ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

本手順の全体的な目的は、in vitroで極めて効率的なドーパミン作動性ニューロンへの分化を誘導することです。これは、まずヒト多能性幹細胞の単一細胞接着培養を準備することによって達成されます。

第2ステップでは、フロアプレート前駆細胞を誘導するために、細胞培養培地をニューロン誘導培地に変更します。次に、ドーパミン作動性ニューロンを成熟培地で培養します。そして最後に、単一細胞のドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を、ポリL-オルニチンおよびフィブロネクチンでコーティングしたプレート上で、成熟培地を用いて30日間培養します。

最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて重要なドパミン作動性ニューロンマーカーの発現を評価することができます。この手法は、既存のニューロスフィアおよびニューロアシッドプロトコルよりも優れた利点があります。より高い効率で、より均質な二重神経細胞集団を生成することが可能です。

継代の4日後に、細胞培養液を吸引して除去します。1ウェルあたり1 mLのAccutaneを用いて細胞を剥離させ、37 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション中に、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのゼラチンを加え、新鮮に調製したMatrigelコーティングプレートとともにプレートをインキュベーターに入れます。

細胞が半分浮遊状態になったら、ピペッティングを数回行い、単一細胞懸濁液にします。次に、細胞を15 mLチューブに移し、258 ×g、室温で3分間遠心分離します。ペレットを、血清を添加した適切な量のヒト多能性幹細胞培養培地で再懸濁し、最終濃度が2 mMとなるようにthi vivinを添加します。

次に、ゼラチンコートしたプレート内で細胞を1:1の比率で37 °Cで30分間インキュベートします。その後、methフィーダーを除去するため、細胞を新しい15 mLチューブに移します。血清を添加したヒト多能性幹細胞培地で希釈し、再度遠心分離して細胞を回収した後、細胞数をカウントします。さらに、MT.SR one培地（thias Ivan添加）を用いて、細胞濃度が180,000 cells/mLになるように再懸濁します。

次に、コーティングしたプレートからMatrigelを吸引し、1ウェルあたり2 mLの細胞を分注します。細胞をMatrigelプレートに再播種した後、48時間培養します。

各ウェルから培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄します。次に、SB 431542およびLDN-193189を添加した2 mLのKSR分化培地を細胞に加えます。チャートに記載されている通り、0日目から20日目まで毎日培地を交換してください。20日目に分化培地を吸引し、1ウェルあたり1 mLの37 °Cに加温したAccutaseを用いて、37 °Cで5分間細胞を剥離させます。インキュベーション中に、Poly-L-ornithine/laminin/fibronectinコートプレートをインキュベーター内で加温しておきます。

Resus（再懸濁）後、剥離した細胞を単一細胞懸濁液にし、ニューロベーザル培地で細胞を希釈します。細胞数をカウントした後、細胞を遠心分離し、ペレットを B 27 分化培地を用いて 1 million cells/mL の濃度で再懸濁します。次に、ポリオルニチン・ラミニン・フィブロネクチンコートプレートからフィブロネクチンを吸引除去します。

それらをPBSで2回洗浄し、各ウェルに400 µLの細胞を移します。最後に、最初の24時間後に培地を交換し、その後は実験の終点まで、付着しなかった死細胞を除去するために1日おきに培地を交換します。これらの画像に示されているように、再播種した単一細胞のヒト多能性幹細胞培養物は、分化の最初の48時間でクラスターとして増殖し、コンフルエンシーは約70%に達します。

分化後、細胞はわずか3〜4日で完全にコンフルエントになります。20日目までに、分化した細胞は付着し、小さな凝集塊として成長します。その後5日間で、凝集塊の中に形態学的に完全でより高密度な軸索および神経突起が現れ、凝集塊間にいくつかの接続が形成されます。

11日間の分化後、ヒト多能性幹細胞は効率的に床板前駆細胞へと変換されます。これらの画像で示されているように、ほぼすべての細胞が床板前駆細胞マーカーであるnestinおよびfox A2を発現しており、90%以上の細胞がCorin、OTX2、およびLMX1Aを発現しています。さらなる分化により、床板前駆細胞はTUJ1およびTHを発現するドーパミン作動性ニューロンへと分化します。これらのドーパミン作動性ニューロンは、Girk2を発現しcalbindinに対して陰性であるため、A9アイデンティティを有しています。また、免疫染色の実験により、GFAP陽性のアストロサイトが存在せず、GABA作動性ニューロンも極めて少ないことが示されており、この分化がドーパミン作動性ニューロン系統に特異的に行われたことが確認されました。

本手順を検証する際は、日常的な細胞培養において一貫性を維持し、培地が正しい成分を用いて新しく調製されていることを確認することが重要です。