Name: ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンへの効率的な分化プロトコル。30日間の培養で高純度のニューロンを誘導し、パーキンソン病のモデリングや細胞置換療法の研究に応用できます。

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著者は、このプロトコルの開発中およびこの原稿の準備中に助けてくれたRenee Reijo Pera研究室のメンバーに感謝します。この研究は、California Institute for Regenerative Medicine(CIRM)の共有ラボ(CL-00518)によってサポートされています。

培養培地の調製<ol><li>以下を組み合わせることにより、マウス胚線維芽細胞（MEF）培地の調製：445ミリリットルDMEM 50mlのウシ胎児血清（FBS）、および5mlの100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液。せいぜい14日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。 </li><li>以下を組み合わせることにより血清含有HPSC培地を調製する：385ミリリットルDMEM / F12 100mlのノックアウト血清代替物（KSR）を5ml 100×非必須アミノ酸ストック溶液を5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液5mlの100倍ストック溶液をメルカプトエタノール、および10ng / mlのbFGF。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。 </li><li> 400ミリリットルmTeSR1基礎培地、100ミリリットル5倍サプリメント、および5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液：次のように組み合わせることにより、mTeSR1無血清培地を準備します。せいぜい10日間4℃での媒体に保管してください。 </li><li> 10倍のコラゲナーゼIVストック溶液を準備します。0.5グラムコラゲナーゼIVパワーを秤量し、滅菌50ミリリットルDMEM / F12、フィルターでそれを溶かす。アリコートを作成し、数ヶ月のために-20℃でそれらをストック。 </li><li> 0.1％ゼラチン溶液を調製：（牛の皮膚から、タイプB）0.5gのゼラチン電力を計量し、脱イオン水で溶解する。週間室温でオートクレーブ滅菌溶液を保管してください。 </li><li>下記を組み合わせてKSRの分化培地を調製する：410ミリリットルDMEM、75ミリリットルKSRを、5mlのストック溶液をメルカプトエタノール100X非必須アミノ酸ストック溶液を5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液を5mlの100倍。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。 注：KSRは分化効率に影響を与える可能性がロット、によって異なります。それは差別化のための最高のものを見つけるために、KSRの数バッチをテストすることをお勧めします。 </li><li>次のように組み合わせることにより、N2分化培地を準備します。98ミリリットルのDMEM、1ミリリットル100×N2サプリメント、1mlの100Xペニシリン/アンピシリンストック溶液。 4で濾過滅菌培地にしてく​​ださいせいぜい10日間°C。 </li><li> 10ミリリットル50倍B27サプリメント、5ミリリットルの原液をグルタマックス100X、および5ml 100×ペニシリン/アンピシリンストック溶液、480ミリリットル神経基礎培地：次のように組み合わせることにより、B27分化培地を準備します。せいぜい10日間4℃で濾過滅菌メディアを保管してください。 </li></ol> MEFフィーダー細胞上でのhESCとhiPSCs 2。文化たH9 hESCをWiCell研究所から入手し、hiPSCsは山中のレトロウイルス媒介形質導入を通じてReijoペラ研究室で確立されたOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 18因子 。 <ol><li>少なくとも1日細胞継代の前に、6ウェルプレートの1ウェル1 mlの0.1％ゼラチンを添加することによって、いくつかのゼラチン板を準備し、少なくとも30分間37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、プレートから吸引ゼラチン、および種子照射後1.6×10 5細胞の密度でプレートにMEF細胞を不活性化/ウェルMEF培地中の細胞をカウントする血球計数器を用いて。 注：必要に応じて細胞継代の前に、早くも3日間としてMEFフィーダーを用意。 </li><li>継代細胞MEFフィーダープレーティングの翌日：hPSCsから吸引媒体は、1ミリリットル/ウェルの細胞に1 mg / mlのコラゲナーゼIVを追加し、1時間、37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>このインキュベーションの間、PBSで一回MEFフィーダーを洗い、その後、十分に1.5ミリリットル/の温水（37℃）血清含有HPSC培地を追加します。 </li><li>分化したコロニーが付着したままで未分化コロニーのほとんどは、プレートから離脱するように、1時間後、培養プレートを数回タップします。慎重に浮遊コロニーを収集し、15mlチューブにそれらを転送します。 </li><li>優しく温かい（37℃）DMEM / F12で一回プレートを洗浄し、同じ15ミリリットルチューブにDMEM / F12キーを転送します。 </li><li> 3分間179×gでチューブを遠心。 </li><li>管から培地を吸引し、ペレットを乱さないように注意しながら。戦争を追加M HPSC培地、ピペットで上下のセルを数回小さなクラスターにそれらを破壊し、それらをよく混合する。 </li><li> 1から新しいMEFフィーダー上に細胞を移す：3-1：6比率を。 </li><li>すべての5-6日間、毎日通路の細胞を培地に変更します。 </li></ol>分化のための細胞の調製<ol><li>細胞の調製の前に少なくとも一日には、いくつかのマトリゲルプレート（6ウェルプレートの一般的に3つのウェル）を準備します。 1時40分の冷（4℃）DMEM / F12でマトリゲルを希釈し、6ウェルプレートのウェルあたり1mlマトリゲルを加える。 4℃で一晩マトリゲル培養する。注：一つは、限り、一週間などのためにパラフィルムでマトリプレートを密封し、4℃でそれらをストックすることができます。 </li><li> 4日経過した後に細胞（手順2を参照）を使用します。プレートからのすべてに分化コロニーを削除します。培養プレートから培地を吸引し、十分に混合ACCUTASEにつき1を追加し、5分間、37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>インキュベーションの間、いくつかのゲルを調製6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルのゼラチンを加えることによりプレートATIN。これらのプレートを配置し、マトリゲルプレートをインキュベーター中で一日の前に用意しました。 </li><li> 5分間のインキュベーション後、またはとき細胞は単一の細胞にそれらを作るために数回上下半浮動、ピペット細胞となっている。 </li><li> 15ミリリットルチューブに単一細胞を収集し、3分間258×gで遠心する。 </li><li> HPSC培養培地を含む血清を適当量の細胞を再懸濁し、および2μMの最終濃度までThiazovivinを追加する。 </li><li>トランスファ1でゼラチン被覆プレート上に細胞：1の比、及びMEFフィーダーを除去し、37℃で30分間細胞をインキュベートする。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移し、HPSC媒体を含む適切な血清を追加し、血球計数器で細胞を数える。 </li><li> 3分間258×gで細胞を遠心。 </li><li>遠心分離機中、210μMの濃度を作るためにmTeSR1媒体を適切なThiazovivinを追加します。 </li><li>遠心分離機、Aの後メディアをspirate及び/ mlの培地1.8×10 5個の細胞が存在するようにThiazovivinで適切なmTeSR1媒体を追加します。 </li><li> 、インキュベーターからマトリプレートを取り出しマトリゲルを吸引し、6ウェルプレートの1ウェルに混合セルの2ミリリットルを追加します。 注：細胞密度は、表面積の3.6×10 4細胞/ cm 2であるべきである。 </li><li>バックインキュベーターにプレートを戻し、細胞を24時間、アタッチしましょう​​。 </li><li> 24時間細胞をプレーティングした後、古い培地を吸引し、ウェル当たり2ミリリットル新しいmTeSR1培地を追加し、分化を開始する前に、細胞はさらに24時間成長させ。 </li></ol>細胞分化<ol><li>マトリプレートに細胞を再播種した後に、分化の48時間を起動します。 </li><li>プレートから吸引し培地は、PBSで細胞を1回洗浄し、ウェル当たり、以下の分化培地2mlを追加します。10μMのSB431542および100nM LDN-193を補充したKSR分化培地分化のD0として189をマーク、この日。 </li><li> D0からD20まで毎日培地に変更します。 注：一つは、当時の2日間を超えない使用のための培地を調製することができます。 </li><li> 10μMのSB431542、100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、および50ng / mlのFGF8bを補充したKSR分化培地：D1とD2のために以下の培地を使用してください。 </li><li> 10μMのSB431542、100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、50ng / mlのFGF8b、および3μMのCHIR99021を補充したKSR分化培地：D3とD4のための以下の培地を使用してください。 </li><li> 100 nMのLDN-193189、0.25μMのSAG、2100μMのプルモルファミン、50ng / mlのFGF8b、および3μMCHIR99021を補った75％のKSR分化培地プラス25％、N2分化培地：D5及びD6のために以下の培地を使用してください。 </li><li> 100 nMのLDN-193189および3μMCHIR99021を補った50％KSR分化培地プラス50％、N2分化培地：D7とD8のために以下の培地を使用してください。</li><li> D9とD10のための以下の培地を使用してください：25％KSR分化培地+ 100 nMのLDN-193189および3μMCHIR99021を補った75％のN2分化培地。 </li><li> 3μMのCHIR99021、10ng / mlのBDNF、10ng / mlのGDNF、1 / mlのTGF3、0.2 mMのアスコルビン酸及び0.1mMのcAMPを補足したB27分化培地：D11とD12のために以下の培地を使用してください。 </li><li> 10ng / mlのBDNF、10ng / mlのGDNF、1 / mlのTGF3、0.2 mMのアスコルビン酸及び0.1mMのcAMPを補足したB27の分化培地：分化の残りのために以下の培地を使用してください。 </li><li>分化の約D16には、いくつかのポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートを準備します。希は15μg/ mlの冷（4℃）PBSでポリ-L-オルニチン原液を、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩プレートをインキュベートする。 </li><li> 、ポリ-L-オルニチンソリューションを吸引滅菌水でプレートを3回洗浄した後、空気のプレートを乾燥。 </li><li>ラミニンストックゾルを希釈1μg/ mlの冷（4℃）PBSでutionは、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩プレートをインキュベートする。 </li><li> 、ラミニン液を吸引滅菌水で3回プレートを洗浄した後、空気のプレートを乾燥。 </li><li> 、2 / mlの冷（4℃）PBSでフィブロネクチン原液を希釈し、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルを追加し、37℃で一晩培養する。 </li><li>パラフィルムでシールプレート限り2週間、4℃で配置します。 </li><li>分化の20日後、ポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートに細胞をreplate。吸引し分化培地は、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットル温かい（37℃）ACCUTASEを追加し、5分間37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>インキュベーションの間、インキュベーター内で、ポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンプレートを配置。 </li><li> 5分間のインキュベーションの後、または細胞がなったときに、上下に数回静かにピペット細胞をセミフローティング単一細胞にそれらを作る。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブに単一細胞を収集し、拡張に依存して変化する細胞計数のための神経基礎培地の適切な量を追加、（分化の11日後、細胞が15〜20倍に拡大する場合があります）。血球計数器を用いて細胞を数える。 </li><li> 3分間258×gで細胞を遠心。 B27分化培地で上清を吸引除去し、再懸濁細胞を細胞濃度/ mlの培地中1×10 6細胞となるように。 </li><li>吸引プレートからのフィブロネクチン、PBSで2回洗浄し、6ウェルプレートの1ウェルに2ミリリットルの細胞を加える。 注：再プレーティングのための細胞密度は、表面積の2×10 5細胞/ cm 2であるべきである。 </li><li>いずれかのアタッチされていない死細胞を除去するために24時間後に培地に変更します。 </li><li>所定の実験のための所望の時点まで、一日おきに培地を交換。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

（ヒトES細胞とhiPSCsの両方を含む）ヒト多能性幹細胞は、大部分を生成するためにインビトロで分化することができないすべての場合、以前の研究19で実証されているDAニューロンを含む私たちの身体の細胞型。ここでは、胚性ドーパミン作動性ニューロンの発生20からの知識や他の研究室14,15から公開されたプロトコルに基づいて、私たちはヒトES細胞とhiPSCsからDAニューロンの生成のための培養条件を最適化した。このプロトコルは、効率的で再現性があり、私たちは、H1およびH9 hESCのラインにし、PD患者と非罹患対照の両方からhiPSCラインにここで説明する、このプロトコルを正常に適用されている。 私たちのプロトコルでは、高分化効率を得るには、3つの重要なステップがあります：まず、監督分化前の細胞には分化さHPSCコロニーがあってはならない。 3つの胚葉全てに自発的な分化は、多くの場合、時間に見られるようにPSC培養物は、それが単一の細胞にこれらのhPSCsを解離する前に、これらの分化したコロニーを除...

ドーパミン作動性（DA）ニューロンは、中脳、視床下部、網膜、および嗅球を含むいくつかの脳領域、で見つけることができます。前脳における線条体に投影し、錐体外路運動系を形成することにより、黒質緻密部（SNpc）制御挙動および運動A9 DAニューロン。 A9 DAニューロンの変性は、第二の最も一般的なヒト神経変性疾患、現在不治であるパー​​キンソン病（PD）、につながる。細胞置換療法、PD 1の治療のための最も有望な戦略の一つであり、したがって、ヒト胚性幹細胞（hESC）との両方を含む、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）からA9 DAニューロンを導出することに大きな関心があった最近のヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）。 多くの研究は、さまざまな方法を使用してhPSCsからA9 DAニューロンを導出しようとしている。すべての神経を介してDAニューロンを生成した最も初期の報告ロゼット前駆段階。外部成長の2-4週間、L.ステューダー要因や同僚に成功神経ロゼットを生成するためにヒトES細胞を誘導した3つの他のグループの有無にかかわらずMS5 2またはPA6 3-5間質細胞との共培養することにより。そして、彼らは機械的切開またはさらなる分化のために酵素消化することにより、これらのロゼットを豊かに。他のレポートでは、研究者は、培養、分化6-9フローティング （EB）胚様体を介して神経ロゼットを生成しました。その後、研究者は、彼らは細胞外マトリックス上でのhESCとhiPSCsメッキ単層ベースの微分法10,11を設置し、in vivoでの胚のDAニューロンの発生を模倣DAニューロンへhPSCsの分化を誘導する培養中の異なる成長因子を追加しました。すべてのこれらの研究は、DAニューロンのいくつかの特徴を有する発現細胞チロシンヒドロキシラーゼ（TH）が得られたが、全体の分化プロセスは、時間と労力がかかり、一般的には非効率的な、そしてより重要なことは、これらのニューロンのエンジンA9アイデンティティはLmx1aの異所性発現12と1を除いてほとんどの研究で実証されていませんでした。近年、新たなフロアプレート（FP）は、プロトコルベースのその後DAニューロン電位を有するFP前駆体が第一の分化の初期段階の間にソニックヘッジホッグおよびカノニカルWntシグナル伝達経路の活性化によって生成された、13-16を開発したこれらのFP細胞をさらにDAニューロンに指定されました。このプロトコルは、より効率的であるが、いくつかの問題が依然として存在する。例えば、全分化プロセスが（少なくとも35日）時間がかかり、15依存性フィーダー細胞であるか、またはEB を16依存性またはA9同一性は14を示していなかったである。 ここでは、in vivoでの胚のDAニューロンの発生やその他の研究者の発表された結果からの知識に基づいて、私たちはEFFのための培養条件を最適化したヒトES細胞とhiPSCs両方からDAニューロンのicient世代。まず、小分子CHIR99021および低分子SAGとプルモルファミンとシグナリングソニックヘッジホッグとカノニカルWntシグナルの活性化により、FP前駆細胞を生成した。これらのFP細胞はFOXA2、Lmx1aの、コリン、OTX2およびネスチンを発現する。次に、 などが BDNF、GDNF、を含む成長因子とDAニューロンにこれらのFPセルを指定しました。カルビンジン17に対して負間、彼らがGIRK2に対して陽性であるように生成されたDAニューロンは、A9細胞型である。このプロトコルは、独立した高効率で再現性のフィーダー細胞またはEBです。このプロトコルを使用すると、人は、またはインビトロ PDのモデル化またはPDのための潜在的治療薬をテストするためのPD患者のhiPSCsからヒトES細胞や細胞移植研究のための正常人のhiPSCsから約4週間でDAニューロンを導出することができる。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ26140</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/アンピシリン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td>ライフ<td>テクノロジー</td><td>ズ10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ10828-028</td><td></td></tr>非<tr><td>必須アミノ酸</td><td>ライフテクノロジー</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>成長因子減少マトリゲル</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>セラゲン</td><td>テクノロジーC2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&Dシステムズ</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>のR&Dシステムズ</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R&D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗ヒト NESTIN 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td>1/1,000 希釈</td></tr><tr><td>ウサギ 抗ヒト OTX2 抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB9566</td><td>1/2,000 希釈</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ヒト FOXA2 抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 希釈</td></tr><tr><td>ウサギ 抗ヒト LMX1a 抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB10533</td><td>1/1,000 希釈</td></tr><tr><td>ウサギ 抗ヒト TH 抗体</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>1/500 希釈</td></tr><tr><td>チキン抗ヒト TH 抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB9702</td><td>1/500 希釈</td></tr><tr><td>マウス 抗ヒト TUJ1 抗体</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-435P</td><td>1/,2000 希釈</td></tr><tr><td>ウサギ抗ヒトGIRK2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>1/300希釈</td></tr>ウサギ<tr><td>抗ヒトカルビンジン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400</td></tr>希釈遠心<tr><td>分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Papaminergic (DA) neurons in substantia nigra pars compacta (別名 A9 DA ニューロン) は、パーキンソン病 (PD) で失われる特定の細胞型です。PDの再生細胞補充療法のために、ヒト多能性幹細胞(hPSC)からA9 DAニューロンを導出することに大きな関心が寄せられています。神経発達中、A9 DAニューロンは、中枢神経系の腹側正中線に位置する床板(FP)前駆体に由来します。ここでは、胚のDAニューロンの発生を模倣するhPSCのA9 DAニューロンへの段階的な分化のための培養条件を最適化しました。私たちのプロトコルでは、まず低分子法を使用してhPSCからFP前駆細胞を効率的に生成し、次にFP細胞をA9 DAニューロンに変換し、これを数ヶ月間in vitroで維持できることを説明します。この効率的で再現性があり、制御可能なプロトコルは、健常者やPD患者由来のヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)で良好に機能し、A9 DAニューロンを誘導して、in vitro疾患モデリングと薬物スクリーニング、およびPDのin vivo細胞移植療法を行うことができます。

分化プロトコルの概要を図1に示されている。ここに提示分化プロトコルの効率は、出発細胞の状態に依存する。このため、第1の分化のために単一細胞にhPSCsを解離する前にすべての差別化コロニーを除去し、そして第二に、一つはゼラチンでコーティングしたプレート上で細胞を培養することによって、ほとんどの、すべてではない、MEFフィーダー細胞を減少させる、ことを確認するために重要なことです30分、第三のために、マトリゲルプレート上に適切な密度で1枚HPSC単一細胞。 図2に示すように、HPSC単一細胞をプレートで約70％の集密度を形成、分化の前に48時間の間、クラスタとして展開されます再プレート。そして、分化後、これらの細胞は、3〜4日間限り短くフル合流点に到達し、D16-D17あたりから始めて、これらのコンフルエントの細胞は、プレートの一部のスペースを作るために開始し、いくつかの軸索/神経突起が既にできたこれらの空間および細胞層の下で観察される。 D20で再プレートした後、分化した細胞が付着し、小さな塊として成長した。その後、次の5日間、ずっと集中的、形態学的に無傷の軸索/神経突起...

私たちは、発生生物学からの知識と公開された研究に基づいて、ヒト胚性幹細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンを効率的に生成するための最適化されたプロトコルを開発しました。これは、パーキンソン病の疾患モデリングと細胞補充療法に役立ちます。

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

本手順の全体的な目的は、in vitroで極めて効率的なドーパミン作動性ニューロンへの分化を誘導することです。これは、まずヒト多能性幹細胞の単一細胞接着培養を準備することによって達成されます。第2ステップでは、フロアプレート前駆細胞を誘導するために、細胞培養培地をニューロン誘導培地に変更します。次に、ドーパミン作動性ニューロンを成熟培地で培養します。そして最後に、単一細胞のドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を、ポリL-オルニチンおよびフィブロネクチンでコーティングしたプレート上で、成熟培地を用いて30日間培養します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて重要なドパミン作動性ニューロンマーカーの発現を評価することができます。この手法は、既存のニューロスフィアおよびニューロアシッドプロトコルよりも優れた利点があります。より高い効率で、より均質な二重神経細胞集団を生成することが可能です。継代の4日後に、細胞培養液を吸引して除去します。1ウェルあたり1 mLのAccutaneを用いて細胞を剥離させ、37 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション中に、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのゼラチンを加え、新鮮に調製したMatrigelコーティングプレートとともにプレートをインキュベーターに入れます。細胞が半分浮遊状態になったら、ピペッティングを数回行い、単一細胞懸濁液にします。次に、細胞を15 mLチューブに移し、258 ×g、室温で3分間遠心分離します。ペレットを、血清を添加した適切な量のヒト多能性幹細胞培養培地で再懸濁し、最終濃度が2 mMとなるようにthi vivinを添加します。次に、ゼラチンコートしたプレート内で細胞を1:1の比率で37 °Cで30分間インキュベートします。その後、methフィーダーを除去するため、細胞を新しい15 mLチューブに移します。血清を添加したヒト多能性幹細胞培地で希釈し、再度遠心分離して細胞を回収した後、細胞数をカウントします。さらに、MT.SR one培地（thias Ivan添加）を用いて、細胞濃度が180,000 cells/mLになるように再懸濁します。次に、コーティングしたプレートからMatrigelを吸引し、1ウェルあたり2 mLの細胞を分注します。細胞をMatrigelプレートに再播種した後、48時間培養します。各ウェルから培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄します。次に、SB 431542およびLDN-193189を添加した2 mLのKSR分化培地を細胞に加えます。チャートに記載されている通り、0日目から20日目まで毎日培地を交換してください。20日目に分化培地を吸引し、1ウェルあたり1 mLの37 °Cに加温したAccutaseを用いて、37 °Cで5分間細胞を剥離させます。インキュベーション中に、Poly-L-ornithine/laminin/fibronectinコートプレートをインキュベーター内で加温しておきます。Resus（再懸濁）後、剥離した細胞を単一細胞懸濁液にし、ニューロベーザル培地で細胞を希釈します。細胞数をカウントした後、細胞を遠心分離し、ペレットを B 27 分化培地を用いて 1 million cells/mL の濃度で再懸濁します。次に、ポリオルニチン・ラミニン・フィブロネクチンコートプレートからフィブロネクチンを吸引除去します。それらをPBSで2回洗浄し、各ウェルに400 µLの細胞を移します。最後に、最初の24時間後に培地を交換し、その後は実験の終点まで、付着しなかった死細胞を除去するために1日おきに培地を交換します。これらの画像に示されているように、再播種した単一細胞のヒト多能性幹細胞培養物は、分化の最初の48時間でクラスターとして増殖し、コンフルエンシーは約70%に達します。分化後、細胞はわずか3〜4日で完全にコンフルエントになります。20日目までに、分化した細胞は付着し、小さな凝集塊として成長します。その後5日間で、凝集塊の中に形態学的に完全でより高密度な軸索および神経突起が現れ、凝集塊間にいくつかの接続が形成されます。11日間の分化後、ヒト多能性幹細胞は効率的に床板前駆細胞へと変換されます。これらの画像で示されているように、ほぼすべての細胞が床板前駆細胞マーカーであるnestinおよびfox A2を発現しており、90%以上の細胞がCorin、OTX2、およびLMX1Aを発現しています。さらなる分化により、床板前駆細胞はTUJ1およびTHを発現するドーパミン作動性ニューロンへと分化します。これらのドーパミン作動性ニューロンは、Girk2を発現しcalbindinに対して陰性であるため、A9アイデンティティを有しています。また、免疫染色の実験により、GFAP陽性のアストロサイトが存在せず、GABA作動性ニューロンも極めて少ないことが示されており、この分化がドーパミン作動性ニューロン系統に特異的に行われたことが確認されました。本手順を検証する際は、日常的な細胞培養において一貫性を維持し、培地が正しい成分を用いて新しく調製されていることを確認することが重要です。

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

このビデオは、非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞(hPSC)から神経前駆細胞を生成する方法を示しています。hPSCは、ニューロン分化培地を使用して神経前駆細胞に分化されます。非トランスジェニック細胞では低分子を用いて分化が誘導されますが、トランスジェニックhPSCは、ニューロン分化特異的な転写因子のプロモーターを誘導する抗生物質を添加することで分化します。...

非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオでは、テトラサイクリン応答性エレメントの制御下で神経原性転写因子遺伝子を保有する遺伝子操作レンチウイルスをトランスフェクションすることにより、ヒト多能性幹細胞をニューロンに分化誘導し、その後、テトラサイクリン誘導体および成熟培地で処理するプロセスを示しています。...

人工レンチウイルスを用いたニューロンにおけるヒト多能性幹細胞分化

このビデオは、パーキンソン病を研究するためのモデルを提供するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)のドーパミン作動性ニューロンへの分化を示しています。hESCは、マイクロウェルプレート内の神経誘導培地で培養され、3Dニューロスフェアが形成されます。次に、これらを神経誘導培地で培養して、ドーパミン作動性前駆ニューロンへの分化を促進します。ニューロンの最終的な成熟は、気液界面条件下で培養インサートで起こり、成熟したドーパミン作動性ニューロンからなる3Dオルガノイドが得られます。...

ヒト胚性幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンオルガノイドの作製

この手順では、人間の発達の間に観察されるものと類似しているチェックポイントを通過することによって終脳のニューロンを生成します。細胞は、自発的に区別するために許可されている神経系統に向かってそれらをプッシュする要因にさらされて、分離され、最終分化と成熟を可能にするためにカバーガラス上にメッキが施されています。...

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

私たちは、興奮性皮質ニューロン12に人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の、迅速な再現性、および効率的な分化を説明以前に公開されたプロトコルを変更して実施します。具体的には、私たちの修飾は、神経細胞の密度の制御を可能にし、ネットワークレベルでの電気生理学的特性を測定するために微小電極アレイ上で使用します。...

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。...

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)培養の自動化と、自動イメージングと解析に対応した神経分化を示す。...

ヒト人工多能性幹細胞由来皮質およびドーパミン作動性ニューロンの統合されたライブ細胞モニタリングによる自動生産

学ぶヒト多能性幹細胞からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンへの効率的な分化プロトコル。30日間の培養で高純度のニューロンを誘導し、パーキンソン病のモデリングや細胞置換療法の研究に応用できます。

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

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