ギャップ結合審査のための機能アッセイ;インジウム - スズ酸化物に対する接着した細胞のエレクトロポレーション

エレクトロポレーションは、生存細胞に電流を印加して細胞膜に一時的な孔（ポア）を開ける手法です。これらの孔を通じて、通常は細胞膜を通過できない染料やその他の分子を細胞内に導入することができ、孔は細胞に損傷を与えることなく速やかに閉鎖します。本稿では、導電性かつ透明な材料が部分的にコーティングされたスライド上で増殖している付着細胞を、どのようにエレクトロポレーションさせるかについて説明します。

材料には酸化インジウムスズが使用されており、これが電流を導くことで、染料が細胞内に進入するための孔を開けます。これにより、細胞にギャップ結合が存在するかどうか、また、隣接する細胞の内部を接続し低分子の通過を可能にする小さなチャネルであるギャップ結合がいくつあるかを調べることが可能になります。ギャップ結合を介した細胞間通信は、腫瘍化や転移を含む、細胞におけるさまざまな重要な機能を担っていることが古くから認識されています。

Insituを用いた接着細胞のエレクトロポレーション方法に関する、この細胞プロジェクトのプレゼンテーションへようこそ。この画像は、透明導電ガラス上で培養された細胞に蛍光染料のCalcein AM（黄色）を導入した結果を示しています。この線までが、位相差顕微鏡下でより明確に確認できる範囲です。

こちらをご覧ください。左側の細胞にエレクトロポレーションで導入された染料が、ギャップ結合を介して右側の細胞へと拡散しているのが分かります。その結果、細胞に蛍光の勾配が生じています。

その後、遠心分離機用チューブに移します。細胞がチャンバー内で増殖する際、十分に分散していることが非常に重要です。そのため、遠心分離を行ってトリプシンの痕跡を完全に取り除くことが最適です。

トリプシンの痕跡を含む培地を吸引して除去し、細胞を約1 mLの増殖培地で再懸濁させてから、チャンバーに播種します。ピペットに細胞懸濁液を入れ、チャンバーの蓋を取り外し、運搬しやすくするために細胞をチャンバー内に滴下します。その後、チャンバーを6 cmのペトリ皿に配置します。

チャンバーをインキュベーターに戻し、細胞を増殖させます。播種された細胞は十分に広がり、互いに接触してギャップ結合を形成します。細胞が電極操作（エレクトロパレード）に適した状態になったら、in situパルスジェネレーターを希望の条件に設定します。

簡単なセットアップ手順の詳細については、マニュアルを参照してください。in situの電圧が設定されると、キーパッドの赤色灯が点灯します。加温したカルシウム不含DMEMのボトル2本をウォーターバスから取り出します。1本は透析血清を含むカルシウム不含DMEMで、もう1本はDMEMです。

カルシウムを含まない溶液を用いて、黄色いチップをピペッターに装着して準備します。その後、細胞をインキュベーターから取り出します。まず、洗浄ビーカー内で転倒させることで培地を除去します。

次に、カルシウムを含まないDMEMを用いて組織を1回洗浄し、ティッシュで軽く吸い取ります。細胞が乾燥する可能性があるため、DMEMを完全に除去しようとはしないでください。細胞を乱さないよう注意しながら、しかし細胞が乾燥しないよう迅速に、BarrierにLucifer yellowを添加します。チャンバーの各半分に200 µLずつ使用してください。

in situチャンバーに蓋をし、スライダーにセットします。スライダーを押し込み、チャンバーの両端のタブがスライダーのスロットに確実に収まっていることを確認してください。その後、チャンバーをチャンバーホルダーに挿入します。

パルスジェネレーターのキーパッドにあるパルスボタンを押します。電送（エレクトロポレーション）プロセス中は、パルスジェネレーターとチャンバーホルダーのLEDが赤色に点滅し、その後、初期サイクルが完了したことを示すために緑色に点滅します。チャンバーホルダーの下にあるスライダーを戻し、チャンバーを取り出します。

Lucifer yellowの大部分を回収して再利用しますが、細胞を乾燥させないように注意してください。カルシウムを含まないDMEMを添加します。透析血清を用いることで、血清が孔を閉じるのを助け、チャンバーをインキュベーターに戻した後、ギャップ結合を介したLucifer yellowの転移が起こるようになります。

実験間でのタイミングを一定にする必要があります。標準は3分間です。培地を廃棄ビーカーに注いで捨ててください。

ペーストまたはピペットを用いて4% formaldehyde固定液を加えます。室温で少なくとも2分間待ちます。formaldehydeを捨て、PBSで数回洗浄します。これにより細胞がガラスに固定されるため、洗浄中に細胞が剥離する危険性はほとんどありません。

位相差顕微鏡で細胞を観察するためには、チャンバーの上にカバーガラスを設置することが重要です。チャンバーにPBSを満たし、盛り上がったメニスカスを形成させます。気泡が入らないように注意しながら、カバーガラスを設置してください。

PBSが溢れても問題ありません。余分なPBSはティッシュで吸収してください。倒立蛍光顕微鏡が必要であり、位相差機能およびLucifer yellow用フィルターブロックを備えていることが望ましいです。位相差観察下で、エレクトロポレーションを施した領域の端を確認してください。

蛍光下で2本の細胞のラインが見えます。スライドの半分は強く蛍光を発しています。光っている細胞に最も近いラインが、エレクトロポレーション領域の端に当たります。

それ以上の蛍光は、ギャップ結合を介したLucifer yellowの移行によるものです。例えば、この上皮細胞の画像では、画像の左側でエレクトロポレーションされた細胞が、隣接する非エレクトロポレーション細胞にLucifer yellowを移行させており、導電性コーティングの端から右方向に向かって発光細胞の勾配が形成されていることがわかります。この画像は、同じ細胞視野を位相差顕微鏡で観察したものです。

X線が非常にはっきりと確認できることに注目してください。ギャップ接合を介した転送がどの程度行われたかという定量的測定は、エレクトロポレーション後の細胞の蛍光像および位相差像を用いて手動で行うことができます。導電領域の端に沿って星印が付いている細胞をドナー細胞とみなします。

それらはエレクトロポレーションされ、黄色蛍光タンパク質を取り込んでいます。黄色蛍光タンパク質を右側の隣接細胞へと転送し、それがさらに次へと転送されます。この過程は、量は徐々に減少しながらさらに先に進みます。

この場合、ドットと星印の比率が41対8となり、この数値を用いることで、本例におけるギャップ結合を介した転移の広がりを比較することができます。5.1がギャップ結合指数（gap junction index）となります。細胞を手動でマーキングしてカウントする代替法として、画像解析ソフトウェアを使用し、エレクトロポレーションを施した細胞境界の非電極側における発光の相対量を測定する方法があります。

これらの細胞にはギャップ結合が存在しません。ここが電気穿孔領域の右端です。蛍光のグラデーションが見られないことから、位相差顕微鏡下でギャップ結合がないことがわかります。

すべての細胞がはっきりと確認できます。この例では、X線もはっきりと見えていることに注目してください。

チャンバー内のすべての細胞を上皮成長因子（EGF）で刺激し、10分後に固定してリン酸化arcをプローブしました。右側の染色された細胞はエレクトロポレーションを行っておらず、この線より左側の細胞はエレクトロポレーションが行われていることに注意してください。エレクトロポレーションされていない細胞では、リン酸化irk抗体と免疫ペルオキシダーゼによる茶色の染色が見られます。

エレクトロポレーションされた細胞には染まりが見られません。これは、エレクトロポレーションされたリン酸化ペプチドがGrb2のSH2ドメインをブロックし、EGFによるIrkのリン酸化を抑制したためです。線の右側にある、まだエレクトロポレーションされていない細胞が3〜4個分存在する領域においても、染まりが見られないことに注目してください。これらの細胞は、ギャップ結合を介して、エレクトロポレーションされた隣接細胞からブロッキングペプチドを取り込んだ細胞です。

これは、シグナルの抑制がペプチドによるものであること、およびエレクトロポレーションのアーティファクトではないことを示す、最大限に強力な実証です。これらの細胞はエレクトロポレーションされていないため、これは位相差顕微鏡下で示されているものと同じ視野になります。エレクトロポレーション後、形態に全く変化がないことに注目してください。

一部の患者では、多種多様な培養細胞において、ギャップ結合による細胞間通信を正確に定量化することが可能です。特定のシグナリング経路を遮断するペプチドを導入することは、精製タンパク質を用いて同定されたタンパク質間相互作用が、生細胞においてどのような関連性を持つかを評価するための強力な手法となります。これは、ペプチド医薬品の開発における極めて重要な第一歩となり得ます。