Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

この手順の全体的な目標は、特定された海馬パルブアルブミン陽性ニューロンにおけるGABA B受容体媒介効果を特徴付けることです。これは、最初に高品質の急性海馬スライスを作成することによって達成されます。2番目のステップは、ビデオ顕微鏡を使用して、静脈YFPの発現とパラルブミン陽性ニューロンの既知の特性に基づいてニューロンを選択することです。

次に、全細胞パッチクランプ記録を取得し、細胞外刺激またはペア記録のいずれかを使用して、GABA B受容体を介した効果を調べます。最後のステップは、ニューロンを視覚化し、記録されたニューロンが実際にはパーアルブミン陽性であり、パラ体細胞または樹状突起抑制ニューロンであることを確認することです。最終的に、この方法は、GABA B受容体を介した阻害効果の特性評価を可能にし、記録されたニューロン間の明確な分類を可能にします。

この方法は、ニューロン間フィールドの主要な質問に答えることができます。例えば、ニューロン間がどのように相互に通信するか、その興奮性、シナプス出力が神経調節システムによってどのように制御されているかなどです。この方法は、海馬のニューロンへの制御であるGABA作動性に関する洞察を提供しますが、他の脳領域、神経調節システム、または細胞タイプにも適用できます。

半凍結カルボゲンスクロース、CSFに保存された蛍光静脈YFPを発現する17〜24日齢のトランスジェニックラットから脳を取り出し、メスを使用して、皮質の前頭3分の1、小脳を切除し、半球を分離します。皮質の背側表面を取り除き、脳を切片化のために接着するための平らな表面を提供します。ローゼンカルボゲン天然スクロースで満たされたビオムバスで、半球をビオムステージに接着します。

CSFは海馬形成の300マイクロメートルの横スライスを切断しました。各スライスを、カルボゲンスクロース、A CSFを摂氏35度で含む水中保持チャンバーに移します。30分最後のスライスを温めたスクロースに入れた後、CSFはスライスを室温に移して保管します。

ガラスキャピラリーからパッチピペットを引き抜き、2〜4メガオームのピペット抵抗を達成します。充填したら、海馬スライスを記録チャンバーに移し、シルクの単一繊維で張られたプラチナリングで所定の位置に保持します。チャンバーを記録セットアップに置き、毎分5〜10ミリリットルの流量でカルボゲン温めた記録A CSFで灌流を開始します。

ビデオカメラを使用して、対物レンズ倍率40倍のI-R-D-I-C光学系下でスライス品質を評価します。スライスの品質が良いと仮定します。滑らかで軽くクレーター状の表面から20〜30マイクロメートル下の深さの地層パラメータに、丸く適度に対照的なca 1パラメタルセルが多数見られる場合。

エピ蛍光照明を使用して、推定される高速スパイクニューロン間ニューロンを、層パラマ内または近くに大きな多極体性を持つ静脈YFPを発現するニューロンとして特定します。次に、シナプス後電流を特定するために、生理学的に関連性のある低濃度の塩化物を含む溶液をパッチピペットに充填し、ヘッドステージのピペットホルダーに入れます。次に、チューブラインを通して低い正圧を加えます。

ピペットをスライスの表面まで下げ、選択したニューロンの中心にわずかにオフセットします。圧力を70〜80ミリバールに上げ、スライスを通してピペットを選択したセルの体細胞のすぐ上まで急速に下げます。ピペットを細胞膜に押し付けて、くぼみを作ります。

この手順は迅速に実行してください。隣接する細胞のビオチン標識を防ぐために、圧力を解放すると同時にピペットに負の20ミリボルトの電圧コマンドを適用することにより、ギガオームシールを作成します。シーリングが始まったら、電圧コマンドを予想される静止膜電位(通常はマイナス70〜マイナス60ミリボルト)に下げます。

次に、負圧の短いパルスを印加して膜パッチを破裂させ、それによって細胞全体の構成を実現します。電流クランプモードを使用して、過分極電流パルスから脱分極電流パルスのファミリーに対する応答によって、高速スパイクニューロン間ニューロンを特定します。シナプス的に誘発される応答を観察するには、細胞外刺激電極をスライス内のラジウム層とラウン層分子記録の境界に配置します。

電圧クランプ モードでは、絶縁された定電圧刺激装置を使用して、5 つの 50 ボルトの電気刺激の 1 ヘルツまたは 200 ヘルツの列を 20 秒ごとにシナプス前軸索に送達します。次に、単離されたモノを明らかにするために、イオン刺激性グルタミン酸受容体拮抗薬を浴に適用します。シナプスIPSC。

GABA A受容体拮抗薬の適用により、GABA B受容体媒介IPSCをさらに単離します。ペアリングされた録音を開始します。まず、前と同様にシナプス前ニューロンの全細胞記録を確立し、高速スパイク表現型を確認します。

次に、シナプス前ニューロンを保持するニューロン間ニューロンから20〜100マイクロメートルの距離内にあるCA1パラメタルセルにパッチを当てます。電流クランプモード。短いSRA閾値脱分極電流パルスを適用して、ニューロン間の活動電位を引き出します。

シナプス接続が存在する場合、ニューロン間の活動電位により、約1つのパラメタルセルに電圧クランプされたIPCが生成されます。接続が確立されると、シナプス前の高速スパイクニューロンで活動電位のペアを引き出し、50ミリ秒間隔で2つの脱分極刺激の典型的なペアパルスプロトコルを使用します。コントロールトレースを収集した後、選択的GABA B受容体アゴニストバクロフェンを灌流A CSFに適用し、GABA B受容体を活性化します。

次に、アンタゴニストCGP 55 8 45を適用して、受容体媒介効果を完全に遮断します。記録が完了したら、電圧クランプでピペットをセル本体からゆっくりと引き出します。シリーズで測定された抵抗が増加したら、メンブレン電圧をマイナス40ミリボルトに下げて、外側のアウトパッチを形成して体細胞膜をシールします。

録音に続いて、スライスを4.1モルリン酸緩衝液を含む4%パラホルムアルデヒドに浸し、摂氏4度の洗浄リン酸緩衝液で一晩、次にリン酸緩衝生理食塩水に浸し、10%正常ヤギ血清0.03%TRITTON X 100および0.05%アジ化ナトリウムで室温で1時間ブロックして、アルブミン発現をパーに標識します。 5%正常ヤギ血清0.3%TRITTON X 100および0.05%アジ化ナトリウムを含む溶液で希釈した抗パルブアルブミンモノクローナルマウス抗体をPBSに使用し、一次抗体を摂氏4度で2〜3日間インキュベートします。インキュベーション後、スライスをPBSで十分にすすぎ、蛍光抗米国二次抗体と蛍光色素結合タンパク質ストリッピンを併用し、蛍光色素に結合したビオチン結合タンパク質ストリッピンを塗布し、3%正常ヤギ血清0.1%トリットン×100およびPBSで希釈した0.05%ナトリウムを含む溶液でインキュベートし、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、PBSでスライスを2〜3回たっぷりとすすぎ、続いてリン酸緩衝液で2〜3回すすぎます。

スライスをスライドガラスに取り付け、300マイクロメートルの寒天スペーサーを使用してスライスが崩壊しないようにします。次に、スライスを蛍光封入剤で覆い、マニキュアで密封します。ニューロン間のパーアルブミン免疫反応性を高倍率と開口数で評価します。

対物レンズ細胞は、パーアルブミンに対して免疫反応性と見なされます。免疫標識がビオチン標識構造と一致していることがわかった場合は、レーザー走査型共焦点顕微鏡でZ軸の一連の画像を撮影し、蛍光Adenをイメージングして形態学的同定と3次元再構成を行います。次に、画像を3次元でニューロンに再構築し、樹状突起と軸索の樹状化を組み込みます。

ここでは、単一の細胞外刺激に応答した高速スパイクニューロン間ニューロンの複合シナプス応答を示しています。イオノトロピックグルタミン酸受容体拮抗薬、DNQXおよびA PV分離物の適用、モノスシナプス抑制性シナプス後電流またはgabaa受容体拮抗薬のIPSC適用。GazinはIPSCの高速コンポーネントを廃止しました。

5つの刺激の列により、遅いGABA B受容体を介したIPSCが明らかになり、その後のCGPの適用によりブロックされました。これらのトレースは、入浴後の制御条件下で、シナプス前、高速スパイクニューロン間ニューロン、およびCA 1パラメタル細胞の短潜時ユニタリーI PSCの活動電位、バクロフェンの適用、およびその後のCGPの適用を示しています。バクロフェンはIPSC振幅を約50%減少させるのに対し、GABA B受容体拮抗薬はIPSC振幅のほぼ完全な回復をもたらしたことに注意してください。

IPSC振幅の経時変化プロットは、20倍の倍率で示されたバクロフェンとCGPA高速スパイキングインターニューロンの効果を示しており、約1つの領域の地層ラジウムとパラマ人形の境界に体体があり、樹状突起が垂直に走り、すべての層にまたがっています。軸索の大部分は、バスケット細胞に典型的であるように細胞体層内および周囲に見られますが、60 倍の倍率画像は、オレンジ色のアスタリスクでマークされた推定約 1 パラメタルサラタの周りに形成される典型的な軸索のバスケットを示しています。同じニューロン間細胞の3次元再構成が、体細胞と樹状突起を黒、軸索を赤で示しています。

ca 1の層は、マスターされると青で描かれます。この手法は、開発後、一度に複数のスライスに対してポスドクの形態素解析を行うことで、1日で実行できます。この組み合わせたアプローチは、海馬と皮質の微小回路の研究者が、形態学的生理学的多様性とニューロン間のタイプの構造機能の相互関係を探求するための道を開きました。