Name: 分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶマウス胚性膵前駆細胞を用いた3次元培養による膵臓器官形成の手法。Matrigelスカフォールドで細胞を拡張・分化させ、分枝構造を持つ自己組織化器官を作製する技術を解説。

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この作品は、デットFrieForskningsråd/ Sundhed OG SygdomからNCCRフロンティア遺伝学におけるパイロット賞、若年性糖尿病研究財団助成41-2009-775とグラント12から126875で順次資金を供給された。著者らは、動画撮影をホストするためのスパニョーリラボに感謝。

このプロトコルは、マウスE10.5から派生した膵臓オルガノイドが上皮膵臓細胞を解離した成長を目指しています。 プロトコルは、動物実験のための倫理的な承認を必要とする。 E10.5マウス胚から背膵芽の1。解剖<ol><li>ハサミで腹部を開き、胎生（E）10.5で時限妊娠マウスを犠牲に、2子宮角を削除し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、またはダルベッコで満たされた10センチメートルペトリ皿に置いて修正必須培地（DMEM）は氷上に保持。細胞播種の犠牲からの全実験は、細胞の損傷を防ぐために60〜90分間で行われる。 </li><li>小さなハサミを使用して個々の胚のセグメントに子宮を分離する。冷PBSで35ミリメートルペトリ皿に1胚を移し、上からの照明で解剖顕微鏡下でそれを視覚化する。解剖ピンセットで周囲の筋肉、脱落膜と卵黄のSAを削除Cおよび胚を公開します。背中冷たいDMEM培地に胚を置きます。胚は容易に3ミリリットルのプラスチックトランスファーピペット/スポイトを使用して転送することができる。続行する前に、同様の方法で、すべての個々の胚を分離します。 </li><li> PBS中できれいな35ミリメートルペトリ皿に胚を置きます。 <ol><li>前肢を削除するために、薄い鉗子（0.05ミリメートル幅）を使用してください。優しく脊髄領域（ 図1）からの消化管を分離するために開口部に鉗子を挿入します。オプション：より便利に、胃を参照してください下に卵黄茎下の心臓や尾部に、胚の上半身を削除するには。 </li><li>胃、肝臓と腸の位置を確認します。鉗子を使用すると、胃から小腸への消化管に分離した（ 図1）氷の上に冷たいDMEM中に入れてください。背側膵臓芽は、胃への後方（ 図1）、背側に取り付けられている。 </li><li>シミのすべての個々の消化管を隔離続行する前にLAR方法。胚が遺伝子型を決定する必要がある場合には、解剖時に尾を収集し、氷上で冷たいDMEMで24ウェルプレート中の異なるウェル内のすべての個々の消化管を保つ。 </li></ol></li><li>冷PBS中できれいな35ミリメートルペトリ皿に1消化管を配置します。今解剖顕微鏡下で背側膵臓芽を視覚化して分析する明視野で下から照明を使用しています。これらの条件はボリュームの可視化を最適化します。電解的にシャープタングステン針または20gの注射針を使用して、上皮の周り可能な限り少ない間充織（ 図1）と膵臓芽を分離します。 <ol><li> 2〜3分間冷たいディスパーゼ溶液（1.25ミリグラム/ ml）を含むペトリ皿に孤立した芽を転送します。この時点から、移動が最も便利に口の制御、フレキシブルチューブに付着した難引っ張っ50μlのガラスキャピラリーで行うことができます。代わりに、より多くのRIと芽を失うSK、適切なプラスチックのヒントを10μlの自動ピペット（ピペットマン）を使用します。 </li><li>微視的な制御の下で膵臓芽の吸引と排出を行う。バックPBS中の膵臓芽を置く。さらにガラスキャピラリー（ 図1）を使用して、針と穏やかな吸引との間葉から分離された膵臓の芽を清掃してください。 </li><li>全体間充織が除去されると、冷PBS中で膵臓芽をすすぐ。個々のウェル（冷DMEM中の10μLで満たされた60ウェルミニトレー）冷DMEM中に各芽を移す。それは組織が非常に粘着性になり、これディスパーゼで間充織を削除しないことが重要です。 </li></ol></li></ol>分散した細胞の2。メッキと文化<ol><li>洗浄に10μlのPBSで満たし60ウェルミニトレーの円錐形のウェルに難引っ張らガラスキャピラリーを持つすべての胚から解剖上皮を転送します。 <ol><li>トリプシン0.05％Aを10μlに芽を移すNDそれは4分間、37℃でインキュベートしてみましょう。 10μlのDMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）でウェルに芽を転送することによりトリプシンを不活性化する。 </li><li>ピペットプラーで引っ張ら細い毛細血管を通して吸引により細胞懸濁液を解離する。これは、細胞を解離するには、上下にピペッティングしながら、この段階で泡を避けることが重要である。膵臓オルガノイド最適に5月15日細胞の小グループから始めるため、部分的な解離（ 図1）をお勧めします。 </li></ol></li><li>個々の処理による違いを最小限にするために、エッペンドルフチュー​​ブに、いくつかの胚からの細胞をプールする。 1:3の比で冷却したマトリゲル中の細胞懸濁液を希釈する。分量この混合物を96ウェルプレートに、8μL/ウェルまたは画像化のために最適化されたプレート（下記参照）。 </li><li>マトリゲル増粘させること、5分間37℃でプレートをインキュベートする。 タブを参照して、選択（オルガノイドや球の培地を70μlの井戸を埋めるレ1および2）、37℃、5％CO 2及び95％空気を含む加湿環境ではあり</li><li>すべての4 日目の媒体を交換してください。毎日成長している膵臓コロニーを監視し、画像化してプロセスを文書化します。 </li><li> 28先に報告されたように関心対象の小分子またはタンパク質は、干渉実験のために、この段階で培地に添加することができる。 </li></ol> 表1：オルガノイドミディアム。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>素材の名前</td><td>ストック濃度</td><td>最終的な培地中の濃度</td><td>株式のボリューム</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100パーセント</td><td> 1％ </td><td> 50μL </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替（サプリメント） </td><td> 100パーセント</td><td> 10パーセント</td><td> 500μL </td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td> 14.3 M </TD&gt; <td> 0.1 mMの</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>ホルボールミリステートアセテート（PMA） </td><td> 16μM </td><td> 16 nMの</td><td> 5μL </td></tr><tr><td> Y-27632（ROCK阻害剤） </td><td> 50 mMの</td><td> 10μMの</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50μg/ mlの</td><td> 25 ng / mlの</td><td> 2.5μL </td></tr><tr><td>組換えヒトR-スポンジン1 </td><td> 250μg/ mlの</td><td> 500 ng / mlの</td><td> 10μL </td></tr><tr><td> - または - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組み換えマウスR-スポンジン1 </td><td> 250μg/ mlの</td><td> 500 ng / mlの</td><td> 10μL </td></tr><tr><td>組換えヒトFGF1（aFGFを） </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 25μg/ mlの</td><td> 1.25μL </td></tr><tr><td>ヘパリン（Liquemin） </td><td> 2500 U / mlの</td><td> 2.5 U / mlの</td><td> 2μL </td></tr><tr><td>推奨遺伝子組換え型のヒトFGF10 </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 100 ng / mlの</td><td> 5μL </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25μL </td></tr><tr><td>合計</td><td></td><td></td><td> 5000μL </td></tr></tbody></table> 表2：スフィア媒体。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>素材の名前</td><td>ストック濃度</td><td>最終的な培地中の濃度</td><td>株式のボリューム</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100パーセント</td><td> 1％ </td><td> 50μL </td></tr><tr><td> B27のX50（サプリメント） </td><td> 100パーセント</td><td> 10パーセント</td><td> 100μL </td></tr><tr><td>組換えヒトFGF2（bFGFを） </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 64 ng / mlの</td><td> 3.2μL </td></tr><tr><td> Y-27632（ROCK阻害剤） </td><td> 50 mMの</td><td> 10μMの</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845.8μL </td></tr><tr><td>合計</td><td></td><td></td><td> 5000μL </td></tr></tbody></table>オルガノイド開発の進行の3。イメージング<ol><li>画像オルガノイドどちら毎日または時間経過顕微鏡による蛍光タイムラプス顕微鏡を使用。タイムラプスイメージングのため、XY（Z）自動化された倒立蛍光顕微鏡を使用しています。 </li><li> 4ウェルプレートまたは2〜5ミリリットル培地を充填したガラス底プレート中3μLの預金小滴。 10倍の長距離目的としたイメージ。注：蛍光トレーサーを発現するトランスジェニックマウスを使用することができる。例えば、映画1は、PDX1のNgn3-ER TM-IRES-nGFP +マウス4からオルガノイドの初期膨張。核GFPは、個々のオブジェクトが、同様の原理は、膜の蛍光を有する細胞を追跡するために適用することができるように、細胞を追跡することを可能にするMT / Mg系マウス29など。 </li><li>フォーカスドリフトを回避し、手動で定義されている位置で、3日以上1画像/時を取るために自動化を制御するソフトウェアを設定するために細胞を播種した後タイムラプスイメージングの3時間後に開始します。全ての位置については、蛍光マーカーの発現を報告し、微分干渉コントラスト（DIC）画像ならびにGFP信号を取得する。 </li></ol>組織学のためオルガノイドの4。回収<ol><li>氷上で96ウェルプレートを置き、氷冷PBSで置き換え、培地を除去。これは部分的にマトリゲルを解重合する。 </li><li>優しくアーキテクチャ全体を混乱させないために千μLチップを使用して、周囲のマトリゲルを除去し、個々のオルガノイドを吸引する。氷冷PBSでウェルに各オルガノイドを転送します。氷の上にプレートを保管してください。マトリゲル内直接固定することも可能である。 </li><li> 、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で15分間オルガノイドを修正しました。ショ糖でそれを冷凍保存し、ゼラチンに埋め込む。それぞれを処理前述したように凍結切片および組織学のための組織体（ヨハンソンら 、2007）4。 </li></ol> PCRおよび生化学用オルガノイドの5。回復<ol><li>氷上で96ウェルプレートを配置し、培地を除去。細胞のRNAを安定化し、保護するために、ウェル当たりのRNAlater 60を添加する。 </li><li>部分的に氷の上で解重合することにより、各ウェル内でゲルを機械的に破壊する。全体的なアーキテクチャを混乱させるか、200μlの先端を機械的にゲルを破壊することによって（マトリゲルで）全体をよく回復しないために、千μLチップを使用して個々のオルガノイドを回復のどちらか。 RNA分解酵素フリー非粘着性エッペンドルフチュー​​ブに入ってもコンテンツを転送するために千μlのチップを使用して、氷上に保持。 </li><li> 60μLのRNAlaterでウェルを洗浄し、同じエッペンドルフチュー​​ブに残りのコンテンツを追加します。 </li><li> 4℃で500〜1,000×gで5分間チューブをスピン</li><li> 20〜30μLを残して上清を取り除き一緒にペレットとチューブ内のRNAlater。生化学のために、可能な限りドライサンプルを格納。 </li><li>すぐにRNAlater中でサンプルを凍結しないでください。 4℃のCO / Nにおけるストア（RNAlaterで徹底的に組織を貫通できるようにする）。組織は、長期保存のために-20℃で保存することができ、後に組織破壊及びRNAの少量の抽出のために処理することができる。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

インビトロにおける機能的β細胞の大規模生産は依然として1無効である。このような厳しい状況では、発生生物学の研究で​​は、機能的なβ細胞の分化に必要とされる正確な信号を解読するに役立つことがあります。このプロトコルは、in vitroでの胚性膵臓前駆細胞の維持、拡大と差別化が可能になります。これは、他の内分泌ホルモンを共発現しないインスリン産生β細胞の形成を含む、Pdx1の高レベルのインスリン成熟し、処理インスリン28を有するプロコンバターゼを発現している。システム内の重要な鍵となる要因は、Y-27632によって経路だけでなく、ROCK阻害FGFシグナルの活性（外因的ヘパリンによって増強追加FGFによって刺激）とNotch（内因性）である：いいえ、それらの因子の非存在下で、または非常にオルガノイドと球の限られた数が28を生成した。 FGFおよびNotための要件CHの活動を簡単に、生体内28での膵臓の開発のための重要性に基づいて理解されている。 ROCK阻害剤は、従って、解離時にマイクロフィラメント...

器官培養は複雑であるが、生体内の調査で非常に関連性の高い細胞株モデルの便利なが、おおよそのシミュレーション間のギャップを橋渡しする有用なモデルを提供しています。内分泌および外分泌細胞を模擬した形質転換された細胞株が存在するが、膵臓例では、膵臓の前駆細胞と完全に同等のない細胞株ではありません。大人の膵臓全体を培養することができません。単離された内分泌膵島は数時間5 インビトロで維持することができる細胞増殖および組織切片なしで、数週間維持することができる。胚性膵臓培養物は、広くその発達を研究するためだけに使用されているだけでなく、上皮間葉相互作用4,6,7を調査するために、画像に8を処理または化学的にそれらと9を妨害する。二つの器官培養法が主に使用されます。最初は都合のですフィブロネクチンコーティングしたプレート2、上の膵臓芽を培養することにある画像化目的のためにnient;二つ目のオプションは文化に最も形態形成を保持する気液界面3,4でフィルタの臓器です。非常に有用であるが、これらの方法は、ある程度の平坦化をもたらす;前駆細胞の拡大は非常に正常な発達および出発集団は、膵臓細胞および間葉細胞の全ての種類を含む複合体であると比べて制限される。 文化への能力と分散初代細胞を拡大し、系統関係を研究し、単離された細胞のタイプ10の固有の特性を明らかに価値がある。杉山ら 11膵臓前駆細胞およびフィーダー層上の文化の中で3〜5日間いくつかの機能の文字を保持する内分泌前駆細胞を維持することができます。ニューロスフェア12と13のマンモスフィアに似Pancreatospheresは、成人の島および前駆細胞/幹細胞の性質であるが管細胞から展開されてきたこれらの球体を生成することをすることは明らかではない。また、生理的発達とは対照的に、pancreatospheresは、いくつかのニューロンの14,15を含んでいた。球はまた、最近、胚性膵臓前駆細胞16,17と良好な前駆細胞の拡大とそれに続く分化と膵臓18回生から生じたが、形態形成を再現できなかったし。 小型化された臓器に自己組織化分散させ、多くの場合、定義された細胞からの3Dモデルは、最近、繁栄し、そのような腸19,20、胃21、肝臓22、前立腺23、気管などの複数の器官の発達、大人の離職率をシミュレートしている24。光学カップ25、小腸26または脳27の場合のように、いくつかの例では、形態形成の発達および分化は、ES細胞から3Dにで要約されている。 ここでは、DES彼らは差別化と自己組織化することができる3Dマトリゲル足場に解離した多能性膵臓前駆細胞を拡大する方法をcribe。

<table><tbody><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>在庫は-20°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>ノックアウト セラム リプレイス (サプリメント)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>ストックは -20 °C に保たれています。C</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>ストックは4°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>ホルボールミリスチン酸酢酸 (PMA)</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>ストックは-20°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK阻害剤)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>在庫は-20°Cに保たれています。安定性/ソースは、頻繁に問題の原因となります。</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>ストックは-80°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>組換えヒト R-spondin 1</td><td>R&D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>在庫は-80°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>組換えマウス R-spondin 1</td><td>R&D</td><td>3474-RS-050</td><td>在庫は-80°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>組換えヒトFGF1(aFGF)</td><td>R&D</td><td>232-FA-025</td><td>在庫は-80°Cに保たれています。C - ベータ細胞産生を増加させるために、</td></tr><tr><td>ヘパリン(リクミン)</td><td>Drossapharm</td><td></td>ストックを<td>4°Cに保たせません。C</td></tr><tr><td>組換えヒト FGF10</td><td>R&D</td><td>345-FG-025</td><td>在庫は-80°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>在庫は-20°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>B27 x50 (supplement)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>ストックは-20°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>組換えヒトFGF2(bFGF)</td><td>R&D</td><td>233-FB-025</td><td>ストックは-80°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td>ストックは-20°Cに保たれています。C</td></tr><tr><td>トリプシン 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>在庫は 4 度に保たれています。C</td></tr><tr><td>RNAlater - RNA安定化試薬</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D4818-2MG</td><td>使用濃度: 1.25 mg/ml. ストックは -20 °C に保たれています。</td></tr><tr><td>C BSA 再構成用</td><td>Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td><td>サイトカインの再構成用&nbsp; - ストックは -20 °C に保たれています。C</td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Stock kept at -20 >C</td></tr><tr><td>60ウェルマイクロウェルトレイ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>95ウェルプレート Fボトム</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Glas ボトムプレート</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルガラスマイクロピペット</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td>Cell&#174; 浜松市オルカER製B7WカメラとLudin Cube、Boxを搭載したイメージングステーション(電動倒立型オリンパスIX81スタンド) 
Leica DMI6000 Bスタンドは、Leica DFC365 FXカメラとAF6000 Expert/Matrixソフトウェアコマンドインターフェースを備えたLudin CubeとBoxに囲まれています。</td></tr><tr><td>目的、</td>オリンパス、<td></td><td></td><td>UPLAN FL、NA 0.30、空気、9.50 mm、10X、長距離; 
ライカ HC PL FLUOTAR NA 0.30 空気 11.0 mm 10X 長距離</td></tr></tbody></table>

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

膵臓は、グルコースの恒常性を調節し、消化酵素を分泌する必須の器官です。膵臓の胚形成に関する研究は、幹細胞1から膵臓細胞を作製するプロトコールの開発につながっています。胚器官全体は、発生の複数の段階で培養することができます2-4。これらの培養法は、薬剤の試験や発生過程の画像化に役立っています。しかし、臓器の拡張は非常に限られており、臓器が平らになるため、形態形成は忠実に再現されていません。
私たちは、解離したマウス胚性膵臓前駆細胞の効率的な拡大を可能にする3次元(3D)培養条件を提案します。培地の組成を操作することにより、主に初期状態で拡大する膵臓前駆細胞で構成される中空球、またはより成熟した拡大前駆細胞に進行し、内分泌細胞、腺房細胞、および管細胞に分化し、胚性膵臓に似せて自発的に自己組織化する複雑なオルガノイドを生成することが可能です。
ここでは、インビトロプロセスが自然な膵臓の発達の多くの側面を再現していることを示しています。この培養システムは、細胞が協力して臓器を形成する方法を調べるのに適しています。これにより、初期の複雑さを数個の前駆細胞に減らすことができます。これは、膵臓の3D構造を再現するモデルであり、したがって、上皮構造の分極や分岐などの形態形成の研究に役立ちます。また、剛性や細胞のテンセグリティへの影響など、ニッチの機械的な手がかりに対する応答を評価することも適切です。

3Dマトリゲルで解離し、播種E10.5の背側膵臓前駆細胞は、膵臓の発達を再現。前駆細胞は、最も容易に蛍光リポーターで追跡することができる。我々のケースでは（ 図2）NEUROG3 4を活性化することなく、タモキシフェンの非存在下では、したがって、Pdx1のプロモーター（、PDX1のNgn3-ER TM-nGFP）（動画1）によって制御された核GFPタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを使用していました。 オルガノイド培地で、細胞の小さなクラスターの初期圧縮は、最初の数時間で起こる。拡張は、最初の4日間でのクラスターの拡大（ 図2A）によって検出することができる。 5日目から、枝は20％、最大オルガノイドに形成している。単一細胞を拡張し、大規模なクラスタがPdx1の式 28を保持しながらのPdx1発現を失うことはありません。 <p class="jove_co...

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

この手順の全体的な目的は、関連する多能性膵前駆細胞を3D Matrigelスキャフォールド内で増殖させ、分化および自己組織化させることです。これは、まず胚齢10.5日のマウス胚から膵臓を単離することで達成されます。次のステップでは、間葉組織を除去し、上皮を単一細胞および小さな細胞塊に分散させます。最終ステップは、細胞をMatrigelに懸濁し、重合したゲルを培養して拡張させることです。最終的に、これにより、マウス胚膵臓に類似した自己組織化分岐膵臓オルガノイドが形成され、これを顕微鏡でライブまたはエンドポイントで視覚化できます。全膵臓外植えなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、明確に定義された、より単純な細胞集団から開始できる点にあります。膵前駆細胞は、2D細胞培養よりも3D培養の方が良好に維持されます。この手法を用いることで、細胞間相互作用や細胞とマトリックスの相互作用など、この分野におけるいくつかの重要な疑問を解決することが可能になります。これは最終的に、極性がどのように生じ、その結果として細胞の多様性がどのように生じるかを理解することにつながります。この手法をヒトに適応させることで、インスリンを産生するより優れた細胞を供給できる膵臓を拡張できるため、糖尿病治療への応用が期待されます。この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。なぜなら、タイミングが非常に重要な除去ステップの操作が困難であり、また、オルガノイド形成における解離ステップが重要であるためです。まず、あらかじめ採取した胚日10.5のマウス胚を、PBSが入った清潔な35mmペトリ皿に入れます。次に、幅約0.05 mmの細いピンセットを使用して、前肢を取り除きます。ピンセットを開口部にゆっくりと挿入し、脊髄領域から消化管を切り離します。胚の胃、肝臓、および腸を確認します。次に、針を用いて胃から腸に至る胃腸管を単離します。単離した胃腸管を、氷上の冷やしたDMMに入れます。前のステップを繰り返し、個々の胃腸管をすべて単離します。個々の胃腸管を異なるウェルに分けて保持します。氷上の冷えたDMMを入れた24ウェルプレートを使用する場合、ジェノタイプが重要な場合にのみ、それらを分離して保持する必要があります。1本の胃腸管を、冷えたPBSを入れた清潔な33 mmのペトリ皿に移し、解剖顕微鏡を用いて、下からの照明による明視野で観察します。胃腸管にピントを合わせたら、針ではなく電解研磨されたタングステン針または20ゲージの注射針を用いて、背側膵芽を剥離します。上皮周囲の間充織をできるだけ除いた状態で膵芽を単離します。単離した膵芽をペトリ皿に入れ、冷えた1.25 mg/mLのSP solutionで2〜3分間インキュベートします。ここからの芽の移送には、口で操作可能なフレキシブルチューブに取り付けた、火で引き伸ばして作成した50 µLのガラスキャピラリーを使用してください。顕微鏡下で制御しながら、芽を溶液の中に配置します。その後、膵芽をPBSに戻してください。次に、針とガラスキャピラリーによる緩やかな吸引を用いて、単離した膵芽を間充織から洗浄します。間充織をすべて取り除いたら、膵芽を冷PBSでリンスし、各膵芽を個別のウェルに移します。1ウェルあたり10 µLの冷DMMを含む60ウェルプレートを使用してください。摘出した膵芽を洗浄するため、各膵芽を、1ウェルあたり10 µLのPBSを含む60ウェルミニトレイの個別の円錐形ウェルにピペットで分注します。次に、膵芽を10 µLの0.05%トリプシンを含むウェルに移し、37 °Cで4分間インキュベートします。その後、膵芽を10%胎児牛血清を含む10 µLのDMMが入ったウェルに移してトリプシンを不活化させ、ピペットプラーで作成した細いキャピラリーで細胞懸濁液を吸引し、細胞を分散させます。膵臓オルガノイドは5〜15個の細胞からなる小グループから開始するのが最適であるため、部分的な解離が推奨されます。個別の処理に起因する差異を最小限に抑えるため、複数の胚から得られた細胞を1本のエッペンドルフチューブにまとめます。細胞懸濁液を、冷却したmatrigelで1:3の比率に希釈します。希釈した細胞懸濁液を、ピペッティングにより4ウェルプレートまたは96ウェルプレートに分注します。1ウェルあたり8 µLずつ加えます。プレートを37 °Cで5分間インキュベートし、Matrigelを凝固させます。マイクロウェルに培地を満たし、5%CO2および95%空気を含有し、37°Cに加湿された環境にプレートを配置します。4日ごとに培地を交換し、膵臓コロニーの成長を毎日観察します。マウス胚の背側膵前駆細胞を用い、タイムラプス顕微鏡を用いて成長過程を記録します。オルガノイド培地で培養した10.5日目の個体では、7日間の培養期間を通じて細胞クラスターの拡大が見られ、4日後に分枝が始まった。単一細胞は拡大せず、PDX oneの発現を消失したが、大きなクラスターではpdxが保持されていた。一方、スフィア状に育成した膵前駆細胞では、オルガノイドよりも頻繁に培地交換が行われました。さらに、2〜3日目にIlluminaが検出され、さらなる拡大により、時折局所的に多層領域を持つ単層の空洞スフィアとなりました。7日目のオルガノイドの組織学的解析により、HNF1BおよびPDX1の陽性染色によって膵前駆細胞の組成が確認されました。また、外分泌マーカーであるアミラーゼおよび内分泌マーカーであるインスリンの染色により、分化した細胞も同定されました。スフィアは、膵前駆細胞マーカーであるHNF1BおよびPDX1をより均質に発現しており、オルガノイドよりも分化が進んでいないことが示されました。この手順を行う際は、処置後に細胞を完全に分散させないことが重要です。これらのオルガノイドは、小さな臓器と同様に扱うことができます。したがって、通常のQPCRを実施することが可能です。単一細胞qPCRやライブイメージングを行うことができます。また、免疫組織化学染色を組み合わせることで、この小さな器官のような構造内で起こっている細胞ダイナミクスの理解を深めることが可能です。さらに、低分子化合物を用いてインキュベートすることで、目的のさまざまなパスウェイに干渉させることができます。この技術は、現在はマウスにおいて、将来的にはヒトのeESLまたはiPS細胞を用いて、膵臓の発生メカニズムやより適切な細胞形成を解明するための研究への道を切り拓くでしょう。このビデオを視聴することで、3D培養環境において、少数の前駆細胞から正常な膵臓の発達を模倣した小型膵臓を作製する方法を十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

膵臓のような前駆細胞がインスリンを発現するコロニーへの分化を可能にする三次元のクローン原性アッセイが記載されている。単一の前駆細胞が増殖と分化するこの方法は、メチルセルロース、マトリゲルと成長因子を含有する半固体培地を利用しています...

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。...

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し...

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

単離するためのプロトコルは、ヒト胎児膵臓細胞由来培養し、画像膵島細胞クラスター（ICCは）が記載されている。方法は、組織、文化単層として、または凝集体懸濁液中、および増殖のマーカーと膵臓細胞運命決定のための画像からのICCを生成するために必要な手順を詳しく説明します。...

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。...

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids...

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

このプロトコルは、ヒト歯髄幹細胞(hDpSC)を...

インビトロ 膵臓系統に向けたヒト歯髄幹細胞の誘導

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶマウス胚性膵前駆細胞を用いた3次元培養による膵臓器官形成の手法。Matrigelスカフォールドで細胞を拡張・分化させ、分枝構造を持つ自己組織化器官を作製する技術を解説。

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

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