Name: Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: 学ぶホールセルパッチクランプ記録法で海馬のパルブアルブミン陽性介在ニューロンを形態学的・神経化学的に特定し、GABA B受容体介在効果を解析する方法。神経回路の抑制機構解明に有用です。

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著者は、彼女の優れた技術支援のための伊那ウォルターに感謝したい。 VGAT-ヴィーナストランスジェニックラットは博士によって生成された。博士A.宮脇により提供PCS2-金星を使用してY.柳川、M.平林およびY.川口生理学研究所において、岡崎、日本、。

倫理に関する声明：すべての手順や動物のメンテナンスが動物の保護に関する制度的なガイドライン、ドイツの動物保護法、欧州理事会指令609分の86 / EECに基づいて実施し、地元当局からガイドライン（ベルリン、T-0215​​/11 ） 急性海馬スライスの調製<ol><li>皮質抑制性介在13の大部分をラベルVGATプロモーター下に蛍光ヴィーナス/ YFPタンパク質を発現するトランスジェニックラット（17から24日齢）を取る。ラットを首を切る。急速semifrozen、carbogenated（95％O 2/5％CO 2）のスクロースベースの人工脳脊髄液（スクロースACSF、 図1A）に脳（&lt;40秒）を解剖。 </li><li>ゴーグルに搭載された、505nmのLEDランプ515発光フィルターで金星/ YFP蛍光のために解剖したラットの脳を評価する。 </li><li>皮質の前頭三分の一を取り外し、勉強家エルム;すべてメスで、半球を分離する。以前に14を説明したように、脳を下に接着する平坦な表面を提供するために、皮質の背側表面を削除します。 </li><li>ビブラトーム上の海馬体の横方向のスライス（300μm）をカットし、半球がsemifrozenで囲む必要があり、ショ糖ACSF（ 図1B）14 carbogenated。吻側大脳皮質、中脳および脳幹の追加の領域を削除します。 carbogenated 35ºCに温め、スクロースACSFを含む浸水保持チャンバーに各スライスを転送します。 </li><li>温めACSFに入る最後のスライス時から30分間、35ºCで回復するのスライスにしておきます。代謝プロセスを再活性化し、カット神経突起の再シールを容易にするためにこれを行います。そこで、ストレージ（ 図1C）を、室温に転送。 </li></ol> 2の作製と記録ピペットの充填<ol><li> PuのガラスキャピラリーからのLLパッチピペットを濾過（シリンジフィルター、孔径0.2μmの）を充填した際に2-4MΩのピペット抵抗が達成されるように、（細胞内標識化のための）0.1％ビオシチンを含む細胞内液を。その成分の劣化を防止するために氷上で冷却細胞内液を保管してください。 </li><li>濃度（;ソリューションのリストを参照してくださいE R（のCl - ）= -61 mVの） -生理学的に関連の低いのClを含有する溶液とシナプス後電流を識別するためのパッチピペットを埋める。 </li><li>濃度（E R（のCl - ）= -ペアの録音は、シナプス前受容体媒介応答を識別するために、低カルシウム2 +バッファシナプス前伝達物質の放出との干渉を防止するための能力だけでなく、4倍高いClでなどを有する細胞内液とパッチピペットを埋める-20 mV）は、信号対雑音薬理RESPの正確な評価を可能に観測されたのIPSC 5のを改善するためにonsiveness。濃度IPSC動態15を変化させることができる-のClの変更があることに注意してください。 </li></ol> FS-INSから3。全細胞パッチクランプ記録<ol><li> ACSFをCarbogenateと（また、吸引ライン、 図2Aを介して、記録室からACSFを除去する）蠕動ポンプを用いて、記録チャンバーに灌流システムフィードスルー。レコーディングに備えてセットアップ上のすべての機器の電源をオンにします。 </li><li>録音室にスライスを移し、絹の単繊維を張ったプラチナリングで所定の位置に保持する。ポジションスライスCA1の地層（文字列）錐体の両方STRに2ピペットでアクセスを許可する、視野を垂直に実行されるようにします。放線とstr。同時にオリエンス （ 図2Cおよび4A）。 </li><li>セットアップ中に室を配置し、carbogenatedの灌流を開始し、温めた（32〜34℃）記録A5〜10ミリリットル/分の流速でCSF。 </li><li> 40倍対物倍率におけるIR-DIC光学の下でスライス品質を評価し、ディスプレイ上で見CCDカメラで可視化する。ラウンド、適度に対比さCA1錐体細胞（CA1のPC）が多数STRで見ることができても、適切なスライスの品質を前提としています。軽く滑らかでクレーター表面下20〜30ミクロン（ 図2C）の深さで錐体 。質の悪いスライスは、不均一なスライス面で、非常に対照的で、縮小または膨張した多数の細胞が含まれています。 </li><li> str内または近くには、大多細胞体を持つヴィーナス/ YFP（ 図2B）を発現するものとして落射照明下での推定のFS介在ニューロンを識別します。錐体 。より自分の形態学的整合性を維持するために、合理的に深いスライス内の細胞（50〜100ミクロン、 図2C）を選択します。 </li><li>ヘッドステージ上のピペットホルダーに記録電極をマウント。その後アプリLYチューブラインを介して、低、正圧（20〜30ミリバール）。スライスの表面にピペットを下げ、わずかに選択されたニューロンの中心にオフセット。 </li><li>以前に14,16説明したようにホールセル記録の設定を取得し、参照することも2Dおよび2Eフィギュア ： <ol><li>標的細胞：70〜80ミリバールに圧力を増やし、急速にちょうど選択したセル（ 図2D、上）の細胞体上のスライスを通してピペットを下げる。 </li><li>セルアプローチ（ 図2D、上）、その上に「ディンプル」を生成するために、細胞膜に対してピペットを押します。隣接セルのビオサイチンラベリングを防ぐために、迅速にこの手順を実行します。 </li><li>ギガオームシールを作成します。圧力を解放すると同時に、ピペットに20 mVの電圧指令を適用します。ギガオームシール（1-50GΩ; 図2D、底面および図2E中央）typic同盟国は急速に開発しています。いったん密封され、電圧指令として（通常は-70と-60 mVの間）に予想される静止膜電位を印加する。 </li><li>パッチを突破：密閉されると、負圧の短いパルスで膜パッチを破裂。それによって、全細胞構成（ 図2E、ボトム）を達成。 </li></ol></li><li>細胞全体のキャパシタンスと直列抵抗（R S）を補償する。 R sは 、通常、最大120分間5-20MΩと安定している。ブレイクスルー上の膜電位（V M）が -50 mVのより脱分極であれば細胞を放棄。 R Sが 30MΩより、最初は大きい。またはR Sは、記録の経過にわたって20％以上変化する。 </li><li>電流パルス（-250 250 Paで、 図2F、上）脱分極にハイパーファミリーに（電流クランプモードの場合）、その応答によってFS-INSを特定します。 FS-INSは、比較的V M（通常は-50トンを脱分極しているO -60 mVの）、短い膜時定数（&lt;20ミリ秒）と500 PAが周波数で活動電位（AP）を列に電流注入を脱分極に応答する&gt;顕著である100Hzの11（ 図2F、下）、 CA1のPC（ 図2F、中央）とは異なる。 </li></ol> GABA B R媒介性応答を誘発する4。細胞外電気刺激<ol><li> strの境界にスライスにおける：;シナプス誘発反応を観察するためには、細胞外の刺激電極（0.1〜0.3MΩ抵抗2のNaClを充填したパッチピペット）を配置します。放線とstr。 lacunosum-moleculareは刺激アーティファクト（ 図3A）、細胞を直接電気刺激を防ぎ、最小限にするために細胞体に電極200〜300ミクロンの横方向の位置を調整します。 </li><li>刺激電極が配置されると、のホールセル記録を得る選択したセルとセクション3.9（ 図3B）のように電流固定モードでの生理的な表現型を評価する。 </li><li>電圧クランプ（V M -65 mVの）に記録ニューロンでは、孤立した定電圧刺激装置を使用して、50 V（〜500μA効果的な刺激）毎週20秒シナプス前軸索の電気刺激を提供します。 GABA B R仲介性IPSCを観察して、より大きな伝達物質の放出を生成するために複数の刺激（200 Hzで）の列車をインターリーブする単一の刺激（100μ秒の期間、 図3C、トップ）を使用します。 </li><li>孤立した単シナプスIPSC（ 図3C、ミドルアッパーを）明らかにする：;：バスはイオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬（D-AP5 [50μM] NMDA受容体DNQX [10μM] AMPA受容体）を適用。さらに、GABA A Rブロッカーの適用とGABA B R媒介IPSCを隔離（gabazine [10μM]; 図3CミドルLワー）。 </li><li> GABA B（灰色でunderlain 図3C低い）CGP-55845 [5μm]とのその後の適用によりR媒介されているものとして、得られたスロー外向き電流（下図3C、拡張した）を確認</li></ol> FS-INとCA1のPC結合シナプスの5ペア録音<ol><li>以下に説明するようにシナプス結合のINとPCのペアの間で行われる同時録画、と抑制性シナプス伝達のGABA B R媒介シナプス前制御を評価する。 </li><li>まず、（セクション3のように）シナプス前ニューロンの細胞全体の記録を確立し、FS表現型（ 図4A）を確認。 </li><li>その後、近隣のCA1、PC（20〜100ミクロンの距離、 図4A）をパッチを適用し、APを引き出すために（電流クランプモードで開催された）シナプス前INに電流パルスを脱分極簡単な閾値上（1ミリ秒の継続時間、1-5 nAの振幅）を適用。シナプスの共同の場合nnection（約80％のR、Sを補償）電圧クランプで開催され、CA1 PC内のIPSCのIN結果のAPが存在する。 </li><li>必要に応じて、接続が見つかるまで、さらにCA1パソコンから新しい記録電極と記録を埋める。 </li><li>接続が確立されると、単一のシナプス応答と動的挙動の両方を評価するために、シナプス前FS-INでのAPの対を誘発する。 50ミリ秒間隔（ 図4B）で2脱分極刺激の典型的なペアのパルスプロトコルを使用してください。 </li><li>ベースライン条件の制御トレースを収集します。そして、このように完全に受容体媒介効果をブロックするために、アンタゴニストCGP-55845（5μM）に続いての GABA B Rsは、活性化、灌流ACSFに対して選択的なGABA B Rアゴニストのバクロフェン（10μM）を適用。各薬物の状態（ 図4BおよびC）の定常状態時に〜50トレースを収集します。 </li><li>記録が完了すると、outsidを形成することにより体細胞膜をシール電子アウトパッチ：ゆっくりVクランプに細胞体からピペットを撤回とR Sの増加に伴い、mVの-40 V ​​Mを減らす。アウトサイドアウトパッチの形成を促進するために、これを行います。その後浴からピペットを取り外します。 </li></ol>電気生理学的特性の解析6。 <ol><li>注：別のソフトウェアパッケージの群衆は電気生理学的データの取得のために用意されています。ここで、WinWCPは、無料のストラスクライド電気生理学ソフトウェア·パッケージ内のWindowsプログラムは、最大16のアナログ入力チャンネルの記録と10のデジタル信号の出力を可能にする、使用されている。 </li><li>ローパスフィルタ20 kHzで、すべての5〜10 kHzでのデータとサンプル。 </li><li>オフライン分析スイートとの生理学的データを分析します。 注：Stimfit、Pythonのシェルを含むオープンソースソフトウェア·パッケージは、このインスタンスで使用されている。しかし、他の選択肢を容易代わりに使用することができる。 <ol><li>受動膜pを分析記録されたニューロンのroperties、静止膜電位から、電流クランプで取得された。 </li><li>記録の最初から記録された応答のベースラインからの平均静止膜電位を測定します。 </li><li>最小の過分極電流パルス（≤-50 pA）で、電圧応答から、オームの法則を使用して、入力抵抗を計算します。信号対雑音比、平均複数のトレースに信号を改善する。注：私たちの例では、一般的に10〜50の個別の掃引の平均である。 </li></ol></li><li>最小の過分極電流パルスに対する応答の減衰に次指数曲線を当てはめることによって見かけ上の膜時定数を推定します。 </li><li>しきい値を決定するために、活動電位波形、電流パルス脱分極の閾値レベルによって誘発された振幅（ピーク閾値）と期間（ハーフ高さで測定された幅）を分析します。 </li><li>電圧クランプ記録からGABA B R仲介性IPSCを分析します。フィルタートレースオフラインで500ヘルツ（ガウシアンフィルタ）と、（少なくとも10のトレースの平均）でGABA B R媒介性応答のピーク振幅と遅延を評価する。 </li><li>ピークと前のベースラインとの間で測定GABA A R媒介性IPSCのピーク振幅の変化としてINSの抑制出力にGABA B Rs の影響を検出します。制御周期のため≥50トレースから平均振幅とすべての薬理学エポックの定常状態を計算します。 </li></ol> FSインの7。可視化と免疫細胞化学<ol><li>記録後、4℃で0.1 Mリン酸バッファー（PB、pHは= 7.35）O / Nで4％パラホルムアルデヒドに浸漬してスライスを固定します。 </li><li>必要なスライスは、PBに移し、加工前〜1週間まで保存することができる場合。 </li><li>自由に新鮮なPB中、続いて0.9％NaClで0.025 M PB中ウォッシュスライス（PBS、pH値= 7.35）。 </li><li>非特異的抗体結合を低減するために、foのスライスをブロック10％正常ヤギ血清（NGS）を含有する溶液中で、室温でrは1時間、0.3％トリトン-X100（膜を透過するための界面活性剤）および0.05％のNaN 3、PBS中で作製。 </li><li> PBS中で、NaN 3を 5％NGS、0.3％のTriton-X100、0.05％を含有する溶液中で希釈した抗-PVモノクローナルマウス抗体を使用して、PV発現のために標識する。 4℃12で2〜3日間、一次抗体をインキュベートする。 PBS中で徹底的にスライスをすすぐ。 </li><li>蛍光抗マウス二次抗体を適用します（ 例：アレクサ-546。）ビオチン結合タンパク質ストレプトアビジンと一緒に、蛍光色素にコンジュゲート（ 例えば 、アレクサ-647）;そしてPBS中に希釈し、3％NGS、0.1％トリトン-X100、0.05％のNaN 3を含有する溶液中でインキュベートし、4℃でO / Nインキュベートする。 </li><li>たっぷりPB中2-3リンスに続いてPBSでスライス2〜3倍をすすぐ。スライドガラス上のスライスをマウントします。崩壊のスライスを防止するために、300μmの寒天スペーサーを使用してください。性蛍光物質で覆いスリップスライスネイルワニスセント封入とシール。 </li></ol> 8。イメージングと可視化の再構築FSイン<ol><li> /金星のためのPVのためのアレクサ-546標識およびアルゴン488または515nmのためのヘリウムネオン543 nmの、適切なレーザライン（アレクサ-647用のダイオードレーザー635nmので励起fluorochomeレポーターで、走査型共焦点顕微鏡を使用してスライスを視覚化YFP）。 </li><li>全細胞のZスタックを生成する（20X対物レンズを用いて、通常は0.5〜1ミクロンのステップ）は、適切なZ-解像度で画像を撮影する。複数のスタックは、通常の画像にデジタルでフィジー/ ImageJソフトウェア（ 図5A）を使用して、オフラインでステッチすることができ、全細胞を、必要とされる。 </li><li> （フィジー/ ImageJソフトウェアパッケージ17、 図Cにおける単純な神経トレーサープラグイン）半自動トレース法を用いたステッチ画像スタックからの細胞を再構築。 </li><li>最後に、私のPV-免疫反応性を評価する高開口数の対物レンズ（60Xシリコン浸漬、NA = 1.3）でnterneuron。 PVの体細胞洗い出しが強すぎると細胞体の像、近位樹状突起と軸索の近位、あるいは軸索の端末を作成します。免疫標識はビオシチン標識された構造（ 図5B）と整列するように確認された場合、細胞を、PVのための免疫反応性とみなされる。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

私たちは、機能的にin vitroでmorphologically-と神経化学的に特定したニューロンを特徴づけるために、電気生理学的および神経解剖学的手法を組み合わせた方法を記載している。特に皮質抑制性INSの多様な種類の。手順の重要なポイントは以下のとおりです潜在的なインの（1）事前選択; （2）細胞内記録とニューロンの可視化;そして最後に、（3）記録されたINSの形態学的および免疫細胞化学分析。この研究は、特にPV-INSに対処していますが、記載されているプロトコルは、最小限の変更で、いずれかの介在ニューロンまたは他の神経型から同じような記録のために使用することができます。 皮質領域におけるニューロンの比較的低い数が非常に非効率的これらの細胞からランダムに選択して記録を行う。発散局在と形態学的特徴を識別し、日常的にいくつかの介在ニューロンタイプから録音する研究者を有効にしている。しかし、スライス、インターンの同定に細胞体層に近いeuronsは、FS-INSと同様に、依然として困難である。特定のニューロン集団に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス系統の出現は、はるかに...

海馬神経回路は、長い、それらの学習と記憶に重要な役割だけでなく、ヒトとげっ歯類の両方における空間ナビゲーションに、解剖学と生理学の両方に関して、厳しい調査の対象とされてきた。同様に、海馬の著名な、単純な層状の組織は、この領域の皮質ネットワークの構造的および機能的特性に取り組む研究の好ま対象になります。 海馬の回路は主要な興奮性細胞（&gt; 80％）およびより小さな（10〜20％）が、抑制性介在1-3の非常に多様な集団から構成されている。介在ニューロンは、その高速なイオンチャネル型のGABA A受容体（GABA Aルピー）で作用軸索の端末と低速メタボの GABA B受容体（GABA Bルピー）からγ-アミノ酪酸（GABA）を放出4。これらの阻害のメカニズムは、励起を相殺し、主要な細胞の興奮性を調節するため、赤外線タイミング及び放電のパターン。しかし、介在ニューロンから放出されたGABAは、本人の細胞上ではなく、介在ニューロン自身5,6のみならず機能します。前とシナプス後受容体が介在ニューロンの多様な種類の中フィードバック調節および抑制の相互作用を媒介する。介在ニューロンネットワークにおけるこれらの阻害メカニズムは、異なる周波数7における特定の振動で、集団活動パターンの生成および整形の中心であると考えられる。 全細胞パッチクランプ記録は、固有の性質とニューロンのシナプスの相互作用の検査のために十分に確立された方法である。しかし、介在ニューロンの種類の高度な多様性のために、抑制性介在の調査は、記録された細胞の厳密な識別を必要とします。海馬介在ニューロンタイプが明確な形態​​的特徴および神経化学的マーカー発現によって特徴付けられるように、解剖学的および免疫細胞化学のE組み合わせxaminationは、正確な介在ニューロンのアイデンティティ6,8,9を決定するための手段を提供することができる。 本論文では、ゆっくりとGABA Bの特徴付けを可能にする、単一のニューロンまたはシナプス結合のペアからホールセルパッチクランプ記録は事後形態学的および免疫細胞化学分析に続いて、細胞内の標識を組み合わせた実験的なアプローチについて説明します受容体は特定さ介在ニューロンにおける阻害効果を媒介する。一例として、私たちはそのシナプス後の標的の細胞体および近位樹状突起の神経支配と「速いスパイク」（FS）ことを特徴としている介在ニューロンの一つの主要なタイプ、いわゆる「籠細胞」（BC）のサブセット、に焦点を当てる放電パターン、密細胞体層を覆う軸索、およびカルシウム結合タンパク質のパルブアルブミン（PV）10,11の発現。これらのニューロンは、大規模なシナプス後抑制電流だけでなく、著名な事前の表示GABA B R活性化12に応答して、それらのシナプス出力のシナプス変調。ここで説明される技術の組み合わせは、他の同定されたニューロンタイプのさまざまな内因性またはシナプスのメカニズムを調査するためにも同様に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>トランスジェニックvGAT-venusラット</td><td></td><td></td><td>Uematsuを参照。 &lt;em&gt;他&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Venus (515 nm) ゴーグル</td><td>BLS Ltd.、ハンガリー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖器具</td><td>&lt;em&gt;すなわち&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>脳摘出用</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>または、垂直方向の振動が最小限に抑えられたその他のハイエンド・ビブラトム</td></tr><tr><td>スライス保持チャンバー</td><td></td><td></td><td>ラボ内でのカスタム作成</td></tr><tr><td>正立IR-DIC顕微鏡</td><td>オリンパス（日本）</td><td>BX50WI</td><td>マイクロマニピュレーターシステムを用いて； &lt;em&gt;すなわち&lt;/em&gt; Luigs、Neumann、Kleindiek &lt;em&gt;など。&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>505 nm LEDシステム</td><td>Cairn Research</td><td>OptiLEDシステム</td><td>または水銀ランプ、その他のLEDシステム &lt;em&gt;すなわち&lt;/em&gt; CooLED&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>あるいは、Axopatch 200Bアンプリファイア2台&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>WinWCPデータ収集ソフトウェア</td><td>ジョン・デンプスター、ストラスクライド大学</td><td></td><td>任意の品質のデータ収集ソフトウェアを使用することができます。 &lt;em&gt;すなわち&lt;/em&gt; EPHUS、pClamp、Igorなど&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>電極引き抜き機</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>ボックスフィラメントに使用</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス製ピペット</td><td>ドイツ、ヒルゲンベルク</td><td>1405020</td><td>外径2 mm、内径1 mm、フィラメントなし</td></tr><tr><td>ペリスタポンプ</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>他のポンプや重力給液による代用も可能です。</td></tr><tr><td>デジタル温度計</td><td></td><td></td><td>特注品</td></tr><tr><td>デジタルマノメーター</td><td>Supertech、ハンガリー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; 翻訳対象が提供されていません。翻訳する英文テキストを入力してください。&quot;入力がありません。翻訳するテキストをご提供ください。&quot;&gt;独立定電圧刺激装置&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。&quot;翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。&quot;&gt;DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ビオシチン</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>別名としては &amp;epsilon;-ビオチノイル-L-リシン&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-AP5(V)二ナトリウム塩</td><td>Abcam 生化学試薬</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>DNQX二ナトリウム塩</td><td>Abcam生化学試薬</td><td>ab120169</td><td>あるいはNBQXまたはCNQX</td></tr><tr><td>ガバジン (SR95531)</td><td>Abcam生化学試薬</td><td>ab120042</td><td>あるいは、ビククリンメチオダイドを使用する。</td></tr><tr><td>R-バクロフェン</td><td>Abcam生化学試薬</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>CGP-55,845塩酸塩</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>抗PVマウスモノクローナル抗体</td><td>スワン、スイス</td><td>235</td><td>使用濃度 1:5,000-1:10,000</td></tr><tr><td>抗マウス二次抗体&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>VenusまたはGFPを発現するげっ歯類を、レッドチャネル（&lt;em&gt;すなわち&lt;/em&gt; （546 nm）が推奨されます。</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td></td><td></td><td>高品質な任意のブランド</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td></td><td></td><td>通常 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>アガローススペーサー</td><td></td><td></td><td>アガロースブロックをビブラトームで300μmに切断する &amp;mu;m</td></tr><tr><td>共焦点レーザ走査顕微鏡</td><td>オリンパス（日本）</td><td>Fluoview FV1000</td><td>またはその他の同等なシステム</td></tr><tr><td>Fiji (FijiはImageJの一種です)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Schindelinを参照 &lt;em&gt;ほか&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABA作動性抑制性介在は、脳の神経回路内の中心的な役割を果たしている。介在ニューロンは、ニューロン集団（10〜20％）の小規模なサブセットを含みますが、その多様な機能を反映して、生理的、形態学的および神経化学的不均質性の高いレベルを示している。したがって、介在ニューロンの調査は、組織の原則と神経回路の機能に重要な洞察を提供しています。しかし、これは、個別の介在ニューロンの種類の選択と識別のための統合された生理学的および神経解剖学的アプローチが必要です。トランスジェニック動物の急性脳切片からの全細胞パッチクランプ記録、ニューロン特異的マーカーのプロモーターの下で蛍光タンパク質を発現し、標的とし、電気生理学的に、特定のニューロン型の内因性及びシナプスの特性を特徴付けるための効率的な方法を提供する。細胞内の色素の標識と組み合わせることで、このアプローチは、事後カ月で拡張することができますrphologicalおよび免疫細胞化学分析、記録されたニューロンの体系的な識別を可能にします。これらの方法は、皮質ニューロンの多様な種類の機能的特性に関する科学的問題の広い範囲に合うように調整することができる。

但し、スライス品質はCA1 PCやFS-INSは、最小限の困難を伴って達成することができ、両方からの録音、かなり良いです。 VGATプロモーター13の下ヴィーナス/ YFPを発現するトランスジェニックラットのラインが明確にFS-INS、または実際のBCを識別しない。しかし、INSからの記録str内とその周辺。錐体 、FS-INSの密度は、FS-INS（ 図2B）を選択する可能性の高い結果1一般的に高い。 FS-INSは、CA1パソコンとRS-INSの両方とは異なるそれらの特徴的な生理学的特性によって区別す​​ることができる。彼らは比較的脱分極静止膜電位（-58.9±1.5 mVの、15細胞、対CA1パソコン、26細胞における-62.6±1.1 mVの）、低入力抵抗を持っている（92±12MΩ対103のPCが±14MΩ）と高速見かけの膜時定数（15.4±2.6ミリ秒対PCの中で22.0±2.7ミリ秒）、resul過分極電流パルス（ 図2F）への迅速な電圧応答内ティン。 FS-INSは、（振幅2...

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

この手順の全体的な目的は、同定された海馬のパルブアルブミン陽性介在ニューロンにおけるGABA B受容体介在性の効果を特性解析することである。これは、まず高品質な海馬急性切片を作製することで達成される。第2のステップでは、ビデオ顕微鏡を使用して、YFP発現およびパルブアルブミン陽性ニューロンの既知の特性に基づき、ニューロンを選択する。次に、ホールセルパッチクランプ記録を行い、細胞外刺激またはペア記録を用いてGABA B受容体介在性の効果を検討します。最終ステップとして、ニューロンを可視化し、記録したニューロンが実際にpar albumin陽性であり、かつ細胞体周囲または樹状突起抑制性ニューロンであることを確認します。最終的に、この手法によってGABA B受容体介在性の抑制効果の特性評価が可能となり、記録した介在ニューロンの明確な分類が可能になります。この手法は、インターニューロン分野における重要な疑問に答えることができます。例えば、インターニューロンが互いにどのように通信しているのか、また、それらの興奮性やシナプス出力が神経修飾系によってどのように制御されているのか、といった点です。この手法は海馬のインターニューロンにおけるGABA作動性制御への洞察を提供しますが、他の脳領域、神経修飾系、または細胞型にも適用可能です。蛍光静脈YFPを発現する生後17〜24日のトランスジェニックラットから、半凍結の状態のカルボゲン含有スクロースCSFで保持した脳を取り出し、メスを用いて皮質の前方3分の1と小脳を除去し、左右の半球を分離します。切片作成時に脳を固定するための平坦な面を確保するため、皮質の背側表面を取り除きます。カルボゲン含有ネイティブスクロースで満たしたバイオームバスを用いて、半球をバイオームステージ上に接着します。A CSFを用いて、海馬形成の300 µm厚の横断切片を作成します。各切片を、35 °Cに加温し、カルボゲン飽和させたスクロース含有A CSFが入った没入保持チャンバーに移します。最後の切片を加温スクロースA CSFに入れた30分後、切片を室温に移して保存します。ガラスキャピラリーからパッチピペットを引き出し、ピペット抵抗が2〜4 MΩになるように調整します。充填後、海馬スライスを記録室に移し、シルクの一本繊維を張った白金リングで固定します。記録室を記録装置に設置し、加温したカーボゲン飽和記録用A CSFを5〜10 mL/minの流速で灌流し始めます。ビデオカメラを用いて、40倍の対物レンズ倍率にてI-R-D-I-C光学系でスライスの品質を評価します。ここではスライスが良好な品質であると想定します。滑らかでわずかにクレーター状の凹凸がある表面から20〜30 µmの深さにあるstratum parameterにおいて、中程度のコントラストを持つ円形のparametal細胞が多数観察できれば良好です。落射蛍光照明を用いて、stratum pyramidale内またはその近傍に大きな多極性の細胞体を持ち、YFPを発現している細胞を、推定されるfast spiking interneuronsとして同定します。次に、ポストシナプス電流を同定するために、低濃度で生理学的に適切な塩化物イオン濃度を含む溶液をパッチピペットに充填し、ヘッドステージのピペットホルダーに装着します。その後、チューブラインを通じて低い正圧をかけます。ピペットをスライスの表面まで下げ、選択したニューロンの中心からわずかにずらした位置に合わせます。圧力を 70 to 80 millibars まで上げ、ピペットをスライスの中に素早く的に下げ、選択した細胞の細胞体（soma）の直上に配置します。ピペットを細胞膜に押し付け、膜にディンプル（小さなくぼみ）を作ります。この工程は迅速に行ってください。隣接する細胞にビオチン標識されるのを防ぐため、圧力を解除すると同時にピペットに-20 mVの電圧コマンドを印加し、ギガシールを形成します。シールが開始されたら、電圧コマンドを通常-70 mVから-60 mVの間である予想静止膜電位まで下げます。次に、負圧の短いパルスを印加してメンブレンパッチを破裂させ、ホールセル構成にします。カレントクランプモードを用い、過分極から脱分極までの一連のカレントパルスに対する反応によって、高速発火インターニューロンを特定します。シナプス誘発反応を観察するために、細胞外刺激電極を、stratum radiatumとstratum lacunosum-moleculareの境界のスライス内に配置します。ボルテージクランプモードにおいて、独立した定電圧刺激装置を用い、50 voltの電気刺激を5回、単発または200 hertzのトレインとして、20秒ごとにシナプス前軸索に与えます。次に、単独のモノシナプス性IPSCを明らかにするため、バスタブにイオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬を添加します。GABA A受容体アンタゴニストを投与し、GABA B受容体介在性のIPSCをさらに単離します。ペア記録を開始するために、まず、前述と同様にシナプス前インターニューロンのホールセル記録を確立し、ファストスパイク表現型を確認します。次に、シナプス前インターニューロンを保持しているインターニューロンから20～100 µmの距離にあるCA1錐体細胞にパッチクランプを行います。カレントクランプモードにて、インターニューロンに活動電位を誘発させるため、短時間のSRA閾値脱分極電流パルスを印加します。シナプス接続が存在する場合、介在ニューロンにおける活動電位は、電位固定されたca1錐体細胞にIPCを誘発します。接続が確認されたら、50 millisecondの間隔をあけて2回の脱分極刺激を与えるという標準的なペアパルスプロトコルを用いて、シナプス前側のファストスパイク型介在ニューロンに一対の活動電位を誘発させます。コントロールのトレースを収集した後、還流させるA CSFに選択的GABA B受容体アゴニストであるバクロフェンを添加し、GABA B受容体を活性化させます。次に、受容体介在性の効果を完全に遮断するために、アンタゴニストのCGP 55 8 45を投与します。記録が完了したら、ボルテージクランプ状態でピペットを細胞体からゆっくりと引き抜きます。直列抵抗が増加するにつれて、膜電位を-40 mVまで下げ、outside-outパッチを形成して細胞体膜をシールします。記録後、スライスを0.1 molarリン酸緩衝液を含む4%パラホルムアルデヒドに浸し、4°Cで一晩固定します。リン酸緩衝液で洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、10%正常ヤギ血清、0.03%TRITTON X 100、および0.05%アジ化ナトリウムを含む溶液で室温で1時間ブロッキングを行います。par albuminの発現を標識するため、5%正常ヤギ血清、0.3%TRITTON X 100、および0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS溶液で希釈した抗parvalbuminマウスモノクローナル抗体を用い、一次抗体を4°Cで2〜3日間インキュベートします。インキュベーション後、スライスをPBSで十分にすすぎ、蛍光標識抗US二次抗体とフルオロクロム結合ストレプトアビジン結合タンパク質を適用し、3%正常ヤギ血清、0.1%tritton X 100、および0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS溶液中で4°Cで一晩インキュベートします。翌日、スライスをPBSで2〜3回十分にすすぎ、続いてリン酸緩衝液で2〜3回すすぎます。切片をガラススライドに載せ、切片の潰れを防ぐために300 µmのアガースペーサーを使用します。次に、切片を蛍光封入剤でカバーガラスで覆い、マニキュアで封印します。高倍率および高開口数を用いて、介在ニューロンのpar albumin免疫反応性を評価します。水晶体レンズ細胞がpar albuminに対して免疫反応性を示すと判断された場合、免疫標識がビオチン標識構造と一致していることを確認し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてZ軸方向の連続画像を取得します。その際、形態学的同定および三次元再構築のために蛍光Adenをイメージングします。その後、樹状突起および軸索の分枝構造を組み込み、画像を三次元的にニューロンとして再構築します。単一の細胞外刺激に対するファストスパイク抑制性介在ニューロンの複合シナプス応答をここに示します。イオン型グルタミン酸受容体アンタゴニストであるDNQXおよびAPVの投与により、単シナプス性抑制性ポストシナプス電流（IPSC）が単離されます。GABAa受容体アンタゴニストであるガジン（Gazin）の投与により、IPSCの高速成分が消失しました。5回の刺激列により、緩徐なGABA B受容体介在性IPSCが認められ、これはその後のCGP投与によって遮断された。これらのトレースは、対照条件下、バスへのbaclofen投与後、およびその後のCGP投与後における、シナプス前方の高速発火インターニューロンにおける活動電位と、CA1錐体細胞における短潜時単一IPSCを示している。baclofenはIPSC振幅を約50%減少させるが、GABA B受容体拮抗薬はIPSC振幅をほぼ完全に回復させたことに注意されたい。IPSC振幅の時間経過プロットは、バクロフェンおよびCGPAの効果を示しています。20倍の倍率で示された高速発火介在ニューロンは、CA1領域のstratum radiatumとstratum pyramidaleの境界に細胞体を有し、樹状突起は垂直に走り、すべての層にわたっています。バスケット細胞に典型的であるように、軸索の大部分は細胞体層およびその周囲に見られますが、60倍の倍率の画像では、オレンジ色のアスタリスクで示された推定CA1錐体細胞の周囲に形成される典型的な軸索のバスケットが確認できます。ここでは、同じ介在ニューロンの3次元再構築図を示しており、細胞体と樹状突起を黒色で、軸索を赤色で表示しています。CA1の層構造は、習得後、青色で描写されます。この手法は1日で実施可能であり、開発後は、ポストドクターによる形態学的解析を数枚のスライスで同時に行うことができます。この統合的なアプローチにより、海馬および皮質のマイクロ回路の研究者が、インターニューロンの種類の形態学的・生理学的な多様性に加え、構造と機能の相互関係を探索することが可能となりました。

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

このビデオでは、樹状膜表面からのパッチクランプ記録の手法を示しています。これは、ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起とその下にある電位依存性イオンチャネルの電気的特性を直接調べるのに役立ちます。...

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

このビデオは、トランスフェクションされたマウス海馬の脳スライスにおけるシナプス相互作用とニューロン応答を研究するためのプロトコルを示しています。これには、長距離の感覚ニューロンを照射して活動電位をトリガーし、全細胞パッチクランプ技術を使用して記録されたニューロンに結果として生じる興奮性シナプス後電位を記録することが含まれます。...

マウス海馬切片におけるニューロンの光刺激および全細胞パッチクランプ記録

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。...

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

このビデオでは、脳スライスを固定し、ピペットを配置して全細胞構成を実現し、シナプス前ニューロンを刺激してシナプス後応答を記録することで、ニューロンの接続性を解明する手順を示しています。...

急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

Pair記録は、シナプス的に接続された2つのニューロンからの同時全細胞パッチクランプ記録であり、個々のニューロン間のシナプスの正確な電気生理学的および薬理学的特性評価を可能にします。ここでは、電気生理学が装備された任意の実験室の器官型海馬スライス培養でこの技術を確立するための詳細な方法論と要件について説明します。...

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

急性脳切片におけるシナプス結合ニューロンのパッチクランプ記録と同時細胞内バイオサイトン充填により、それらの構造的および機能的特性の相関分析が可能になります。このプロトコルの目的は、ニューロンのマイクロ回路からの電気生理学的記録とその後の形態学的分析の本質的な技術的ステップを説明することです。...

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

細胞内パッチクランプ記録は、樹状突起の機能的特性を調査する可能性を提供します。しかし、これらの微細な構造物は、直径が小さいため、簡単にはアクセスできません。ここで説明するプロトコルは、in...

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

本プロトコルは、成体マウスから初代海馬ミクログリアを単離し精製する方法を説明し、続いて、これらの急性に単離された細胞の全細胞パッチクランプ記録を実施するための指示が続きます。...

成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録

学ぶホールセルパッチクランプ記録法で海馬のパルブアルブミン陽性介在ニューロンを形態学的・神経化学的に特定し、GABA B受容体介在効果を解析する方法。神経回路の抑制機構解明に有用です。

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

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