September 6th, 2014
マウス胚性線維芽細胞は、転写因子Oct-4、Sox-2、Klf-4、c-Mycの強制発現により、低効率で人工多能性幹細胞に再プログラムすることができます。リプログラミング反応のまれな中間体は、細胞表面メーカーであるThy-1.2、Ssea-1、およびEpcamに対する抗体による標識により単離されたFACSです。
この手順の全体的な目標は、マウス胚性線維芽細胞の培養物から希少なリプログラミング中間体を単離することです。これは、最初に、再プログラム可能なマウス系統のE 13.5胚からマウス胚性線維芽細胞を導出することによって達成されます。第2のステップでは、低継代マウス胚性線維芽細胞を、誘導多能性幹またはドキシサイクリンを添加したIPS細胞培地に播種して、リプログラミングプロセスを開始します。
次に、リプログラミング中に選択した時点で細胞を回収し、特定の細胞表面マーカーに対する抗体で標識します。最終的には、希少なリプログラミング中間体を事実によって分離し、さらなる実験的分析を行うことができます。既存の方法のこの技術の主な利点は、人口の大部分を構成するリプログラミングプロセスに抵抗性の細胞の不在下で、まれなリプログラミング中間体に対して機械論的研究を行うことができることであるマウス胚、線維芽細胞、またはmesを生成するために、10ミリリットルの滅菌PBSを含む10センチメートルの組織培養皿に胚の13.5子宮角を移すことから始まる。
次に、滅菌された外科用グレードのはさみを使用して、角をそれぞれ1つの胚を含む個々の部分に切ります。次に、組織培養フードの解剖顕微鏡下で、滅菌した鉗子を使用して、各胚を囲む子宮エンベロープと余分な胚膜を慎重に取り除き、露出した各胚を10ミリリットルの新鮮なPBSを含む個々の10センチメートルの皿に移します。次に、各胚の頭、手足、尾、および内臓を鉗子で切除します。
必要に応じて、ジェノタイピングのために個々の1.5ミリリットルチューブでヘッドを凍結します。各胴体を新しい個別の10センチメートルプレートに移し、2つの外科用ブレードを使用して各胚を2分間ミンチします。室温で3〜5分間、トリプシンEDTAの200マイクロリットルで組織片を消化し、その後さらに2分間ミンチします。
次に、2ミリリットルの覚せい剤培地でトライインを不活性化し、1000マイクロリットルのピペットを使用して細胞スラリーを15ミリリットルのチューブに移します。さらに、穏やかなピペッティングで組織を機械的に解離し、細胞溶液をゼラチンでコーティングした10cmの皿に移します。さらに10ミリリットルの覚せい剤培地を培養物に加えます。
24〜48時間後、プレートをMEFで密に覆い、MEFを再プログラムし、最初に低通路凍結メス培養物を摂氏37度の水浴で解凍し、次に内容物を10ミリリットルの予温メス培地を含むチューブに移します。細胞をスピンダウンした後、ペレットを12ミリリットルの新鮮なメス培地に再懸濁し、細胞懸濁液をゼラチンでコーティングしたT75培養容器に移します。24〜48時間の回復期間の後、MEFをPBSで洗浄し、次に3ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を3〜5分間摂氏37度で切り離します。
次に、5ミリリットルのメス培地で酵素消化を停止し、10ミリリットルのピペットで穏やかに混合して細胞をさらに解離させます。次に、新しいゼラチンに細胞を播種することにより、メッツを再プログラムし、最初の6日間、ドキシサイクリンの1ミリリットルあたり2マイクログラムを含むIPSC培地の12ミリリットルで、1平方センチメートルあたり6.7倍の10〜3番目の細胞でT 75フラスコをコーティングした。メディアを 1 日おきに新鮮なドキシサイクリン添加 IPSE メディアに交換し、収穫された中間懸濁液ごとに示したように、トリプシン EDTA 剥離により必要な時点でリプログラミング中間体を収穫します。
PBSで細胞を洗浄します。その後、復活します。抗体標識のためにファクスメディアにペレットを懸濁して、完全に再プログラムされたIPSC培養を確立します。
ドキシサイクリンを含まないIPSC培地でさらに4〜7日間細胞を増殖させ、再プログラムされた細胞を標識します。回収した中間体を目的の適切な抗体で標識します。10分後、チューブを軽くたたいて細胞を再懸濁し、さらに10分間チューブを氷の上に置きます。
2回目のインキュベーション後、チューブあたり10ミリリットルの冷たいPBSで細胞を洗浄します。次に、上清を慎重に吸引し、ストリピンPサイズ7を添加した適切な量の標識媒体にペレットを氷上に再懸濁します。20分後、さらに10個の冷たいPBSで細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウムを添加した標識培地に細胞ペレットを再懸濁します。
懸濁液を70マイクロメートルのストレーナに通して細胞の塊をろ過し、細胞を氷上の適切な対応するファックスチューブに移します。補正コントロール用。Resusは、照射されたmes上に維持されたIPS細胞のクライオバイアルを800マイクロリットルの標識緩衝液に懸濁します。
ラベルなし制御制御用に200マイクロリットルのセルを確保します。次に、残りの細胞懸濁液を3本の15ミリリットルチューブに分割して単色コントロールにし、サンプルを標識して、フローサイトメトリーで中間体を分析します。まず、前方に並べた散布図にゲートを設定して、破片を除外します。
次に、前方散乱高さと前方散乱領域を使用して、集合体を除外し、PI チャネルと前方散乱を除外します。PI陰性生細胞をゲートします。ラベルのないセルを使用して、Pacific blue FITC と PSI の 7 つのチャネルの電圧を調整します。
理想的には、細胞集団をそれぞれのチャネルの下端に配置します。次に、標識されていないコントロール細胞でゲートをセットし、リプログラミング培養物を3日目、6日目、および9日目にサブフラクションします。SSEAの集団は、1つの陰性TH 1.2陽性細胞、SSEA1つの陰性TH 1.2陰性細胞、およびリプログラミング中間体であるSSEAの1つの陽性TH 1.2陰性細胞。
次に、9日目のSSEAの1つの正のTH1.2の負の分率を、SSEAの1対EPAMプロットでさらに細分化します。ラベルなしコントロールを使用して、次に示すように、EPAM陽性セルとEPAM陰性セルの周囲にゲートを描画します。最後に、細胞を1〜2ミリリットルのIPS細胞培地に集めます。
ドキシサイクリン導入時に、リプログラミング神話は6日目頃に明確な形態学的変化を受けます。初期のコロニーのようなパッチが出現し始め、さらなる培養によりサイズが拡大し続けます。優れたリプログラミング実験は、最初に5倍10から5番目の細胞を播種したT 75あたり500を超えるコロニーをもたらし、確立されたIPS培養物は特徴的なドーム状のコロニーを持ち、ほとんどが分化した細胞を欠いています。
リプログラミング中の形態学的および分子的変化は、大腿部1.2 SSEA one、そして最終的にはepcaの細胞表面発現の変化に反映されます。MESは大腿部1.2に対して主に陽性で、他のマーカーに対して陰性ですが、3日目までに、大腿部1.2の発現をダウンレギュレーションする細胞の大部分が始まり、非常に小さなサブセットがSSEAの1陽性になりました。6日目と9日目のこの時点の実際のリプログラミング中間体は、通常10%をはるかに超えるSSEA 1陽性細胞の増加した割合を12日目頃までに検出できる。
SSEAのサブセット1陽性細胞も陽性である細胞を検出できます。エプカの場合。確立された真正なIPS細胞培養は、強く陽性となります。
SSEA oneとEPCAの場合 この手順を試みる際には、事前に適切に遺伝子型が決定された低通過マップのみを使用することを覚えておくことが重要です。
この研究は、マウス胚性線維芽細胞(MEFs)が誘導多能性幹細胞(iPSCs)への転換過程における希少な再プログラミング中間体を単離する手順を概説しています。このプロセスには、特定の転写因子と抗体ラベリングを使用して、これらの中間体の同定と単離を容易にします。
Purification of iPS cell intermediates using cell surface markers enables mechanistic de-risking of reprogramming workflows, addressing a key bottleneck in stem cell-based discovery. This approach enhances predictive confidence in early-stage cell fate decisions and supports robust target validation for regenerative medicine and disease modeling portfolios. Isolating rare intermediates allows for precise interrogation of reprogramming dynamics, informing risk-adjusted advancement in cell therapy pipelines.
This cell surface marker-based purification method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging mechanistic studies with translational applications.