細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法

本実験の全体的な目的は、in vitro マイクロアレイベースのアッセイを用いて、細菌の二成分制御系レスポンスレギュレーターのゲノム結合部位を決定することである。これは、タグ付きレスポンスレギュレータータンパク質をクローニングおよび精製し、in vitro リン酸化によって活性化させ、さらに電気泳動移動度シフトアッセイを用いて1つの標的遺伝子を決定し、それを後続のマイクロアレイ工程のポジティブコントロールとして利用することで達成される。第2段階として、精製したレスポンスレギュレータータンパク質をゲノムDNAと混合し、アフィニティー精製を用いて、タンパク質結合DNAを入力DNAから分離させる。

次に、タンパク質結合DNAおよびインプットDNAを増幅し、タンパク質結合画分におけるポジティブコントロール遺伝子ターゲットの濃縮をQPCRで確認した後、蛍光標識を施してプールし、タイリングマイクロアレイにハイブリダイズさせます。レスポンスレギュレーターのゲノム結合部位を決定することで、解析対象のレスポンスレギュレーターによって制御されている可能性が最も高い遺伝子が明らかになり、その結果は電気泳動移動度シフトアッセイを用いてさらに検証することが可能です。in vivo chip-chipなどの他の手法に対する本手法の主な利点は、二成分制御系の活性化シグナルや条件が不明な場合でも使用できる点にあります。

大多数の応答レギュレーターの標的遺伝子が不明であるため、本手法は細菌のシグナル伝達分野において非常に重要であり、複雑な調節ネットワークの解明に寄与します。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアシスタントであるAmy Chenが行います。本手順を開始する前に、

クローン化されたDVU 3 0 2 3遺伝子ミックスから発現させたrr、具体的にはDVU 3 0 2 3タンパク質を精製します。0.5 picomolesのDVU 3 0 2 3タンパク質と、あらかじめ調製した100 fent molesのat inated DNA基質を、緩衝液を用いて合計20 microlitersの容量になるように混合します。タンパク質を含まない反応液をコントロールとして設定した後、これらの反応液を室温のベンチ上で20分間インキュベートします。

インキュベーション後、結合反応液に5×ローディングバッファーを5 µL加えます。あらかじめ調製したmini 6% poly acrylamide 0.5 XTBE ゲルに、各反応液を18 µLずつロードし、100 Vで2時間電気泳動を行います。泳動後、チャージ済みナイロンメンブレンをゲルのサイズに切り、0.5 XTBEに10分以上浸します。その後、カセットからゲルを取り出します。

ゲルの端にある不要な突起部分を切り取り、0.5 XTBEに浸した2枚の厚いフィルターペーパーでゲルとメンブレンを挟みます。ゲルとメンブレンをセミドライブロッティング装置に入れ、20 Vで30分間電気泳動を行います。その後、化学発光検出キットを用いてブロットを現像し、CCDカメラを接続したコンピューターで画像を撮影した後、メンブレンを市販のUVクロスリンカー装置に入れ、時間を3分に設定して照射します。

rrの存在下でDNA基質の移動度にシフトが見られるか確認します。これは、RRがテスト対象のDNAに結合していることを示します。次に、緩衝液中で2〜3 µgの共有ゲノムDNAと0.5 pmolのDVU 3 0 2 3を混合します。反応液を25 °Cで30分間インキュベートした後、そのうち10 µLを1.5 mLチューブに移し、「input DNA」としてラベルを貼ります。

0.6 mLマイクロ遠心チューブに、30 µLのニッケルNTAアガロース樹脂を加えます。100 ×gで1分間遠心分離し、チューブの底に樹脂を集めます。その後、上清を除去します。

洗浄バッファーを100 µL加え、チューブを軽く叩いて内容物を混ぜ合わせます。遠心分離後、100 ×gで2分間遠心し、上清を除去します。結合反応液の残りの90 µLを、ニッケルNTAレジンに加えます。

その後、サンプルをロータリーシェーカーで30分間インキュベートします。終了後、サンプルを100 Gsで2分間遠心分離します。上澄みを除去した後、洗浄工程をさらに3回繰り返します。

次に、樹脂に35 µLの溶出バッファーを加え、ボルテックスで混合します。サンプルを室温のベンチ上で5分間インキュベートします。サンプルを遠心分離した後、上清を新しい1.5 mLチューブに移し、「タンパク質結合DNA分画」としてラベルを貼ります。

次に、インプットDNAおよびタンパク質結合DNA画分の精製後、インプットDNAに35 µLの溶出バッファーを加えます。それぞれ10 µLずつ別々のPCRチューブに分注します。その後、各サンプルに10x断片化バッファーを1 µL、ライブラリ調製バッファーを2 µL、およびライブラリ安定化溶液を1 µL加え、ボルテックスで十分に混合します。

サーマルサイクラーを用いて、サンプルを95 °Cで2分間加熱します。終了後、サンプルを氷上で冷却します。次に、ライブラリ調製用酵素を1 µLサンプルに加え、ピペッティングして混合します。

サンプルをサーマルサイクラーでインキュベートします。インキュベーション後、各チューブに47.5 µLの水、7.5 µLの10 x amplification master mix、および5 µLのポリメラーゼを加えます。サンプルを混合した後、サーマルサイクラーで加熱します。

あらかじめ設計した各プライマーセットに対して1xマスターミックスを調製し、各DNAテンプレートについてqPCR反応を3連でセットアップします。まず、96ウェルPCRプレートの各ウェルにマスターミックスを18 µLずつ分注します。増幅および精製済みのインプットDNAサンプルおよびタンパク質結合DNAサンプルを水で5 ng/µLに希釈し、各サンプルの2 µLをウェルに加えます。その後、UltraClear qPCRシーリングフィルムでプレートを密封します。

プレートを遠心分離機で200 GSで1分間遠心分離します。リアルタイムQPCR装置にプレートをセットし、入力DNAをs si threeで、濃縮DNAをsci fiveで標識するための以下の条件を用いてサイクルを開始します。1 µgのDNAを40 µLのS3 SCI-FI標識9-merと混合し、水で80 µLに調整します。サーマルサイクラーを用い、遮光条件下で98 °Cで10分間サンプルを熱変性させます。

完了後、サンプルを氷上で2分間急速冷却し、各反応系に3'→5' exoポリメラーゼ 2 µL、デオキシヌクレオチド三リン酸 5 mM、および水 8 µLを加えます。混合後、サーマルサイクラーを用いて37 °Cの暗所で2時間インキュベートします。この時点で、反応を停止させるためにEDTAを50 mMまで加え、さらに塩化ナトリウム溶液を0.5 Mまで加えます。

その後、0.9容量のイソプロパノールを含む1.5 mLチューブに移し、暗所で10分間インキュベートする。サンプルを12,000 ×gで10分間遠心分離する。S3およびsci-fiでラベル付けされたDNAをそれぞれ6 µgずつ1.5 mLチューブにまとめ、遠心分離機内で低熱にて真空乾燥させる。この際、遠心分離機の蓋が透明な場合は、蓋を覆って遮光すること。

ペレットが乾燥したら、5 µLの水で懸濁します。次に、15秒間ボルテックスした後に、あらかじめ調製した1xハイブリダイゼーション溶液マスターミックスを13 µLサンプルに添加し、ドライバスを用いて95 °Cで5分間インキュベートします。サンプルをドライバスから取り出し、ローディングの準備が整うまで42 °Cのハイブリダイゼーションシステム内に保持します。

次に、あらかじめ準備したミキサー・スライド・アセンブリをハイブリダイゼーション・システム内にセットします。フィルポートにサンプルを16 µL注入します。その後、ポートを粘着フィルムで密封し、システムのミキシング機能をオンにします。42 °Cで16～20時間ハイブリダイゼーションを行います。

ミキサーのスライドを分解ツールにスライドさせて挿入し、温めたバッファーを含むディッシュの中に入れます。分解ツールを激しく振って、ミキサーを剥がします。スライドを50 millilitersの洗浄バッファー1が入った容器に入れ、2分間激しく振ります。

次に、50 millilitersの洗浄バッファー2および50 millilitersの洗浄バッファー3を用いて前ステップを繰り返します。DVU 3 0 2 5 QPCRの上流領域により、DVU 3 0 2 5の上流領域がインプットDNAと比較してタンパク質結合画分に濃縮されていることが示され、これにより結合条件がDVU 3 0 2 3に対して適切であったことが示されました。DVU 0 0 1 3を陰性対照として使用しました。DAP chipp解析後に得られた上位4つのピークが、DV 3 0 2 3の最も可能性の高いターゲットとして選択されました。

ポジティブターゲットである DVU 3 0 2 5 は、最高スコアで得られた最初のピークでした。2つの遺伝子ターゲットは、他に ly エンコードされた乳酸パーミアーゼです。4番目の遺伝子ターゲットは上流領域ではなく、収束的に転写される2つの遺伝子の間の遺伝子間領域に位置しています。DAP chip meme によって得られたターゲットの上流領域を用いて、結合部位モチーフの予測が行われました。

このモチーフの保存塩基に置換を導入したところ、結合シフトが消失したことから、モチーフの妥当性がさらに検証されました。検証済みのモチーフを用いて他の硫酸還元菌のゲノムをスキャンし、自律的rsに対して予測されたモチーフ配列を用いて、オープンリーディングフレームの上流領域にモチーフが存在するDVU 3 0 2 3オーソログ遺伝子座を、潜在的な標的遺伝子として選定しました。その結果、Divo Garris Hilton Burrowのものと酷似したコンセンサス結合部位モチーフが生成されました。

このビデオを視聴することで、調節タンパク質の遺伝子標的を決定するためのDaptive法の使用方法について十分に理解できるはずです。この手法は、タンパク質の精製が可能であり、かつゲノム配列が既知であれば、あらゆる調節タンパク質の結合サイズを解析するために採用できます。