Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

この手順の全体的な目標は、エンベロープウイルスの表面に存在する糖タンパク質複合体の構造を研究することです。これは、まず、クライオ電子顕微鏡データから事前に計算された断層撮影ボリューム内のウイルス粒子を特定することによって達成されます。2番目のステップは、手動で定義されたデータのサブセットを使用して、糖タンパク質複合体の統計的に独立した2つの初期モデルを作成することです。

次に、これらのモデルを改良し、ウイルス粒子上のすべての糖タンパク質複合体を自動的に検出するために使用されます。最後のステップは、完全なデータセットを使用して糖タンパク質複合体の構造を改良することです。最終的には、分子可視化ツールを使用して最終的な構造を解釈します。

これらの糖タンパク質スパイクの3次元構造解析は、ウイルスの病因を理解するだけでなく、医薬品の設計においても非常に貴重です。この手法がX線結晶構造解析などの既存の方法よりも優れている点は、この手法により、天然の膜環境における膜タンパク質の構造を解明できることです。この手法は、構造生物学の主要なトピックに対処するのに役立ちます。

例えば、ウイルスを含む多くの膜の構造。この手法は、これらのウイルスの糖タンパク質複合体に関する洞察を得ることができますが、リポソームに組み込まれた膜タンパク質などの他のシステムにも適用できます。この手順は、私のグループの2人のメンバー、SleeとDavid Bittelによって実演されます。

まず、B showでオートグラムファイルを開きます。粒子ピッキングツールを使用してウイルス粒子の中心座標を定義することにより、グラム単位でウイルス粒子を手動で選択します。すべてのバリアントが処理されるまで、この手順を繰り返します。

ウイルス座標をスターファイルに保存します。すべてのトモスに対してこのプロセスを繰り返します。次に、J sub tomo py を抽出モードで実行します サブボリュームの varie を個々のボリューム ファイルに抽出するには、保存したスター ファイルを入力ファイルとして使用して、2 つの独立した初期モデルを生成します。

まず、卵巣サブボリュームマップファイルを開きます。Bショーで。Varian サブボリュームのスパイクのサブセットを選択するには、ツールボックス ウィンドウからアクセスできるパーティクル ピッキング ツールを使用してスパイクの中心座標を定義します。

すべての明確に区別されたスパイクが処理されるまで、この手順を繰り返します。スパイク座標をスター ファイルに保存します。約 200 個の糖タンパク質スパイクが処理されるまで、この手順を繰り返します。

テキストプロトコルで説明されているように、ビューをバリアンに割り当てた後、J sub tomo を使用して実空間マスクを作成します。マスク py を作成します。次に、J sub tomo create wedge mask py を使用して逆数空間マスクを生成します。

逆数スペースマスクは、単一軸断層撮影データ収集の結果として、欠落しているウェッジ領域の領域を除外するために使用されます。次に、J.Sub tomo create averagesを使用して2つの初期平均を作成します。保存された選択ファイルを入力ファイルとして使用する PY。

初期平均のノイズを減らすために使用するには、以前に生成された 2 つのモデルを J サブ トモ イテレート ゴールド PY で反復的に整列し、平均化します。このプロセスの両方の段階の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。構造の対称性の程度を評価するには、結果として得られるローパス フィルター付きマップ ファイルを kyira で調べます。たとえば、スパイクが三量体複合体の場合、3 重の対称性が明らかになるはずです。

テキストプロトコルで詳しく説明されているように、構造の改良を続けます。次に、テンプレートのマッチングのために Varian サーフェス上に均等に配置されたシードを生成し、JVs py を実行してシードに初期ビュー ベクトルを割り当てます。以前に生成されたスター ファイルを入力ファイルとして使用すると、予想されるスパイク数の約 1.5 倍のシードが生成されます。

このビュー ベクトルは、各シード ポイントに最も近いスパイクの方向を近似します。次に、前と同様にウイルス表面の 2 つの独立した平均を生成します。次に、テキスト プロトコルで詳しく説明されているように、シードの位置を調整します。

最後に、jvs.py を使用して、精製されたシードスターファイルのCOMマーカーファイルを生成します。CMMファイルと関連するvirionマップファイルを開いて、シードを調べます。キイラで。

精製された種子がウイルス膜に対して正しく位置合わせされていることを確認してください。微調整されたマーカーは、相互相関に基づいて色付けできます 係数は、ローカル テンプレートを使用して Varian サブボリューム内のすべてのスパイクを自動的に特定し、調整されたシードの周りを一致させ、配置されたスパイクを整列して平均化します 手動で選択したスパイクのサブセットから生成された平均を初期テンプレートとして使用します。このプロセスの詳細については、結果を視覚化するためのテキストプロトコルで見つけることができ、視覚化のためにkyiraのスパイクの精製された構造を開きます。

原子構造を適合させます。次に、j Subo Create model DO py を使用して、virion の複合モデルを作成します。最後に、キイラで視覚化するための複合モデルを開きます。

初期モデルは、205本の手摘みスパイクを使用して改良されました。三重。中央のスパイクの対称性は、対称性を適用しなくても明らかであり、その後の Varian 表面上のすべてのスパイクを手動で検出するための改良ラウンドに課せられました。半径43ナノメートル、間隔20度の間隔で各ビオンに対して106個のシードを生成し、それらの位置をメンブレンに対して繰り返し精製しました。

最も相関性の高い糖タンパク質スパイクパッチを使用して、最終平均を計算しました。平均は35オングストローム分解能に分解されました。その結果、中央に三量体のスパイク構造があり、さらに隣接する6つのスパイクからの寄与も明らかになりました。

構造を既知の位置に配置することによって計算された変量の複合モデルにより、バリアン表面にスパイクが配置されていることが明らかになりました。時折、局所的に整然としたスパイクのパッチが明らかになりました。この手順を試行するときは、最適なデータのみを使用し、すべての中間結果を慎重に確認することが重要です。

この手順に従って、X線結晶構造を最終平均に当てはめ、タンパク質間相互作用をより正確に把握することができます。このビデオを見れば、J Omoを使用してウイルスエンベロープ糖タンパク質構造を平均化する方法について十分に理解できるはずです。