Name: 細菌のための2つの成分規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶ細菌の2成分規制システムにおける応答調節因子のゲノム結合部位を特定するDAP-Chip法。タグ付きタンパク質の精製とin vitroリン酸化により、遺伝子標的を効率的に同定できます。

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私たちは、ビデオ撮影の準備で彼女の助けと技術を実証するためのエイミー·チェンに感謝します。エニグマが行ったこの作品：遺伝子および分子集合体（http://enigma.lbl.gov）と生態系とネットワークの統合、ローレンスバークレー国立研究所の科学重点領域プログラム、科学局によってサポートされていました、生物のOfficeと契約番号DE-AC02-05CH11231下、米国エネルギー省の環境研究、。

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著者らは、開示することは、特別の利害関係はありません。

ここで説明DAPチップ方式が正常つが代表的結果として示されているのビブリオ尋常 Hildenborough 7におけるいくつかのRRのための遺伝子標的を決定するために使用された。 RR DVU3023、候補遺伝子ターゲットを選択することは簡単でした。 DVU3025は、RR遺伝子のすぐ下流に位置し、RRおよび標的遺伝子は、いくつかのビブリオ種において保存され、さらに、予測DVU3025 sigma54依存性プロモーターを有する。 EMSAは急速候補標的遺伝子への結合についてRRをテストするための簡単​​な方法を提供し、また、精製されたタンパク質試料の活性の評価を可能にするだけでなく、最適なタンパク質-DNA結合条件を決定する。 DNA結合活性はまた、リン酸化は、DNA結合に必要であるかどうかをアセチルリン酸の存在下及び非存在下で試験することができる。すべてのRRは、小分子ドナーによってリン酸化されるわけではありません図9に示すように、これらの場合には精製された同族センサーキナーゼは、利用可能な場合、タンパク質を活性化するた...

生存し繁殖する細菌の能力は、それらが知覚とその環境における摂動に応答することができるどの程度に決定的に依存し、これは順番に、それらのシグナル伝達系に依存する。信号システム細菌エンコードの数は、その「微生物のIQ」と呼ばれているとその環境の変動と複数の信号を感知する能力を微調整その応答1の両方を示している可能性があり。二成分シグナル伝達系（TCS）細菌によって使用される最も普及しているシグナル伝達系であり、それらは外部信号を感知し、エフェクターレスポンスレギュレーター（RR）2リン酸化を介して送信するヒスチジンキナーゼ（HK）からなる。 RRは、出力領域の様々なため、異なるエフェクターのモードを持つことができますが、最も一般的な応答は、ドメイン1のDNA 結合を介した転写調節です。信号が感知され、VASの対応する機能のTCSsのT大半は不明のままである。 このようなChIPチップ等のインビボ方法は、日常的に、転写のゲノム結合部位の決定のために使用されているが3因子活性化状態または信号が既知である場合、それらは、細菌の二成分系資源レコードのために使用することができる。多くの場合、TCSをアクティブに環境手がかりは、その遺伝子標的よりも決定することが困難です。ここに記載したインビトロマイクロアレイに基づくアッセイは、効果的かつ迅速に遺伝子標的を決定し、のTCSsの機能を予測するために使用することができる。このアッセイは、RRがリン酸化され、従って、アセチルリン酸4などの小分子供与体を用いてインビトロで活性化することができるという事実を利用する。 この方法では、DNA-親和性精製チップ（ 図1）DAP-チップという、目的のRR遺伝子はE.でHisタグにクローニングする大腸菌 、そして続いて精製タグを付けたタンパク質を双方向に許可されているNDゲノムDNAをせん断した。タンパク質に結合したDNAは、その後、アフィニティー精製、濃縮し、入力DNAによって濃縮されて増幅され、蛍光標識されたが、一緒にプールし、カスタム目的の生物（ 図1）に対して行われるタイリングアレイにハイブリダイズ。マイクロアレイ実験は、アーチファクトを受けやすく、したがって、追加のステップは、アッセイを最適化するのに用いられる。一つのそのような工程は、（ 図2のワークフローを参照）を電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて、研究中のRR毎にターゲットを決定しようとすることである。その後、ゲノムDNAおよびDAPステップに結合した後、タンパク質結合及び投入DNAは、このように最適な結合条件を確認し、正のターゲットは入力割合と比較して、タンパク質に結合した画分に濃縮されているかどうかを確認するために定量PCRによって調べられるRR（ 図2）。アレイハイブリダイゼーションの後、データは、ゲノム遺伝子座タンパク質hを示す高強度信号のピークを見つけるために分析される広告が結合した。関数が得られた遺伝子標的に基づいて、RRのために予測することができる。標的ゲノム遺伝子座を、次いで、実験的にEMSAを（ 図2）を用いて検証される結合部位モチーフを予測するために使用される。 RRのための機能的予測および遺伝子標的は、次いで密接に（ 図2）と類似の結合モチーフをそれらのゲノムをスキャンすることによってオーソロガスRRをコードする種が関連するように拡張することができる。 DAPチップ方式は、以前に何もありませんでしたTCSのための豊富な情報を提供することができます。この方法はまた、タンパク質を精製することができ、DNA結合条件を決定することができる場合、任意の転写調節のために使用され、ゲノム配列を有する関心対象の任意の生物に利用可能することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。のDNAアフィニティー精製したチップ（DAP-チップ）戦略7。目的の生物からのRR遺伝子を大腸菌にカルボキシ末端Hisタグでクローン化される大腸菌発現株。精製されたHisタグ付きタンパク質は、アセチルリン酸とリン酸化により活性化され、剪断されたゲノムDNAと混合する。残りは、Ni-NTA樹脂を用いてアフィニティー精製を行っている間の結合反応のアリコートを、入力DNAとして保存される。入力およびRR-結合したDNAは、増幅全ゲノムであり、それぞれCy3およびCy5で標識。標識されたDNAを一緒にプールし、次いで、遺伝子標的を決定するために分析されたタイリングアレイにハイブリダイズされる。図は、修正され、7からクリエイティブコモンズライセンスを使用して復刻。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。ワークフローの概要。任意の精製されたタグが付いprotei用nは、EMSAを使用してターゲットを決定することから始めます。許可したゲノムDNAを結合して、DNA-アフィニティ精製するタンパク質（DAP）、全ゲノム（WGA）濃縮し、入力DNAを増幅する。遺伝子標的が既知である場合、公知の標的は、タンパク質結合画分中に濃縮されることを確実にするために定量PCRを使用する。標的が決定できなかった場合には、DNAの標識およびアレイハイブリダイゼーションに直接進む。定量PCRによる濃縮が観察されなかった場合には、結合タンパク質のgDNAと異なるタンパク質の量を使用してDAP-WGAステップを繰り返す。ピークを見つけ、遺伝子をターゲットにマップするために、配列解析を使用してください。結合部位モチーフを予測するために、標的遺伝子の上流領域を使用してください。 EMSAをを使用して実験的にモチーフを検証します。研究中のRRのオルソログをコードする近縁種のゲノムをスキャンし、同様にそれらの種で標的遺伝子を予測するモチーフを使用してください。得られた遺伝子標的に基づいて、RRおよびそのオーソログの生理学的機能を予測することができる。図は、創造的なCを使用して修正して復刻ommonsは7からライセンス。

<table><tbody><tr><td>HisTrapFFカラム(Ni-セファロースカラム)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (FPLC装置)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 脱塩カラム</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel extraction kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン標識オリゴヌクレオチド</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6%ポリアクリルアミド-0.5x TBEプレキャストミニDNA遅延ゲル</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>あるいは、お手持ちのゲルを注ぐこともできます。</td></tr><tr><td>ナイロン膜</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV 架橋剤 Model XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA アガロース樹脂</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td> DNA Perfecta Sybr Green SuperMixの<td></td><td>定量には</td></tr><tr><td>、ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>任意のSybr Green PCRミックスを使用できます</td></tr><tr><td>qPCR用PlateMax超透明ヒートシールフィルム</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96-well clear low profile PCR microplate</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>APPLIED BIOSYSTEMS StepOne Plus リアルタイムPCRシステム</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>任意のリアルタイムPCRシステムを使用できます</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR精製キット</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>任意のPCRクリーンアップキットを使用できます</td></tr><tr><td>Cy3/Cy5標識ノンアマー</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, 米国</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow ポリメラーゼ 50,000 U/ml, 3'-5' exo-</td><td>ニューイングランド バイオラボス, イプスウィッチ, マサチューセッツ</td>州 <td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションシステム</td><td>ロシュ・ニンブルゲン, マディソン, ウィスコンシン州, 米国</td><td>N/A</td><td>この会社はもはやアレイや関連アイテムを製造していないため、AgilentやAffymetrixなどの代替ソースを使用する必要があります。</td></tr><tr><td>カスタムプリントマイクロアレイおよびミキサー</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションキット (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A マイクロアレイスキャナー</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>このモデルは、優れたモデル</td><td></td>に置き換えられました</tr><tr><td>GenePix Pro マイクロアレイ ソフトウェア</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、dna親和性精製チップ（dap-チップ）方法

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

このようなChIPチップインビボ方法において 、転写因子のためのグローバルな遺伝子標的を決定するために使用される十分に確立された技術である。しかし、彼らは特徴づけられていない活性化条件で、細菌の2成分の規制制度を模索中使用が制限されている。このようなシステムは、ユニークな信号の存在下で活性化する場合にのみ転写を調節する。これらの信号はしばしば不明であるので、このビデオ資料に記載のインビトロマイクロアレイベースの方法は、遺伝子標的および応答調節因子の結合部位を決定するために使用することができる。このDNA-アフィニティー精製チップ法は、配列決定されたゲノムを有する任意の生物の任意の精製されたレギュレータに使用されてもよい。プロトコルは、精製されたタグが付いたタンパク質は、カスタムタイリングアレイへのDNAとハイブリダイゼーションの蛍光標識に続いて、タンパク質に結合したDNAを剪断ゲノムDNAに結合して、親和性浄化することができますが含まれます。仕するためのアッセイを最適化するために使用され得る工程の前にCレギュレータはまた、記載されている。アレイデータの分析によって生成されたピークは、次いで、実験的に検証される結合部位モチーフを予測するために使用される。モチーフの予測は、さらに密接に関連した種にオルソロガス応答調節因子の遺伝子標的を決定するために使用することができる。私たちは、遺伝子標的を決定し、サイトのモチーフを結合し、このような環境細菌デスルホビブリオ尋常 Hildenborough中sigma54依存応答レギュレータDVU3023機能を予測することにより、この方法の適用可能性を実証する。

上記の方法は、 デスルホビブリオ尋常 Hildenborough 7細菌を減らすモデル硫酸でRRの全体的な遺伝子ターゲットを特定するために適用した。この生物は、それが感知して応答することができる信号の多種多様を示し、70以上のRRで表されるのTCSsが多数ある。 インビボでは 、これらの信号システムの機能について解析し、それらの信号ので、実行するのは難しいので、それらの活性化条件である知られていない。ここで、DAP-チップ法は、遺伝子標的を決定し、従って、代表的なRRのDVU3023可能な機能を予測するために使用した。 DVU3023は、その同族HK（ 図3A）とオペロンでエンコードされたシグマ54-依存のRRです。 C-末端Hisタグ遺伝子が中にクローン化し、 大腸菌から精製した大腸菌初期標的決定のために、精製されたRR、10遺伝子オペロン（DVU3025-3035）cは、その下流オペロンへの結合について試験した乳酸取り込みおよび酸化遺伝子のonsis...

このビデオの記事は、遺伝子標的と2成分系の応答調節因子の結合部位を決定するためのin vitroのマイクロアレイベースの方法を説明します。

細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

本実験の全体的な目的は、in vitro マイクロアレイベースのアッセイを用いて、細菌の二成分制御系レスポンスレギュレーターのゲノム結合部位を決定することである。これは、タグ付きレスポンスレギュレータータンパク質をクローニングおよび精製し、in vitro リン酸化によって活性化させ、さらに電気泳動移動度シフトアッセイを用いて1つの標的遺伝子を決定し、それを後続のマイクロアレイ工程のポジティブコントロールとして利用することで達成される。第2段階として、精製したレスポンスレギュレータータンパク質をゲノムDNAと混合し、アフィニティー精製を用いて、タンパク質結合DNAを入力DNAから分離させる。次に、タンパク質結合DNAおよびインプットDNAを増幅し、タンパク質結合画分におけるポジティブコントロール遺伝子ターゲットの濃縮をQPCRで確認した後、蛍光標識を施してプールし、タイリングマイクロアレイにハイブリダイズさせます。レスポンスレギュレーターのゲノム結合部位を決定することで、解析対象のレスポンスレギュレーターによって制御されている可能性が最も高い遺伝子が明らかになり、その結果は電気泳動移動度シフトアッセイを用いてさらに検証することが可能です。in vivo chip-chipなどの他の手法に対する本手法の主な利点は、二成分制御系の活性化シグナルや条件が不明な場合でも使用できる点にあります。大多数の応答レギュレーターの標的遺伝子が不明であるため、本手法は細菌のシグナル伝達分野において非常に重要であり、複雑な調節ネットワークの解明に寄与します。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアシスタントであるAmy Chenが行います。本手順を開始する前に、クローン化されたDVU 3 0 2 3遺伝子ミックスから発現させたrr、具体的にはDVU 3 0 2 3タンパク質を精製します。0.5 picomolesのDVU 3 0 2 3タンパク質と、あらかじめ調製した100 fent molesのat inated DNA基質を、緩衝液を用いて合計20 microlitersの容量になるように混合します。タンパク質を含まない反応液をコントロールとして設定した後、これらの反応液を室温のベンチ上で20分間インキュベートします。インキュベーション後、結合反応液に5×ローディングバッファーを5 µL加えます。あらかじめ調製したmini 6% poly acrylamide 0.5 XTBE ゲルに、各反応液を18 µLずつロードし、100 Vで2時間電気泳動を行います。泳動後、チャージ済みナイロンメンブレンをゲルのサイズに切り、0.5 XTBEに10分以上浸します。その後、カセットからゲルを取り出します。ゲルの端にある不要な突起部分を切り取り、0.5 XTBEに浸した2枚の

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。...

ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

このビデオでは、RNA結合タンパク質(RBP)とRNAの相互作用を研究するための細菌のin...

標的遺伝子の翻訳制御を研究するためのレポーター遺伝子抑制アッセイ

この動画では、抗体マイクロアレイチップを用いて環境試料中のシアノバクテリア株を検出する方法を実演しています。さまざまな細菌を運ぶサンプルは、印刷された抗体と相互作用し、蛍光色素標識抗シアノバクテリア株抗体による免疫染色は、異なるスポットでの蛍光を通じて特定のシアノバクテリア株の存在を明らかにします。...

抗体マイクロアレイチップを用いたシアノバクテリア株検出技術

我々は、迅速な抗生物質感受性試験のためのマイクロ流体プラットフォームを開発した。液体はマイクロ流体チャネルの底に固定化された細菌の上に高速で渡される。ストレスと抗生物質の存在下では、細菌の影響を受けやすい株は急速に死ぬ。しかし、耐性菌は、これらのストレスの多い条件を生き残ることができます。...

チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

我々は、高スループットシーケンシング（DamID-SEQ）に、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（DamID）を結合することにより、本明細書のアッセイを説明します。この改良された方法は、より高い解像度、より広いダイナミックレンジを提供し、可能にする等のChIP-seqの、RNA-配列などの他のハイスループットシークエンシングデータと併せてDamID、配列データを分析します...

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF...

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ)...

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。...

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

クロマチン免疫沈降と次世代シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子とそれらが制御するゲノム配列との間の相互作用を確立するために使用される方法です。このプロトコルは、例としてサルモネラ腸管セロバーチピムリウム細菌バイオフィルムを使用して、細菌バイオフィルムでChIP-seqを行うための技術を概説する。...

クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を用いたサルモネラバイオフィルムにおけるCsgD調節標的の発見

リガンドアッセイの微小径径毛管作用(DRaCALA)は、ORFeomeライブラリを使用して生物の小さなリガンド結合タンパク質を同定するために使用できます。...

リガンドアッセイの微小径毛管作用による小リガンドの結合タンパク質の同定(DRaCALA)

DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。...

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

学ぶ細菌の2成分規制システムにおける応答調節因子のゲノム結合部位を特定するDAP-Chip法。タグ付きタンパク質の精製とin vitroリン酸化により、遺伝子標的を効率的に同定できます。

細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法

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細菌のための2つの成分規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法