ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督
2014年9月15日
私たちは、発生生物学からの知識と公開された研究に基づいて、ヒト胚性幹細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンを効率的に生成するための最適化されたプロトコルを開発しました。これは、パーキンソン病の疾患モデリングと細胞補充療法に役立ちます。
この手順の全体的な目標は、高効率のドーパミン作動性ニューロン分化を誘導することです。インビトロ。これは、まずヒトP多能性幹細胞の単一細胞接着培養物を調製することによって達成されます。
第2のステップでは、細胞培養培地をニューロン誘導培地に切り替えて、フロアプレート前駆細胞を誘導します。次に、ドーパミン作動性ニューロンを成熟培地で培養します。そして最後に、シングルセルドーパミン作動性ニューロン前駆細胞をポリLオルニチンラミネートフィブロネクチンプレート上で培養し、成熟培地を30日間培養します。
最終的には、免疫蛍光顕微鏡を使用して、重要なドーパミン作動性ニューロンマーカーの発現を評価することができます。この技術は、神経酸プロトコル上の既存の神経球よりも大きな利点があります。それは、より高い効率でより均質な二重神経集団を生成することができます。
継代後4日で細胞培養液から培地を吸引します。ウェルあたり1ミリリットルのアキュテインで細胞を分離し、摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション中に、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルのゼラチンを加え、次に、新たに調製したマトリゲルコーティングプレートとともにプレートをインキュベーターに入れます。
細胞が半浮遊状態になったら、ピペットで数回上下させて、単一細胞懸濁液を作ります。次に、細胞を15ミリリットルのチューブに引き込み、3分間遠心分離します。258 Gおよび室温で、血清を添加した適切な量のヒト多能性幹細胞培養培地にペレットを再懸濁し、最終濃度2ミリモルまでこのビビンを添加します。
次に、ゼラチンコーティングプレート内の細胞を37°Cで1対1の比率で30分間インキュベートします。覚せい剤フィーダーを取り外すには、細胞を新しい15ミリリットルチューブに移します。血清と補足される人間の多能性幹細胞媒体でそれらを薄め、細胞を再度回転させた後でそれらを数える、1つの媒体の MT.SR thias Ivanの1つの媒体の細胞を180,000の細胞/ミリリットルの集中に再懸濁する。
次に、コーティングされたプレートからマトリゲルを吸引し、ウェルごとに2ミリリットルの細胞を分注します。細胞をマトリゲルプレートに再播種した後。
各ウェルから培地を吸引し、細胞をPBSで一度洗浄します。次に、SB 4 31、50 42 an L DN 1 9 3 1 8 9を添加した培地を、20日目のチャートに示されているように、毎日培地をDゼロからD20に交換する細胞に2ミリリットルのKSR分化を加え、分化培地を吸引し、37°Cでウェルあたり37°Cの細胞を5分間分離します。インキュベーション中、インキュベーター内のポリLオリネラミニンフィブロネクチンプレートを温めます。
次に、Resusの後、分離した細胞を単一の細胞懸濁液に懸濁し、神経基礎培地で細胞を希釈します。カウント後、細胞をスピンダウンし、ペレットをB 27、分化培地に1ミリリットルあたり100万個の細胞濃度で再懸濁します。次に、ポリオールオリンラミニンフィブロネクチンプレートからフィブロネクチンを吸引します。
それらをPBSで2回洗浄し、それぞれに400マイクロリットルの細胞を移します。さて、最初の24時間後にようやく培地を交換し、その後は実験エンドポイントまで隔日で交換して、付着していない死細胞を取り除きます。これらの画像に示されているように、再播種されたシングルセルヒト多能性幹細胞培養物は、分化の最初の48時間でクラスターとして拡大し、約70%のコンフルエントに達します。
分化後、細胞は最短で3〜4日で完全なコンフルエンスを達成します。20日目までに、分化した細胞は付着し、小さな塊として成長します。次の5日間で、はるかに集中的で形態学的に無傷の軸索と神経突起が塊内に現れ、塊間に何らかの接続を形成します。
11日間の分化後、ヒト多能性幹細胞は効率的に床板前駆体に変換できます。これらの画像で示されているように、ほとんど全ての細胞が床板前駆体を発現し、細胞マーカーは巣を作り、キツネAは2つ以上存在する。90%の細胞がCorin O OTX twoとLM X one Aを発現し、さらに分化した後、床板前駆細胞はTUJ oneとTHを発現するドーパミン作動性ニューロンに特化します。これらのドーパミン作動性ニューロンは、GK 2を発現し、カルビンジン免疫染色実験に対して陰性であるため、9つの同一性を有しており、GFAPアストロサイトがなく、GABA作動性ニューロンが非常に少ないことも示しており、分化がドーパミン作動性ニューロン系統にのみ特異的であることを示しています。
この手順をテストする際には、日常の細胞培養で一貫性を保ち、培地が正しい成分で新たに調製されていることを確認することが重要です。
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概要
本記事では、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成するための最適化されたプロトコルを提示します。この進展は、パーキンソン病のモデリングおよび細胞置換療法の探索において重要な意味を持ちます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 再生医療
背景
- ドパミン作動性ニューロンは運動制御において極めて重要です。
- パーキンソン病は、これらのニューロンの変性を特徴としています。
- 現在の治療法には限界があり、新しいアプローチが必要です。
- 幹細胞は、ニューロン置換のための潜在的な供給源となります。
研究目的
- 幹細胞をドーパミン作動性ニューロンへ分化させるための信頼性の高い手法を開発すること。
- 多能性幹細胞からのニューロン生成効率を向上させること。
- パーキンソン病をin vitroで研究するためのツールを提供すること。
使用した手法
- ヒト多能性幹細胞の単一細胞接着培養の調製。
- フロアプレート前駆細胞の形成を促進するための神経誘導培地への切り替え。
- 成熟培地を用いたドーパミン作動性ニューロンの培養。
- 専用プレート上での単一細胞ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞の30日間の最終培養。
主な結果
- ヒト多能性幹細胞からドパミン作動性ニューロンへの分化に成功。
- A9中脳ドパミン作動性ニューロンを高効率に生成。
- 疾患モデリングおよび細胞置換療法への応用の可能性。
- 多様な研究ニーズに合わせてプロトコルを適応可能。
結論
- 開発されたプロトコルは、神経科学研究における重要な進展です。
- これは、パーキンソン病に関する今後の研究の基盤となります。
- さらなる研究により、これらのニューロンを用いた治療戦略を強化できる可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
ヒト多能性幹細胞をA9ドパミン作動性ニューロンへと指向性分化させることは、パーキンソン病研究における疾患関連細胞モデルへの重要なニーズに応えるものです。本プロトコルにより、均一なニューロン集団のスケールアップ可能で再現性のある作製が可能となり、メカニズム研究と前臨床薬物スクリーニングの両方を支援します。この手法は、神経変性疾患のパイプラインにおけるターゲットバリデーションおよび初期のトランスレーショナルな転換点において、予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- パーキンソン病に関与するドパミン作動性ニューロン特異的なパスウェイの解析を可能にします。
- 系統特異的なヒトニューロンを生成することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- 制御された分化とマーカーに基づく系統確認を通じて、メカニズム面でのリスク低減を促進します。
- 疾患メカニズムの仮説駆動型探索のためのプラットフォームを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 再現性のあるアッセイ開発に向けた、標準化および均質化されたニューロン集団を提供します。
- アッセイバリデーションのためのニューロンマーカー発現の定量的な評価を可能にします。
- 疾患に関連するヒト細胞を用いたハイコンテントスクリーニングおよび化合物評価をサポートします。
- 神経変性疾患のスクリーニングキャンペーンにおけるスケーラビリティとプラットフォームの再利用性を向上させます。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- in vitro疾患モデリングを、ヒトに関連するドーパミン作動性ニューロンの表現型に適合させます。
- 患者由来iPSCを用いることで、創薬探索から前臨床検証までの継続性を可能にします。
- 予測的な細胞リードアウトを提供し、リスク調整された開発推進の意思決定をサポートします。
- 制御された細胞コンテキストにおけるトランスレーショナルなバイオマーカー探索を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この分化プロトコルは、創薬から前臨床へのシームレスな移行に組み込まれており、神経変性疾患における初期段階のターゲット検証、アッセイ開発、およびトランスレーショナルリサーチを可能にします。
- 発見生物学：ドーパミン作動性ニューロン生物学における仮説検証およびパスウェイ解明のための堅牢なシステムを提供します。
- スクリーニング：定量的化合物スクリーニングに向けた、再現性がありマーカーで検証済みのニューロンを提供します。
- 分析：比較分析のための、免疫蛍光法に基づいた系統特異的マーカーの定量化を可能にします。
- トランスレーショナル研究：in vitro疾患モデリングと患者由来の細胞システムを橋渡しし、前臨床研究に活用します。
- エンタープライズ再利用：複数の幹細胞源や疾患モデルに適応可能な、再利用可能な分化ワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経変性疾患研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：ニューロン分化を標準化し、R&Dチーム間での再現性と拡張性を確保します。
- 戦略的価値：初期段階の神経科学ポートフォリオにおけるgo/no-go判断の質と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：パーキンソン病パイプラインにおけるターゲットおよび治療仮説のリスク調整後優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- ヒト多能性幹細胞の培養および神経分化に関する専門知識が必要です。
- 特殊な細胞培養試薬、コーティングプレート、および免疫蛍光顕微鏡へのアクセスが必要です。
- 培地調製および細胞操作プロトコルの、チーム間での厳格な標準化が不可欠です。
- 疾患モデリング用の患者由来株を含む、hESCおよびhiPSCの両方のソースに適応可能です。
- 再現性を確保するため、一貫した細胞培養条件と品質管理された試薬に依存します。
