病原体の広い範囲が致死的にC.に感染することが示されている虫 3-5。 グラム陰性菌のサルモネラは、世界中の6,7人の食中毒の原因となる胃腸病原体である。C.この細菌は、複製し、持続的な腸の感染症8月10日を示すもの虫はネズミチフス菌のための優れたモデルホストです。 でエレガンスは、新規の両方を識別するために使用されていると以前から知られているサルモネラ病原性は、11因子 。興味深いことに、C.虫の免疫系は正常にサルモネラの複製が制限されます。それはそのInhibが以前に報告されているオートファジー遺伝子のitionはCで増加サルモネラの複製をレンダリング虫 、感染したワーム10の早い死に至る。マクロオートファジーは、（本明細書オートファジーと呼ばれる）12分解のためにリソソームへの送達のための細胞質および細胞小器官を隔離する細胞内膜の転位を伴う動的プロセスである。オートファジーは、C.においてサルモネラの複製を制限することが報告されている虫や哺乳類10,13中。 C.虫のゲノムを配列決定し最初の多細胞真核生物ゲノムた。それは、RNAi治療14〜16に応答する。また、RNAiは、RNAiが16,17に供給として知られている標的遺伝子の二本鎖RNAを含む細菌を摂取するワームを施すことにより効果的に投与することができる。全ゲノムのRNAi送りライブラリは、ゲノムワイドなRNAiは16,18をスクリーニングするために生成されている。ここでは、 サルモネラ感染症のプロトコールは、RNAiがC.をテストできるように、給紙に結合されているサルモネラ感染に対して防御する能力について、目的の遺伝子エレガンス 。

<table><tbody><tr><td>LBブロス</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD寒天</td><td>EMDケミカルズ</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>フィ</td><td>ッシャーDF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1420-500</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーS671-500</td><td></td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム</td>フィ<td>ッシャーC69-500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーM65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>ゴールド</td><td>バイオテクノロジー12481C50</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>シグマ</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>サルモネラチフス菌</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿95 x 15 mm</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 60 x 15 mm&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンセロジカルピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンエクスプレス ピペットエイド</td><td>フィッシャー</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 振とうインキュベーター&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

過去10年間で、C.虫は、グラム陰性菌、ネズミチフス菌に対する宿主防御を含め、ホストと病原体との相互作用を研究する無脊椎生物として浮上している。サルモネラはCの腸内で持続感染を確立虫や感染した動物の早期死亡をもたらす。免疫機構の数はCで同定されているサルモネラ感染に対して防御する虫 。オートファジー、進化的に保存されたリソソーム分解経路は、C.におけるサルモネラの複製を制限することが示されている虫と哺乳類における。ここで、プロトコルは、C.に感染することが記載されているヒトにおけるサルモネラ感染と同様のワームが、限られた時間のサルモネラに暴露されたネズミチフス菌 、 線虫と、 サルモネラ感染が著しくC.の寿命を短くする虫&lt;/ EM&gt;。一例として、必須の自食作用遺伝子ベック-1を使用して、我々はC.、この感染法を組み合わせたRNAiは、 線虫のアプローチを供給し、このプロトコルはC.の機能を調べるために使用することができる示しサルモネラ感染に対する防御において宿主遺伝子エレガンス 。 C.以来虫全ゲノムのRNAiライブラリが利用可能であり、このプロトコルは、包括的で物をスクリーニングすることが可能になるサルモネラおよびゲノムワイドのRNAiライブラリを使用して、他の腸内の病原体から守る遺伝子エレガンス 。

20℃では、野生型N2ワームの中央値は寿命が17日間（ 図2Aおよび表2）である。 サルモネラ感染が有意に10.5日（P = 0.0002、log-rank検定）にN2ワームの中央値の寿命を低下させる（ 図2（a） ）。 C.もし線虫遺伝子はサルモネラ感染に対する防御において重要な役割を果たし、それはその阻害はサルモネラ感染に対する感受性を付与することが予測される。実際、 サルモネラ感染制御のRNAi治療のN2動物と比較して、 サルモネラ感染BEC-1のRNAi治療N2ワームの中央値は寿命が9日間（P &lt;0.0001、log-rank検定）（ 図 10.5日から減少している図2Bおよび表2）。最大寿命を劇的に（24日から10日間、...

線虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための新しい遺伝モデルとして登場しました。ここでは、 温度を感染させるためのプロトコルを記述サルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の役割を調べるために二重鎖のRNAi干渉法と結合ネズミチフス菌とエレガンス 。

感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

この手順の全体的な目的は、宿主と病原体の相互作用を調べるために、サルモネラをエレガンス（C. elegans）に感染させることです。これは、まずRNAiによって宿主遺伝子の発現を抑制することで達成されます。次に、RNAi処理した線虫にサルモネラを感染させます。感染した虫を非病原性のrna eye給餌プレートに移すことで、感染を停止させます。最終ステップとして、感染した虫の生存率を記録します。このデータから生存率を算出し、最終的にSalmonellaに対する防御に不可欠な遺伝子を特定します。手順の実演は、研究室の技術者であるJulie Johnが行います。まず、必要な培養プレートを準備します。最初に、XLD寒天培地プレートを作成します。これらはサルモネラ属菌に選択的であり、本プレート上では黒色コロニーとして現れます。XLD寒天培地を全量の水に混合する前に、1 g/mLの割合で水に再懸濁してください。オートクレーブは行わないでください。このアガーをホットプレートで加熱します。1枚あたり25 mLのアガーを注ぎ、直径95 mmのXLDプレートを作成してください。RNAiプレートと呼ばれるRNAi含有NGMフィーディングプレートを調製するには、標準的な方法を用います。簡潔に述べると、オートクレーブ滅菌後の培地にアンピシリンとRNAi化学誘導剤であるIPTGを添加します。冷却後、60 mmプレートに12 mLのアガーを分注します。これらのプレートは、使用前に4 °Cで保存することで最大1ヶ月間使用可能です。まず、これらに細菌を接種して培養します。この例では、サルモネラ菌に対する防御に不可欠であるため、Beck 1を標的遺伝子としています。まず、RNAiおよびコントロールの培養を開始します。－80°Cで保存された凍結細菌のフレークを、アンピシリン含有LB培地2 mLに加えます。細菌はRNAiを発現しているか、あるいは発現せず空ベクターを保持しているかのいずれかである必要があります。これら2つの培養物をインキュベーターに移し、一晩培養します。翌日にいつでも細菌を利用できるように、これを毎週行ってください。培養液100 µLをRNA eyeプレートに播種します。各プレートタイプについて、実験群と対照群をそれぞれ少なくとも3枚ずつ作成します。これらのプレートを37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、プレートを室温に戻します。その後、十分に給餌した野生型N2のL4期の雌雄同体個体をプレートに移します。1枚につき3匹で十分です。これらのプレートを同日に20 °Cでインキュベートします。培養細菌を含むRNAiプレートをさらに準備します。20 °Cで36〜40時間後、1枚目のRNAiプレートから線虫を新しいRNAiプレートに移します。その後、再び20 °Cでさらに64時間戻します。まず、-80 °Cのフリーザーからサルモネラ菌のストックを取り出し、XLDプレートに画線培養します。プレートを37 °Cで一晩培養してください。翌日、プレートから独立した黒色コロニーをピックアップし、2 mLのLB培地に接種します。37 °Cで一晩振盪させ、翌朝に回収します。接種したLB培地を用いて、6枚のNGMプレートに播種します。各プレートに80 µLずつ分注し、室温で6時間置くと、細菌培養液が乾燥し、NGMプレート上にローンを形成します。次に、RNAi処理した個体とコントロール処理した個体を6枚のプレートに転移させます。各プレートに40匹ずつ個体を載せ、20 °Cで48時間インキュベートします。この時点から、毎日新しいRNAiプレートの準備を開始してください。これは、生存率アッセイに向けて、2日後およびそれ以降の毎日に準備が整っているようにするためです。48時間後、感染させた線虫を、新しく調製したRNAiプレートまたは空ベクトルコントロールプレートに戻します。その後は、線虫の産卵時間に合わせて毎日、これらのプレートを20 °Cのインキュベーターに戻してください。線虫の生存率をスコアし、生存個体を新しいRNA eyeプレートに移して生存率を判定します。平らにした白金線で線虫を優しく刺激します。反応がない場合、その線虫は死亡していると判断します。産卵期において、まず虫を特定し、その後内部衛生管理により駆除します。これらの虫は、適宜速やかに除去する必要があります。このタンパク質を発現する線虫を実験群の線虫として明確にカウントできれば、データは大幅に整理されるはずです。線虫が産卵を停止した後は、週に2回、新しいRNAiプレートに移植するだけで十分です。集団がすべて死滅した後、それらのデータを統合し、生存率をカプラン＝マイヤー曲線でプロットしてください。結論がどのようなものであれ、確実を期すために実験を少なくとも2回は実施してください。20 °Cにおいて、野生型C. elegans（N. two）の生存期間中央値は17日です。Salmonella感染により、N. twoの生存期間中央値は、Beck one RNAiによる処理で予想される通り、有意に10.5日まで短縮します。サルモネラ感染後の生存率の低下。平均寿命は10.5日から9日に低下し、最大寿命も有意に短縮した。これは、感染に対するC. elegansの防御におけるBeck oneの役割を支持する結果である。Beck one RNAiで処理し、サルモネラ菌では処理しなかった個体。寿命に顕著な変化は見られなかった。このビデオを視聴することで、サルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の役割を調べるための、RNAiアプローチと感染プロトコルの実施方法について十分に理解できるはずである。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶ線虫Caenorhabditis elegansをSalmonella typhimuriumに感染させる方法。RNAiで宿主遺伝子を抑制し、生存率を測定して感染防御に関与する遺伝子を同定します。このプロトコルは宿主と病原体の相互作用を研究する上で有用です。

感染するためのプロトコル

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