Name: Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ電子低温トモグラフィーとJsubtomoを用いたウイルス被膜糖タンパク質スパイクの構造解析手法。自然な膜環境で膜タンパク質を可視化し、ウイルス病原性と創薬研究に貢献します。

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この作業は、フィンランドアカデミー(130750および218080からJ.T.H.)、ウェルカムトラスト(090532/Z/09/Z 089026からT.A.B.へ)、およびMRC(MR/J007897/1からJ.T.H.およびT.A.B.;MR/L009528/1 から T.A.B.)。

<ol><li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li>
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<li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles%3A+structural+implications+for+coat+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li>
<li>Grünewald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li>
<li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li>
<li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li>
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<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).</li>
<li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li>
<li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li>
<li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles%3A+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li>
<li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li>
<li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li>
<li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li>
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<li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li>
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<li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).</li>
<li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bsoft%3A+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li>
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<li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

<html>ビリオン膜上のウイルス糖タンパク質スパイク構造の知識は、ウイルス複製を理解し、治療し、感染を防ぐために治療薬を開発するために不可欠である。単一粒子の平均と組み合わさ電子低温顕微鏡法は、糖タンパク質スパイクを含むエンベロープウイルス粒子の構造を解決するために最も利用される方法として出現した。しかし、この方法は、対称ウイルスicosahedrallyに制限される。ここでは、Jsubtomoの電子クライオトモグラフィーとsubtomogram平均を適用することにより、私たちは他の現在の構造生物法に適さない多形性エンベロープウイルスに糖タンパク質スパイクを決定するための一般的なプロトコルを概説している。当社の代表的な結果は、この方法の解像度はドメイン構造、オリゴマー化、および無傷のビリオン上の糖タンパク質スパイクのより高次の組織への洞察を明らかにするのに十分であることを示している。 jove_contentは &quot;&gt;このプロトコルの中で最も重要なステップは、互いに統計的に独立した2つの信頼性の出発モデルを構築し、このステップが正常に実行は個人のスパイクができるように、糖タンパク質スパイクが、きつくお互いに詰め十分に大きくしていないことを前提としてい視覚的に認識され、手動で断層像で撮像し、2つの独立したモデルが平均化される。これが不可能な場合は、プロトコルの2つの修正を図ることができる。まず、二つの独立したランダムなモデルが最初にsubtomogramsの2つのランダムなサブセットを定義し、構築することができるこれらのサブセット30内subtomogramsを平均化する。第二 ​​に、孤立したスパイクの構造はX線結晶学により、例えば、他の手段によって導出された場合には、開始モデルとして用いることができるが、注意が低·に注意しなければならない洗練された次のラウンドに2つの結果のモデルが意志としてこのモデルは、低解像度のカットオフ（50〜70オングストローム）を使用して、フィルタを通過これだけの解像度を超えて統計的に独立している。この警告のために、前者のアプローチをお勧めします。 このプロトコルから得られる分解能は四大要因に依存して、i。データ収集の戦略と入力データの品質こと、ii。 subtomograms数、III。アライメントsubtomogramsの正確性、およびiv。構造の不均一性。第一及び第二の制限は、主に高い信号対雑音直接電子CTFと組み合わせた検出器断層撮影法を修正し、自動データ収集を使用することによって克服することができるが、位置合わせ精度がさらに関心自体の構造のサイズおよび形状に影響される。顕著な特徴を欠いている小さなスパイクでこのプロトコルを適用する場合は、アライメント精度、したがって、分解能31を改善するためにスパイクにFabフラグメントを結合することが有利で ​​あり得る。最後に、構造体は、平均化される場合は、出品物の複数の立体配座、サブtomogr午前分類方法は、個別に異なるコンホメーションを平均化するために使用することができる。そのために、Jsubtomoは強力subtomogram分類9を提供し、ディナモ·パッケージに統合されています。 上記のプロトコルは、単離されたウイルス糖タンパク質のX線結晶学に相補的である。結晶構造は、ビリオン膜に対する糖タンパク質の正確な配向を得るために、サブ断層像の平均に嵌合することができる。この方法論の適用は、間違いなくエンベロープウイルスの構造と病理生物学に光を当てるしていきます。

クライオ電子断層撮影法は、複雑な生物学的標本の3次元（3D）再構成の計算を可能にする電子低温顕微鏡イメージング技術である。適当な標本は、全体の原核細胞5および全真核細胞6のさえ薄い領域まで精製高分子複合体1、フィラメント2、被覆小3、および多形性膜ウイルス4の範囲である。傾斜シリーズ、3D断層撮影ボリューム、または断層像のデータ収集に続いて、Bsoft 7およびIMOD 8を含むいくつかの確立されたソフトウェアパッケージを用いて計算することができる。 クライオ電子断層撮影制限対応する断層ボリュームの生物学的解釈による生体試料の研究に固有の二つの側面。まず、有意な放射線損傷を導入する前に、生物学的材料に適用することができる限定された電子線量に起因し、シグナ断層データでlの対雑音比は、典型的には非常に低い。第二に、データ収集中に限られたサンプル傾斜ジオメトリの結果として、オブジェクトの一部のビューは、断層ボリューム内のいわゆる「欠落ウェッジ」アーチファクトにつながる、存在しないままである。断層ボリュームが正常9-12を平均化することができるような巨大分子複合体と同一の構造を、繰り返し含まれている場合は、これらの制限の両方を克服することができる。 断層像再構成の構造を平均する前に、目的のオブジェクトが発見され、同じ方向に揃えておく必要があります。そのような構造体を配置することをしばしば13テンプレートマッチングと呼ばれる手法を用いた断層ボリュームテンプレート構造の相互相関によって達成することができる。このマッチング処理で使用されるテンプレートは、クライオ電子顕微鏡または3D再構成と組み合わさクライオ電子断層撮影法から誘導され得るか、またはそれからシミュレートされた密度マップすることができ原子構造。いくつかの計算のパッケージは、これらのタスク11を実行するために開発されてきた。 例えば、HIV-1のような膜ウイルスの糖タンパク質スパイクの平均化、それらの構造14〜16を研究するための特に成功アプローチしている。構造の理解は、ウイルス - 宿主相互作用の分子基盤の両方を明らかにし、抗ウイルス剤およびワクチン設計の開発をガイドするための不可欠です。巨大分子結晶学は、個別のウイルス糖タンパク質およびそれらの複合体の構造解析（4Åよりも通常より良い）、高解像度のための選択の技術であるが、この方法から得られるX線構造は、ビリオンの自然膜状の環境から単離されたタンパク質である。したがって、例えば、ウイルス糖タンパク質の高次アーキテクチャなどの重要な詳細は、ビリオンの文脈において、欠けているままである。一方、電子低温顕微鏡法および単一粒子再建全体のエンベロープウイルスの正20面体対称17,18とビリオンに制限されています。サブボリュームの配置と組み合わせた電子cryotomographyは、このように、その場で不規則な形状、多形性ウイルスの糖タンパク質スパイクの研究を可能にする補完的な技術として浮上している。 私たちは、Jsubtomo断層サブボリュームの検出、位置合わせ、および平均化（www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo）というソフトウェアを開発しました。 Jsubtomoは細胞およびウイルスの構造19-26数の構造決定に利用されている。ここでは、決定、ウイルス表面のスパイク構造を可能にする詳細なプロトコルを概説しています。ノイズを相関させることによって、過剰洗練平均した構造の回避するために、「ゴールドスタンダード」の改良方式が10,27を採用しています。最後に、典型的な結果の可視化と解釈のための戦略が議論されている。

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>オックスフォード大学</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

jsubtomoを用いた電子cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

エンベロープウイルスは、宿主細胞への侵入を媒介するそれらの表面上に膜糖タンパク質を利用する。これらの糖タンパク質「スパイク」の三次元構造解析は、多くの場合、ウイルスの病原性を理解するための薬物設計における技術的に困難だが重要である。ここで、プロトコルは、電子クライオ断層撮影データの計算、平均化を介してウイルスのスパイク構造決定のために提示されている。クライオ電子断層撮影は、ネイティブに近い、凍結水和状態における膜ウイルスなど多形の生物学的標本の3次元断層ボリューム再構築、または断層像を導出するために使用される電子顕微鏡の技術である。これらの断層像は、低解像度ではあるが、三次元の関心の構造を明らかにする。サブボリューム、またはサブ断層像の計算平均、例えば、ウイルス糖タンパク質スパイクなどの構造モチーフを、繰り返しの高解像度の詳細を取得する必要がある。アリのための詳細な計算アプローチgningとJsubtomoソフトウェアパッケージを使用してサブ断層像を平均化することが概説されている。このアプローチは、ビリオン膜上の高次スパイク·ツー·スパイクの相互作用の研究の20〜40オングストロームの範囲の解像度と研究にウイルス糖タンパク質スパイクの構造の可視化を可能にします。典型的な結果をBunyamweraウイルス、 ブニヤウイルス科からのエンベロープウイルスのために提示されています。このファミリーは、ヒトおよび動物の健康に脅威を与え、病原体の構造的に多様なグループです。

私たちは、24セット 、以前に公開されたデータを使用してBunyamweraウイルス（Orthobunyavirus、 ブニヤウイルス科 ）のエンベロープ糖タンパク質複合体について上記に概説されたサブ断層アベレージングワークフローの適用を実証する。データ収集および精密化パラメーターを表1に示す。一つの代表的断層像は、 図2に示されている。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> パラメータ（単位） </td><td> 値 </td></tr><tr><td> データ収集 </td><td></td></tr><tr><td>電圧（kVの） </td><td> 300 </td></tr><tr><td>キャリブレーション済みの倍率（X） </td><td> 111000 </td></tr><tr><td>画素サイズ（Å） </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td>推定線量（E - /Å2） </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus（μm）と</td><td> 4.0〜4.5 </tD&gt; </tr><tr><td>まずCTFゼロ（Å）A </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td>チルト範囲（°） </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td>チルトサンプリング（°） </td><td> 3 </td></tr><tr><td> データと洗練 </td><td></td></tr><tr><td>断層像</td><td> 11 </td></tr><tr><td>ビリオン</td><td> 29 </td></tr><tr><td>ビリオンあたり種子</td><td> 106 </td></tr><tr><td>種子の総数</td><td> 3074 </td></tr><tr><td>検出されたスパイク</td><td> 1,346 </td></tr><tr><td>重複を除去した後スパイク</td><td> 1,401 </td></tr><tr><td>相互相関に基づく選択後にスパイク</td><td> 1022 </td></tr><tr><td>最終的な平均に含まスパイク</td><td> 1022 </td></tr><tr><td>対称性</td><td> C3 </td></tr><tr><td>角度サンプリング（°） </td><td> 8 </td></tr><tr><td>解像度洗練で使用範囲（Å） </td><td> 42から334 </td></tr><tr><td>最終的な解像度の見積もり（Å）B </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> 表1：Bunyamweraデータ収集及び精密化統計。 CTF、コントラスト伝達関数。 B 0.143の閾値で2つの独立して洗練された構造の間のフーリエシェル相関を用いて算出。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> 図2：Bunyamweraビリオンの断層を通じてスライス各ビリオンの周辺で明らかにいくつかのスパイクサイドビューは矢印で示されている。断層像は、低域60オングストローム濾過された。スケールバーは100nm。 まず、205手動で選んだスパイクを使用して初期モデルを（精製<strong&gt;図3）。最も中心にあるスパイクの三回対称性は、任意の対称性（ 図3B）を適用せずに明らかであったと洗練のその後のラウンド（ 図3C）に課された。ビリオン表面上に自動的にすべてのスパイクを検出するために、私たちは43 nmおよび20度（ 図4A）の間隔の半径でそれぞれビリオンのための106の種を生成し、反復して膜（ 図4B）の相対的な位置を洗練。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> 図3：初期テンプレート構造の改良。 （A）は円筒はスパイクの手動で定義された位置から構築（C100）のテンプレートを平均した。（B）いずれかの対称性（C1）のない洗練された5回の三倍を付けて表示しスパイクを課した後の濃度を平均化対称特徴。モデルの解像度は48オングストロームである。スパイクの（C）の平均は、3回対称性を持つ洗練された5ラウンド後に41Åで決議した。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> 図4：種子の改良 （A）と（b）の後に洗練前の種子のAB）のサブセットは、図2から1ビリオン密度に示されている（B）中の種子は、それぞれのクロスに基づいて色分けされています相関係数（青、低い相関;赤、高い相関）。 （重複を除去した後、トップ75％;〜千スパイク）最高の相関糖タンパク質スパイクパッチは、最終的な平均を計算するために使用した。平均値は、35オングストロームの分解能（ 図5）に解決されました。それは、途中で三量体スパイク構造を明らかにした6近隣のスパイクからいくつかの貢献に加えて。既知の位置に構造を配置することによって計算されたビリオンの複合モデルは、（ 図6A）、ビリオン表面上のスパイクの配置を明らかにした。時折、スパイクのローカルに順序付けられたパッチは、（ 図6B）明らかであった。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> 図5：テンプレートマッチング後の糖タンパク質スパイク層のパッチの洗練された構造。 「偶数」および「奇数」（AB）2マップデータの両半分からの再構成が示されている。 2マップは、アプローチの妥当性を検証する、注目すべき程度の類似性を示している。 2マップは、互いに完全に独立して再構築さ​​れてきたように、スパイク長軸周りの向きが異なっている。 （C）は、2つのマップの平均はで示されている35オングストロームの最終的な解決。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> 図6：Bunyamweraビリオン上のスパイクの配置。 （A）ビリオンの複合モデル。ビューベクトル（スティック）がスパイクの向きを示している。色は各スパイクやテンプレート構造間の相互相関を示している。（青、低い相関;赤、高い相関を）、（B）のスパイクの順序付きパッチのクローズアップ。

電子クライオトモグラフィーとサブトモグラム平均化の組み合わせを使用して、ウイルス膜糖タンパク質複合体の構造を決定するためのアプローチが提示されています。

Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

この手順の全体的な目的は、エンベロープウイルス表面に存在する糖タンパク質複合体の構造を研究することです。まず、電子クライオ顕微鏡データから事前に算出されたトモグラフィーボリューム内でウイルス粒子を特定します。次に、手動で定義したデータサブセットを用いて、糖タンパク質複合体の統計的に独立した2つの初期モデルを作成します。次に、これらのモデルを精緻化し、ウイルス粒子上のすべての糖タンパク質複合体を自動的に検出します。最終ステップでは、全データセットを用いて糖タンパク質複合体の構造を精緻化します。最終的に、分子可視化ツールを使用して、最終構造の解析を行います。これらの糖タンパク質スパイクの三次元構造解析は、ウイルスの病原性の理解だけでなく、薬剤設計においても非常に重要です。X線結晶構造解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、天然の膜環境における膜タンパク質の構造を解明できることです。この技術は、構造生物学における重要な課題の解決に寄与します。例えば、多くの膜含有ウイルスの構造などが挙げられます。この手法は、これらのウイルスにおける糖タンパク質複合体の知見を得るために有用ですが、リポソームに組み込まれた膜タンパク質などの他の系にも適用可能です。本手順は、私のグループのメンバーであるSleeとDavid Bittelの2名によって実演されます。まず、B showでオートグラムファイルを開きます。パーティクルピッキングツールを使用して、ウイルス粒子の中心座標を指定し、グラム内のウイルス粒子を手動で選択します。すべてのバリアントの処理が完了するまで、この手順を繰り返します。ウイルスの座標をstarファイルに保存します。すべてのトモグラムに対してこのプロセスを繰り返してください。次に、J_sub_tomo.pyを抽出モードで実行します。サブボリューム内の変異体を個別のボリュームファイルとして抽出するために、保存したstarファイルを入力ファイルとして使用し、2つの独立した初期モデルを生成します。まず、卵巣サブボリュームのマップファイルを開きます。Bに示します。ツールボックスウィンドウからアクセスできるパーティクルピッキングツールを用いて、スパイクの中心座標を指定し、Varianサブボリューム内のスパイクのサブセットを選択します。明確に区別できるすべてのスパイクを処理するまで、この手順を繰り返します。スパイクの座標をstarファイルに保存してください。約200個の糖タンパク質スパイクが処理されるまで、この手順を繰り返します。テキストプロトコルに記載されている通り、各バリアントにビューを割り当てた後、J-subtomoを用いて実空間マスクを作成します。create_mask.pyを実行してください。次に、J-subtomoのcreate_wedge_mask.pyを用いて逆空間マスクを生成します。逆空間マスクは、単一軸のトモグラフィーデータ収集によって生じるミッシングウェッジ領域を除外するために使用されます。次に、保存済みの選択ファイルを入力ファイルとして、J.Sub tomo create averages.PYを用いて2つの初期平均を作成します。初期平均化におけるノイズを低減させるため、J sub tomo iterate gold PYを用いて、 previously生成された2つのモデルを反復的にアライメントし平均化します。このプロセスの両段階の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。kyiraで得られたローパスフィルター適用後のマップファイルを調べることで、構造の対称性を評価します。例えば、スパイクが三量体複合体である場合、3回対称性が認められるはずです。テキストプロトコルに詳述されている通り、構造の精緻化を継続します。次に、JVs pyを実行して、テンプレートマッチングのためにVarian表面上に均等に配置されたシードを生成し、シードに初期視点ベクトルを割り当てます。以前に生成したstarファイルを入力ファイルとして使用し、予想されるスパイク数の約1.5倍のシードを生成してください。このビューベクトルは、各シードポイントに最も近いスパイクの方向を近似したものです。次に、前述と同様に、ウイルス表面の独立した2つの平均値を生成します。その後、テキストプロトコルに詳しく記載されている手順に従い、シードの位置を精査します。最後に、jvs.pyを使用して、精査したシードスターファイルからcomマーカーファイルを生成します。CMMファイルと関連するビリオンマップファイルを開き、シードを確認してください。kyiraにて行います。精製されたシードがウイルスの膜に対して正しく配置されていることを確認してください。精製されたマーカーは、相互相関係数に基づいて色分けできます。局所テンプレートマッチングを用いて、精製されたシード周辺からVarianサブボリューム内のすべてのスパイクを自動的に特定します。特定されたスパイクをアライメントし、平均化します。その際、手動でピックアップしたスパイクのサブセットから生成された平均値を初期テンプレートとして使用してください。このプロセスの詳細は、テキストプロトコルを参照してください。結果を視覚化するには、Chimeraで精製されたスパイク構造を開いて確認してください。原子構造のフィッティングを行います。次に、j Subo Create model DO pyを用いて、ビリオンの複合モデルを作成します。最後に、kyiraで複合モデルを開き、可視化します。初期モデルは、手動で選択した205個のスパイクを用いて精査されました。中心にあるスパイクの3回対称性は、対称性を適用せずとも明らかであり、Varian表面上のすべてのスパイクを手動で検出するためのその後の精査ラウンドにおいて適用されました。半径43 nanometers、間隔20 degreesで各vionに対して106個のシードが生成され、それらの位置は膜に対して反復的に精査されました。最も相関性の高い糖タンパク質スパイクパッチを用いて、最終的な平均値を算出した。この平均値は35オングストロームの分解能で解析された。その結果、中央に三量体スパイク構造が認められ、さらに隣接する6つのスパイクからの寄与があることが明らかになった。構造を既知の位置に配置して算出したvarisの複合モデルにより、Varian表面へのスパイクの配置が明らかになりました。時折、局所的に秩序だったスパイクのパッチが認められました。この手順を行う際は、最良のデータのみを使用し、すべての中間結果を慎重に確認することが重要です。この手順に従うことで、X線結晶構造解析の構造を最終的な平均構造にフィッティングさせ、タンパク質間相互作用をより正確に視覚化することができます。このビデオを視聴することで、J Omoを用いてウイルスエンベロープ糖タンパク質の構造を平均化する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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