Name: ナミハダニダニの適用ナミハダニ植物の害虫相互作用研究のための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶナミハダニの効率的な採集と植物への接種法、グリッド法による被害定量化技術。統計解析で植物系統の感受性差を評価し、植物害虫相互作用研究の効率化に貢献します。

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>jove_content<このプロジェクトは、カナダ政府からGenome CanadaとOntario Genomics Institute(OGI-046)を通じて資金提供を受け、Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.)も資金提供を受けました。T.V.L.は、フランダース科学研究基金(FWO)の博士研究員です。

ハダニ人口の1。メンテナンス注：ハダニは、カリフォルニア赤インゲン豆（ インゲンマメ ）で飼育されています。 <ol><li>前侵入に2〜3週間種子からマメ植物を育てる。 </li><li>侵入された植物との混在は、これらの植物;大人のダニが急速に新鮮な植物材料を植民地化します。 </li><li>新鮮な植物に置き換え、7〜10日ごとに古い寄生さマメ植物を除去します。 </li></ol> 2。成人女性ダニの収集<ol><li>洗濯方法を使用してコレクションをダニ<ol><li>ダニを収集するには、1から2日前までに、実験に寄生した植物と接触して、新鮮な豆の植物を置く。 </li><li> 1000〜2000の大人の女性のダニを収集するために20から30の新鮮な豆の植物を使用してください。 </li><li> RTで水道水を使用して0.001％でのTween 20の溶液を調製する。 </li><li>一度に2から3の植物を使用して、トゥイーン20溶液中に出没マメ植物を洗う。 </li><li&gt;各植物は葉からのすべてのダニを収集するために2〜3倍洗浄する。 </li><li>ダニの死亡を回避するために10分以内に完了するステップ2.1.4。 </li></ol></li><li>定義されたメッシュサイズ篩ダニ懸濁液の濾過により成人女性ダニの分離<ol><li> （破片を除去するために）500ミクロンと300ミクロン（成人女性のダニを収集する）（ 図1A）：以下のメッシュサイズのモレキュラーシーブを準備します。 </li><li> 500ミクロンのふるいを通して懸濁物をろ過する。 </li><li> 300ミクロンのふるいを通して懸濁物を濾過し直して。大人の女性のダニは保持されます。 </li><li>トゥイーン20を除去して清潔な水道水における成人女性のダニを300ミクロンのふるいを浸します。 </li><li>ふるいの底に単層でダニを広げた。 </li><li>ふるいのメッシュと側面から余分な水を除去するために紙タオルを使用してください。 NOTE：ダニを回復するために迅速に乾燥する必要があるため、これが行われる。 </li><li> 図1に示すように、組立体を調製B;これは、ダニが自由に移動できるようになりますが、それらは逃げるのを防ぎます。 </li><li>支持体として使用されているふるいの上にダニの篩を配置します。 </li><li>飛散ダニを防ぐために水で底のふるいを囲む。注：ダニは約5分後に回復を開始します。約30分後、移動ダニの数は、収集（ 図1D）を開始するのに十分である。彼らは、コレクションを妨害する絹を生産するようにダニは、1時間以内に収集する必要があります。 </li></ol></li></ol>ダニと3。プラント寄生 NOTE：成体雌ダニを回収した後、それらは植物の侵入のために使用することができる。 A）細いブラシ（プロトコルセクション3.1）を使用して、aとb）ポンプまたは真空ライン（プロトコルセクション3.2）を使用して：成人女性のダニによる実験植物をはびこるために使用する2つの方法があります。 <ol><li>ブラシを使ってダニ寄生 注：ハダニの侵入ブラシで植物当たり最大30ダニの適用のために使用される。 <ol><li>サイズ00や細かい柔らかい毛ラウンドアートブラシを使用してください。 </li><li> RTの水道水でブラシを濡らす。 </li><li>そっとブラシの先端を使用してふるいからダニをピックアップし、工場に転送。 </li></ol></li><li>ポンプを使用して侵入をダニ NOTE：30以上のダニが適用されるときに、ポンプ/真空ラインにより集めダニによる植物の侵襲が使用される。この方法では、マイクロエレクト​​ロニクス部品のピックアップや真空ライン用の真空ポンプを用いることができる。これは、空気の流れを一定にし、十分な強度（2-4 PSI）を維持することが重要である。 <ol><li>ポンプ/真空管とチップの間のアダプタとして下部に1.5ミリリットルの遠心管のカットを使用してポンプや真空ラインに接続しているチューブに1ミリリットルピペットチップを取り付けます。 </li><li>ピペットチップおよびアダプタ（1.5ミリリットル遠心管）との間に紙タオル一枚を置きます。注：この目的は、Tの内部トラップダニにある彼は、吸引プロセス中にチップをピペットし、また空気の流れ（ 図1C）を低減する。 </li><li>ピペットチップを用いてふるいから直接ダニを集める。 </li><li>または、ステレオスコープを使用して寄生した葉からダニを一つずつ集める。 </li><li>ダニの必要数は、収集された際に、ピペットチップの背面に紙タオルの一部が乱さであることを確認して、チューブからピペットチップを取り外します。 </li><li>ピペットチップをタップし、一緒にダニに凝集によってダニを集める。その後、葉の上に置きます。秒以内に、ダニは葉の上に分散させるために開始されます。 </li></ol></li></ol> 4。記録との評価植物被害<ol><li>記録植物被害 注：Aのシロイヌナズナは 、植物の損傷はダニ摂食の4日後に評価される。損傷が退緑斑点の総表面積として記録されている。損傷の測定のために、全体のロゼットを切断し、走査される。記載されスキャンパラメータは、エプソンV30スキャナ用ですが、任意の同様のフラットベッドスキャナのための良い出発点として機能します。個々の実験の実行との間の比較を可能にすべての実験のための一定のスキャンパラメータを保持します。 <ol><li>植物材料を汚染するスキャナ表面を防止するために、透明シートでスキャナベッドをカバーしています。 </li><li>その葉の向軸（上）側は、スキャナの光源と撮像素子に直面しているスキャナベッド上の全ロゼットと場所をカットします。ロゼットが重複することなく、個々の葉を取り込むには余りにも密であれば別の方法として、スキャナベッドに置く前に細かいハサミで重複しない葉の個々の葉やグループにロゼットを解剖。複数のロゼットを同時にスキャンすることができます。 </li><li>の遵守やスキャナカバーの汚染を防止するために、白い紙とロゼットや葉をカバーしています。 </li><li>閉じるスキャナカバーし、次のパラメータを指定してスキャンを実行します。解像度：1,200 DPI;カラーモード：Adobe RGBの;明るさ：25;ファイルタイプ：最大品質のJPEG。 </li><li>その後の被害の分析のための画像ファイルを保存します。 </li></ol></li><li>植物被害の定量化 NOTE：損傷の領域を手動でフォトショップを用いて計算される。原因ダニ供給の結果、葉の形や症状の色の強さに大きな差には、自動の方法は信頼性に欠けるた。従って、格子法は、植物の損傷を評価するために使用される。 <ol><li>フォトショップと植物の画像を開きます。 </li><li> 0.25ミリメートル×0.25ミリメートルの部門（ - ショー - グリッド、キーボードショートカットのCtrl + &#39;を表示またはディスプレイ）のグリッドでスキャンした画像をオーバーレイして、新しいレイヤーを作成します。 </li><li>重ねられた層の上に、ドット（「鉛筆ツール」、キーボードショートカットBを使用）を使用して、損傷を受けた葉の面積をマーク。グリッド単位の半分以上をカバーする損傷があるそれより下のグリッドの各正方形のために1つのドットを使用してください。ドットの大きさ、 すなわち （ピクセル単位で定義され、 </eM&gt;ドットあたり52ピクセル）。 </li><li>グリッド部の少なくとも半分を覆う植物の損傷を示すグリッドのすべての正方形ドットでマークされたときに、ヒストグラムツール（ウィンドウ - ヒストグラム）を使用して層上の画素の総数を決定する。ヒストグラムツールは、画素数を計測できるようにするものである。各ドットは、画素の一定および既知の数で表されるので、ヒストグラムツールは、拡張によって、顕著な正方形の総数を総ドット数を表す画素の総数を測定します。 </li><li>数式を使用してマークされた「ドット」の数を計算する。 ドット数=ドット当たりの画素の画素/数の合計数。 </li><li> 1ドットのグリッドの1マスに対応するように、グリッドの1平方の面積で画像上にマークされたドット数を乗じて損傷の総面積を計算する。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJeppson%2C+LR+%22Mites+injurious+to+economic+plants%22">Mites injurious to economic plants</a>. , University of California Press. (1975).</li>
<li>Migeon, A., Dorkeld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Mites+Web%3A+a+comprehensive+database+for+the+Tetranychidae%5BTitle%5D)+AND+%22http%3A%2F%2Fwww.montpellier.inra.fr%2FCBGP%2Fspmweb%22%5BJournal%5D)">Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae.</a> http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).</li>
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<li>Dermauw, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+gene+family+of+Tetranychus+urticae%3A+Implications+for+acaricide+toxicology+and+a+novel+mutation+associated+with+abamectin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance.</a> Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).</li>
<li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+bulk+segregant+mapping+uncovers+resistance+mutations+and+the+mode+of+action+of+a+chitin+synthesis+inhibitor+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).</li>
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<li>Khila, A., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+the+spider+mite+Tetranychus+urticae%3A+dsRNA+and+siRNA+parental+silencing+of+the+Distal-less+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development+genes+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene.</a> Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).</li>
<li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mity+model%3A+Tetranychus+urticae%2C+a+candidate+for+chelicerate+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).</li>
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<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+jasmonate+in+response+and+tolerance+of+Arabidopsis+to+thrip+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding.</a> Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).</li>
<li>Whiteman, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plant-herbivore+interface+with+a+leafmining+Drosophila+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis.</a> Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).</li>
<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+indole+glucosinolate+breakdown+products+with+antifeedant+effects+on+Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid).</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Adio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+defensive+function+of+Ndelta-acetylornithine%2C+a+jasmonate-induced+Arabidopsis+metabolite%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite.</a> Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+homolog+of+CORONATINE-INSENSITIVE1+is+required+for+the+maternal+control+of+seed+maturation%2C+jasmonate-signaled+defense+responses%2C+and+glandular+trichome+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development.</a> Plant Cell. 16, 126-143 (2004).</li>
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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このビデオでは、分離することと、大人の女性のダニ数の多い植物をはびこるために使用されるプロトコルを示しています。我々はAを使用して、このプロトコルを提示したがシロイヌナズナには、任意の植物ハダニインタラクションシステムのために使用することができるし、現在正常にトマト、ブドウ（ ビニフェラ種 ）植物にも適用されている。収集されたダニが同等の生理的状態（ 図3）であることを示すプロトコル利回り再現性のある結果を、。 これらのプロトコルは実施が簡単ですが、彼らはダニの回復に影響を与えるように、いくつかの重要なステップは、特別な注意が必要です。葉から洗濯ダニは、同時に最大3つのマメ植物で行われ、室温で水を使用して10分以内に完了しなければならないしなければならない。また、ダニは急速な乾燥のためのふるい上に広げなければなりません。ダニの回復が不十分である場合には、トゥイーン20洗剤の推奨された量は私たちであったかどうかチェックすることが重要ですEDと洗剤を十分にすすぎ工程の間に除去された場合。 <...

植物の害虫の相互作用は非常に科学的、経済的に重要なトピックである。それは、歴史的に（例えばトマトなど）の両方作物植物とモデル工場、Aを用いて検討したシロイヌナズナ 。両方の場合において、草食動物に対する植物の感受性は、草食動物の攻撃の後にまたは間接的に害虫の性能の評価を介して直接植物表現型の​​評価のいずれかを介して測定することができる。 植物の感受性の直接測定は、方法の範囲を使用して害虫種の数のために、以前に使用した。例えば、鱗翅目の幼虫の食害は、グリッド12の助けを借りて、肉眼でコナガ （コナガ）またはトリコプルシア （キャベツルーパー）のいずれかで消費される植物組織の一部の推定として測定される。また、その後の定量的画像解析による葉の損傷のデジタル画像を利用する方法があります。このような方法はに使用したAの研究アザミウマ （ミカンキイロアザミウマ）13、Scaptomyzaフラバ （リーフマイニングショウジョウバエ）14、およびTとシロイヌナズナの対話NI 15。 植物の感受性の間接的な測定は、広く植物害虫の相互作用の研究に使用される。 A.の例については、感受性シロイヌナズナアブラムシモモアカアブラムシの食害を桃には、一般的に害虫の繁殖力との相互作用16,17の後の植物の全体の形態の記述の分析を通じて評価される。 Aの別の典型的な間接的な指標害虫へのシロイヌナズナの感受性は、草食動物の乾燥や湿潤重量の評価である。このパラメータは、一般に、 モンシロチョウ （小白）、Pとして、lepidoteransの草食性を特徴付けるために使用されているコナガ 、またはTその幼虫や蛹の段階15,17のNI。 ハダニは、セルの内容FEですeders。ダニによる損傷は、緑の淡い白から色の範囲退緑斑点の集合体として認識されている。ハダニの食害に植物宿主の感受性は、以前にハダニのパフォーマンス日数の分析を通じて間接的に評価した後に侵入18,19、または直接植物週間後蔓延18の全体の形態を使用したり、公開される葉のデジタル画像を使用してその後の自動画像解析19日間ダニへ。これらのメソッドを開発し、トマト植物とTとの相互作用の研究のために使用されていたナミハダニ、典型的には、混合ダニ集団から集めた後、柔らかい毛ブラシを用いて、葉の表面上に配置したハダニの数が少ない（処置あたり5-15）を使用した。しかし、これらの方法は、ダニの大きい番号が適用される必要の研究には適していない。また、画像解析ソフトにおける枚葉画像の直接処理しながらアドビフォトショップ（サンノゼ、CA）又はImageJの20トマト損傷の分析のために使用することができるよう、これらのプロトコルは、表面のより大きな反射率を有するか、または軽く（着色及び視認性の高い毛状突起を有している、葉に適用するために変更が必要例えば 、 シロイヌナズナ ）植物の損傷をマーク退緑斑点の自動選択を妨害する。さらに、容易に以前の方法で利用することができハダニの発育段階が最も普及していると容易に識別成人女性に限定し、他の発達段階の利用を妨げるされています。 植物ハダニ相互作用のハイスループット分析に向けた最初の重要なステップは、ハダニを植物に挑戦し、確実な相互作用の成果を評価するために、再現性のあるシンプルで堅牢なプロトコルを確立することである。 このビデオ、大型のテンキーを迅速かつ簡単に収集するための効率的な方法では成人女性のダニのBER、実験プラントホスト上の応用、およびハダニ供給による植物被害の評価が記載されている。提示されたプロトコルは、その後の実験の用途に用いることができる任意の発達段階（卵、幼虫、若虫、成人男性、女性）で個人の何百もの高速で効率的な収集を可能にします。さらに、これらのプロトコルには、任意のダニ宿主植物に適用することができるが、特にA.例において実証されているシロイヌナズナ 。

<table><tbody><tr><td>植物材料:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カリフォルニア赤インゲン豆</td><td>ストークス、ソロルド、オンタリオ州、カナダ</td><td></td>生<td>後2週間、使用の2〜3日前にハダニがよく蔓延しています。Phaseolus vulgarisの他の品種を使用できます。</td></tr><tr><td>化学薬品:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>1%の標準的な解決は</td></tr>室温<tr>で水道<td>水</td><td></td><td></td>を簡単にするために準備されます <td>室温では、熱および冷衝撃はダニの生存率と性能に影響を与え</td></tr>ます <tr><td>その他の材料と機器:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックトレイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみのセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2Lビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ふるいのセット</td><td>自社</td><td></td>製造 <td>詳細な説明書をご用意しております</td></tr><tr><td>細いブラシ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td></td><td></td><td>0.2および1ml</td></tr><tr><td>1.5ml遠心分離管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エアポンプ</td><td></td><td></td><td>逆風風のアクアリウム型ポンプです。バキュームラインが使用可能です。必要な圧力降下は約2-4 psi</td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スキャナー</td><td>エプソン</td><td>V30</td><td>スキャン品質に必要な制御を可能にする任意のフラットベッドスキャナーです。実験にはEpson V30を使用しています。</td></tr><tr><td>スキャナーハードウェアおよびAdobePhotoshopソフトウェアと互換性のあるコンピューターWindows</td><td></td><td></td><td></td>またはOSXPC。</tr><tr><td>Adobe Photoshopソフトウェア</td><td>Adobe Systems Inc.、カリフォルニア州サンノゼ、米国</td><td></td>さまざまな<td>ヒストグラムツールを含む任意のバージョン。</td></tr></tbody></table>

ナミハダニダニの適用<em&gt;ナミハダニ</em&gt;植物の害虫相互作用研究のための

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

ナミハダニ、 ナミハダニは 、経済的価値の150以上を有する種の著しく幅広い、上フィードユビキタス多食節足動物草食動物である。それは、特にナス科およびウリ科トウモロコシ、綿など（ 例えば 、トマト、ナス、ピーマン、キュウリ、ズッキーニ）、温室効果観賞植物（ 例えば 、バラ、キク、カーネーション）、毎年恒例の畑作物（内、温室作物の主要害虫である大豆、テンサイ）、および多年生の文化（アルファルファ、イチゴ、ブドウ、柑橘類、およびプラム）の1,2。それが重要な農業害虫になり、極端な過食に加えて、T.ナミハダニ 3-7 は、その制御のために使用される殺虫剤および殺ダニ剤の広い配列に耐性を発現する傾向を有する。 ナミハダニは、（27℃で7日間）迅速なライフサイクルを有するように、優れた実験的な生物であるかつ容易に実験室での高密度に維持することができる。 （ インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色を含む）の遺伝子発現をアッセイし、RNA干渉を用いたハダニ内因性遺伝子の発現を不活性化するための方法が8-10開発されている。最近では、Tの全ゲノムシーケンスナミハダニはすでにその宿主植物（ シロイヌナズナやトマトナス·リコペルシカム ）11の一部に存在する同等のゲノムリソースを持つモデル生物として、この害虫草食動物を開発する機会を作成し、報告されている。一緒に、これらのモデル生物は、植物害虫の相互作用の分子基盤への洞察を提供することができます。 ここでは、大規模な成人女性のダニの数、実験プラントホスト上の応用、およびハダニ供給による植物被害の評価を迅速かつ簡単に収集するための効率的な方法が記載されている。提示されたプロトコルエンその後の実験の用途に用いることができる任意の発達段階（卵、幼虫、若虫、成人男性、女性）で個人の何百もの高速で効率的な収集をディセーブルさ。

20から30はびこっマメ植物を使用して、1は、篩を用いて約2,000の大人の女性のダニを収集することができます。ダニを転送するためにブラシを使用している場合、プラントごとに20ダニで10工場をはびこるするのに必要な時間は約15分である。収集およびアプリケーションの方法の組み合わせを図2に示す。 このプロトコルは、収集したダニは、同様の生理状態や植物ハダニの相互作用の研究に適した（ 図3 A）であることを実証し、植物の損傷の再現性のある結果を生成します。プロトコル·再現性を評価するために、成体雌性ダニは、ダニが20 3週齢A.のロゼット葉上に置いた洗浄方法を使用して収集された濡れたブラシでシロイヌナズナ植物 （アクCOL-0）。処理した植物は、スキャンされた4日postinfestation及び損傷の領域は、上述の技術を用いて定量した。繰り返し実験結果の比較はANOVAを用いて行った。実験用途の一例として、我々は3 ...

植物害虫の相互作用の研究のために必要とされる効率的なハダニの均質な試料の調製、実験的な植物の侵入、および植物の損傷の評価のためのプロトコルが、開発された。

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

この手順の全体的な目的は、特定の発育段階にあるハダニを迅速かつ確実に収集することです。まず、インゲンマメの植物にダニを飼育させることでこれを達成します。次に、1株に導入するダニの数に応じて、絵筆またはポンプを用いて、実験用植物に雌のダニを接種します。最終ステップは、グラフィックス編集プログラムを用いてグリッド法による植物被害の定量化を手動で行うことです。最終的に、統計解析を用いて、ハダニの攻撃に対する植物系統またはエコタイプの感受性の差を明らかにします。既存の手法に対する本手法の主な利点は、多数の成虫雌ダニを迅速かつ容易に収集し、それを実験用ホスト植物に接種させ、ダニの摂食による植物被害を評価するための効率的な方法を提供することにあります。本プロトコルにより、その後の実験に応用可能な、あらゆる発育段階にある数百個体の個体を迅速かつ効率的に採取することができます。まず、感染させる2〜3週間前に、種子からカリフォルニアレッドキドニービーンを栽培し、これらの植物を感染済みの植物と混植させます。すると、成ダニが速やかに新しい植物体に定着します。洗浄法を用いてダニを採取するため、寄生した古いインゲンマメの植物を7〜10日ごとに取り除き、新しい植物に交換します。実験の1〜2日前に、新しいインゲンマメの植物を寄生した植物に接触させておきます。成虫のメスを1000〜2000匹採取するために、20〜30本の新しいインゲンマメの植物を使用します。実験当日に、ダニが付着したダイズ株を基部で切り取ります。次に、感染したダイズ株を2～3株ずつ0.001% Tween 20溶液で洗浄します。葉からすべてのダニを回収するため、各株を2～3回洗浄します。ダニの死滅を避けるため、10分以内で作業を行ってください。次に、ゴミを除去するための500 µmのふるいと、成虫のメを回収するための300 µmのふるいを準備します。懸濁液を500 µmのふるいでろ過し、その後、さらに300 µmのふるいでろ過して回収します。ふるいに泡が多く蓄積している場合、成体雌ダニが保持されてしまいます。ダニが付着している場合は、室温の緩やかな流水で優しく洗浄してください。Tween 20を除去するため、成体雌ダニの入った300 µmのふるいをきれいな水道水に浸し、ダニがふるいの底に単層に広がるようにします。ペーパータオルを使用して、メッシュおよびふるいの側面の余分な水分を取り除き、ダニが速やかに乾燥して回復できるようにします。次に、ダニが入ったふるいを、支持台として使用するふるいのの上に置きます。ダニが分散するのを防ぐため、下のふるいの周囲を水で囲みます。これにより、ハダニが自由に移動でき、かつ脱走を防ぐことができます。筆を用いたハダニの接種は、1株あたり最大30匹まで適用する場合に使用します。サイズ00またはそれより細い、ソフト毛の丸筆を使用してください。室温の水道水でブラシを湿らせます。ブラシの先端を用いて、ふるいからダニを慎重にすくい上げ、植物に転移させます。ポンプ真空ラインで回収したダニを30匹以上適用することで、植物への感染が完了します。この方法では、1.5 mL centrifuge tubeをアダプターとして使用し、ポンプまたは真空ラインに接続するチューブに1 mL pipette tipを取り付けます。ポンプの真空チューブとチップの間に、ペーパータオルの断片を挟みます。これにより、吸引プロセス中にpipette tip内でダニを捕捉し、同時に空気の流れを抑制することで、sieveから直接ダニを回収することができます。あるいは、実体顕微鏡を用いて、寄生した葉からダニを1匹ずつ回収します。必要な数のダニが集まったら、ピペットチップの背後にあるペーパータオルの断片を乱さないように注意しながら、チューブからピペットチップを取り出します。ピペットのチップを軽く叩いてダニを凝集させ、採取します。その後、ダニを葉の上に載せます。数秒以内に、ダニが葉の上へと分散し始めます。植物の被害を記録するため、スキャナーの表面が汚染されないよう、スキャナーのベッドを透明シートで覆います。植物試料のロゼット全体を切り取り、スキャナーのベッドの上に置きます。葉の向軸面をスキャナーに向けて配置します。光源とキャプチャエレメントにより、複数のロゼットを同時にスキャンすることが可能です。あるいは、ロゼットが高密度で個々の葉を重なりなくキャプチャできない場合は、スキャナーに配置する前に、精密鋏を用いてロゼットを個々の葉または重なり合わない葉のグループに切り分けてください。スキャナーのカバーへの付着や汚染を防ぐため、ロゼットまたは葉を白い紙で覆います。スキャナーのカバーを閉じ、解像度1,200 DPI、明るさを+25に設定し、ファイル形式を最高画質のjpegにしてスキャンを行います。後で損傷分析を行うために、画像ファイルを保存します。植物の損傷を定量化するために、Photoshopで植物の画像を開きます。新しいレイヤーを作成します。次に、スキャンした画像に25 mm四方のグリッドを重ね合わせます。オーバーレイ層に25mm間隔の分割線を引きます。鉛筆ツールを用い、損傷した葉の領域にドットを打ちます。グリッドの1単位の半分以上の面積に損傷がある場合、その正方形に1つのドットを記入してください。サイズはピクセルで定義されます。グリッドユニットの半分以上を植物の損傷が覆っているすべての正方形にドット（.）を打ってマークし、ヒストグラムツールを使用して、ドットの数を表すレイヤー上のピクセル数、およびそこから導き出されるマークされた正方形の総数を決定します。全ピクセル数を1ドットあたりのピクセル数で除して、マークされたドット数を算出します。1つのドットがグリッドの1つの正方形に対応するため、画像上のマークされたドット数にグリッドの正方形の面積を乗じて、損傷の総面積を算出します。このプロットは、3週齢のAANA植物で測定された損傷面積を示しています。20匹の雌ハダニを接種してから4日後の状態。植物への被害結果に再現性があり、収集したハダニが同等の生理学的状態で、植物とハダニの相互作用研究に適していることが示されている。このグラフは、20匹の雌ハダニを接種し4日後の、生後3週目のAANA植物で測定された被害面積を示している。実験的な応用の例として、1株あたり20匹のメスのハダニを湿ったブラシを用いて接種し、接種から4日後の被害を記録することで、3つの系統におけるハダニに対する自然変異と感受性を評価しました。被害データの定量化は、棒グラフまたは箱ひげ図として提示し、適切な統計的手法を用いて解析することが可能です。この例では、ハダニに対する感受性は系統間で有意に異なることが示されました。分離および寄生の手順は、サンプル数やワークフローの選択によって30分以内に完了させることができます。ダニを20%溶液に10分以上浸さないようにすることが重要です。種子システムを用いた分離により、さまざまな発達段階のダニの分画を得ることができ、害虫と植物の相互作用だけでなく、発達生理学や分子生物学など、多様な実験に利用することが可能です。

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ナミハダニダニの適用

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