Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

この手順の全体的な目的は、エンベロープウイルス表面に存在する糖タンパク質複合体の構造を研究することです。まず、電子クライオ顕微鏡データから事前に算出されたトモグラフィーボリューム内でウイルス粒子を特定します。次に、手動で定義したデータサブセットを用いて、糖タンパク質複合体の統計的に独立した2つの初期モデルを作成します。

次に、これらのモデルを精緻化し、ウイルス粒子上のすべての糖タンパク質複合体を自動的に検出します。最終ステップでは、全データセットを用いて糖タンパク質複合体の構造を精緻化します。最終的に、分子可視化ツールを使用して、最終構造の解析を行います。

これらの糖タンパク質スパイクの三次元構造解析は、ウイルスの病原性の理解だけでなく、薬剤設計においても非常に重要です。X線結晶構造解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、天然の膜環境における膜タンパク質の構造を解明できることです。この技術は、構造生物学における重要な課題の解決に寄与します。

例えば、多くの膜含有ウイルスの構造などが挙げられます。この手法は、これらのウイルスにおける糖タンパク質複合体の知見を得るために有用ですが、リポソームに組み込まれた膜タンパク質などの他の系にも適用可能です。本手順は、私のグループのメンバーであるSleeとDavid Bittelの2名によって実演されます。

まず、B showでオートグラムファイルを開きます。パーティクルピッキングツールを使用して、ウイルス粒子の中心座標を指定し、グラム内のウイルス粒子を手動で選択します。すべてのバリアントの処理が完了するまで、この手順を繰り返します。

ウイルスの座標をstarファイルに保存します。すべてのトモグラムに対してこのプロセスを繰り返してください。次に、J_sub_tomo.pyを抽出モードで実行します。サブボリューム内の変異体を個別のボリュームファイルとして抽出するために、保存したstarファイルを入力ファイルとして使用し、2つの独立した初期モデルを生成します。

まず、卵巣サブボリュームのマップファイルを開きます。Bに示します。ツールボックスウィンドウからアクセスできるパーティクルピッキングツールを用いて、スパイクの中心座標を指定し、Varianサブボリューム内のスパイクのサブセットを選択します。

明確に区別できるすべてのスパイクを処理するまで、この手順を繰り返します。スパイクの座標をstarファイルに保存してください。約200個の糖タンパク質スパイクが処理されるまで、この手順を繰り返します。

テキストプロトコルに記載されている通り、各バリアントにビューを割り当てた後、J-subtomoを用いて実空間マスクを作成します。create_mask.pyを実行してください。次に、J-subtomoのcreate_wedge_mask.pyを用いて逆空間マスクを生成します。

逆空間マスクは、単一軸のトモグラフィーデータ収集によって生じるミッシングウェッジ領域を除外するために使用されます。次に、保存済みの選択ファイルを入力ファイルとして、J.Sub tomo create averages.PYを用いて2つの初期平均を作成します。

初期平均化におけるノイズを低減させるため、J sub tomo iterate gold PYを用いて、 previously生成された2つのモデルを反復的にアライメントし平均化します。このプロセスの両段階の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。kyiraで得られたローパスフィルター適用後のマップファイルを調べることで、構造の対称性を評価します。例えば、スパイクが三量体複合体である場合、3回対称性が認められるはずです。

テキストプロトコルに詳述されている通り、構造の精緻化を継続します。次に、JVs pyを実行して、テンプレートマッチングのためにVarian表面上に均等に配置されたシードを生成し、シードに初期視点ベクトルを割り当てます。以前に生成したstarファイルを入力ファイルとして使用し、予想されるスパイク数の約1.5倍のシードを生成してください。

このビューベクトルは、各シードポイントに最も近いスパイクの方向を近似したものです。次に、前述と同様に、ウイルス表面の独立した2つの平均値を生成します。その後、テキストプロトコルに詳しく記載されている手順に従い、シードの位置を精査します。

最後に、jvs.pyを使用して、精査したシードスターファイルからcomマーカーファイルを生成します。CMMファイルと関連するビリオンマップファイルを開き、シードを確認してください。kyiraにて行います。

精製されたシードがウイルスの膜に対して正しく配置されていることを確認してください。精製されたマーカーは、相互相関係数に基づいて色分けできます。局所テンプレートマッチングを用いて、精製されたシード周辺からVarianサブボリューム内のすべてのスパイクを自動的に特定します。特定されたスパイクをアライメントし、平均化します。その際、手動でピックアップしたスパイクのサブセットから生成された平均値を初期テンプレートとして使用してください。このプロセスの詳細は、テキストプロトコルを参照してください。結果を視覚化するには、Chimeraで精製されたスパイク構造を開いて確認してください。

原子構造のフィッティングを行います。次に、j Subo Create model DO pyを用いて、ビリオンの複合モデルを作成します。最後に、kyiraで複合モデルを開き、可視化します。

初期モデルは、手動で選択した205個のスパイクを用いて精査されました。中心にあるスパイクの3回対称性は、対称性を適用せずとも明らかであり、Varian表面上のすべてのスパイクを手動で検出するためのその後の精査ラウンドにおいて適用されました。半径43 nanometers、間隔20 degreesで各vionに対して106個のシードが生成され、それらの位置は膜に対して反復的に精査されました。

最も相関性の高い糖タンパク質スパイクパッチを用いて、最終的な平均値を算出した。この平均値は35オングストロームの分解能で解析された。その結果、中央に三量体スパイク構造が認められ、さらに隣接する6つのスパイクからの寄与があることが明らかになった。

構造を既知の位置に配置して算出したvarisの複合モデルにより、Varian表面へのスパイクの配置が明らかになりました。時折、局所的に秩序だったスパイクのパッチが認められました。この手順を行う際は、最良のデータのみを使用し、すべての中間結果を慎重に確認することが重要です。

この手順に従うことで、X線結晶構造解析の構造を最終的な平均構造にフィッティングさせ、タンパク質間相互作用をより正確に視覚化することができます。このビデオを視聴することで、J Omoを用いてウイルスエンベロープ糖タンパク質の構造を平均化する方法について十分に理解できるはずです。