ギャップ結合審査のための機能アッセイ;インジウム - スズ酸化物に対する接着した細胞のエレクトロポレーション

エレクトロポレーションとは、細胞膜に一過性の細孔を開けるために、生細胞に電流を流す技術です。これらの細孔を通じて、通常は細胞膜を通過しない色素やその他の分子が細胞内に入ると、細胞に損傷を与えることなく、細孔がすばやく再閉じます。接着性細胞が、導電性で透明な材料で部分的にコーティングされたスライド上で成長する際に、どのようにエレクトロポレーションできるかを説明します。

材料は酸化インジウムスズで、電流を流すと細孔が開き、細胞内に色素が入り込みます。次に、細胞にギャップ結合があるかどうか、および隣接する細胞の内部を接続して小分子の通過を可能にする小さなチャネルであるギャップ結合がいくつあるかを調べることができます。ギャップ結合コミュニケーションは、腫瘍性形質転換や転移など、細胞内でさまざまな重要な機能を持っていることが長い間認識されてきました。

Insituを使用して接着細胞エレクトロポレーションを行う方法についてのこの細胞プロジェクトのプレゼンテーションへようこそ。この画像は、黄色にルーズな蛍光色素を、透明で導電性のあるガラス上で成長する細胞に導入したことを示しています。この線までは、位相コントラストの下で線が見やすくなります。

はいどうぞ。左側の細胞からギャップ接合部を介して色素が拡散し、右側の細胞にエレクトロポレーションによって色素が充填されていることがわかります。この蛍光細胞の勾配がトライプスになります。

その後、遠心分離機でチューブに移しました。細胞がチャンバー内で成長するにつれて、細胞が十分に広がることが非常に重要です。このため、細胞を遠心分離して微量のトリプシンを除去するのが最善です。

トリプシンの微量を含む培地は、細胞から吸引され、約1ミリリットルの成長培地に再懸濁され、次いでチャンバー内でプレーティングされます。ピペットには細胞懸濁液が入っていますので、チャンバーから蓋を取り外し、細胞をチャンバーに滴下して持ち運びを容易にします。チャンバーは6センチメートルのペトリ皿に置かれます。

チャンバーはインキュベーターに戻り、細胞が成長します。めっきされた細胞はよく広がり、互いに接触するように成長し、ギャップ接合を形成します。セルがエレクトロパレードの準備ができたら、insituパルス発生器を目的の条件に設定します。

簡単なセットアッププロセスの説明については、マニュアルを参照してください。電圧がインシチューに設定されると、キーパッドの赤いライトが点灯します。温めたカルシウムを含まないDMEMの2本のボトルをウォーターバスから取り出します1つはカルシウムを含まないDMEMですが、透析血清付きで、もう1つはDMEMです。

カルシウムがない場合は、ピペットの準備ができており、ピペットに黄色を緩くロードします。ため息をつく代わりに、細胞をインキュベーターから取り出します。最初にウォッシュビーカーでメディウムを反転させて取り出します。

その後、カルシウムを含まないDMEMで一度ティッシュウォッシュに軽くたたくと、細胞が乾燥する可能性があるため、DMEMを完全に取り除こうとしないでください。ルシファーイエローをバリアに慎重に追加して、細胞を乱さないように、しかし細胞が乾燥しないように十分に速く追加します。チャンバーの半分ごとに200マイクロリットルを使用してください。

インシチューチャンバーに蓋をして、スライダーにロードします。スライダーを押して、チャンバーのエンドタブがスライダーのスロットに収まっていることを確認してください。チャンバーをチャンバーホルダーに挿入します。

パルス発生器のキーパッドのパルスボタンを押します。パルス発生器とチャンバーホルダーのLEDは、エレクトロポレーションプロセス中に赤く点滅し、次に緑色に点滅して初期化サイクルが完了したことを示します。スライダーをチャンバーホルダーの下に引き戻し、チャンバーを取り外します。

ルシファーイエローのほとんどを吸引して再度使用しますが、細胞を乾燥させないように注意してください。カルシウムを含まないDMEMを追加します。透析血清を使用すると、血清は多孔質がチャンバーを閉じるのを助け、ギャップジャンクションを介してルシファーイエローの転送が起こるためにインキュベーターに戻ります。

タイミングは、実験ごとに一貫している必要があります。標準は3分です。メディウムを廃棄物ビーカーに注ぎます。

ペーストまたはピペットで4%ホルムアルデヒド固定溶液を加え、室温で少なくとも2分間待ちます。ホルムアルデヒドを注ぎ取り、数回すすぎます。PBSでは、セルがガラスに固定されているため、洗浄中にセルが剥がれる危険性はほとんどありません。

位相コントラストの下で細胞を見ることができるようにするには、チャンバーの上部にカバースリップを置くことが重要です。チャンバーをPBSで満たし、誇り高いメニスカスを形成します。気泡を避けて、カバースリップを置きます。

PBSがあふれても心配しないでください余分なPBSを組織に吸収するだけです。倒立蛍光顕微鏡、できれば位相差のある顕微鏡とルシファーイエローのフィルターブロックが必要です。位相差のあるコントラストの下で、エレクトロポレーション領域のエッジを探します。

蛍光細胞の下に2本の線が表示されます。スライドの半分で激しく蛍光を発します。光るセルに最も近い線は、エレクトロポレーション領域の端です。

それ以上の蛍光は、ギャップ結合を介したlucer yellowの移動によるものです。例えば、この上皮細胞の画像は、画像の左側にエレクトロポップされた細胞を示しており、ルシファーイエローを隣接する非エレクトロポレーション細胞に移し、導電性コーティングの端から右側に向かって輝く細胞の勾配を作り出しています。この画像は、位相コントラストの下でのセルの同じフレームを示しています。

X線が非常にはっきりと見えることに注意してください。ギャップ結合移動がどの程度発生したかの定量的測定は、エレクトロポレーション細胞の蛍光画像と位相コントラスト画像を使用して手動で行うことができます。導電領域の縁に沿った星は、ドナー細胞と見なされます。

それらはエレクトロポレーションされ、黄色のために緩められています。彼らは黄色のlucを右側の隣接するセルに渡し、そのセルはそれを渡します。さらに減少する量で。

この場合、ドットと星の比率 41 対 8 は、この場合のギャップ結合移動の広さを比較するための数値を生成できます。5.1 はギャップ結合指数です。手動で細胞をマーキングしてカウントする代わりに、画像解析ソフトウェアを使用して、エレクトロポレーションされた細胞境界の非選択側に沿った光の相対量を測定することもできます。

これらのセルにはギャップ結合がありません。これがエレクトロポレーション領域の右端です。蛍光の勾配はなく、位相コントラストの下でギャップ結合がないことを示しています。

すべてのセルがはっきりと見えます。X線もはっきりと見えることに注意してください。この例では。

チャンバー内のすべての細胞を上皮成長因子EGFで刺激し、10分後に固定してリン酸化アークをプローブしました。右側の染色細胞はエレクトロポレーションされておらず、このラインまでの左側の細胞はエレクトロポレーションされていることに注意してください。エレクトロポレーションされていない細胞は、リン酸化IRK抗体と免疫ペルオキシダーゼによる褐色染色を示しています。

エレクトロポレーションされたリン酸化ペプチドは、グラブ2のSSH 2ドメインをブロックし、EGFのirkリン酸化を阻害したため、エレクトロポレーションされた細胞は染色を示しません。細胞がまだエレクトロではなかったラインの右側にある3〜4セルの長さの領域は、染色を示していないことに注意してください。これらは、ギャップ結合を介してエレクトロポレーションされた隣接細胞からブロッキングペプチドを獲得した細胞です。

これは、シグナルの阻害がペプチドによるものでなければならず、エレクトロポレーションのアーティファクトではあり得ないという最も強力な実証です。これらの細胞はエレクトロポレーションされていないため、これは位相コントラストで示されたフレームと同じです。エレクトロポレーション後の形態に変化がないことに注意してください。

一部の患者では、ギャップ接合部のコミュニケーションは、多種多様な培養細胞で正確に定量的にすることができます。特定のシグナル伝達経路を遮断するペプチドの導入は、タンパク質の生細胞における関連性、精製タンパク質と同定されたタンパク質相互作用を評価するための強力なアプローチです。これは、ペプチドドーム薬の開発における最初の重要なステップになる可能性があります。