Name: バレット食道の細胞の特徴のための免疫蛍光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶバレット食道細胞の免疫蛍光染色法。薬剤処理によるタンパク質局在と細胞構造の変化を蛍光顕微鏡で可視化し、治療効果を評価する有用なプロトコルを解説します。

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この作品は、セントジョセフの財団（AJF、LJI）と米国肺協会、RG-224607-N（LJI）からの補助金によって支えられている。

1。細胞株のメンテナンス<ol><li>不死化ヒト転写酵素（TERT）タンパク質11ヒトテロメラーゼ逆の安定なトランスフェクションにより、高グレード異形成（CP-B、CP-C、CP-D）および化生（CP-A）細胞株BE。 </li><li>ウシ下垂体抽出物（BPE）、上皮成長因子（EGF）、5％ウシ胎児血清（FBS）、非必須アミノ酸（NEAA）、ペニシリン - ストレプトマイシン、ネオマイシン（PSN）、標準を補充したケラチノサイト培地中BE細胞株を維持する組織培養条件（37℃、5％CO 2、98％湿度）。 </li></ol> 2。細胞播種BE <ol><li> 12ウェルプレート/カバースリップの調製。ガラスシャーレやオートクレーブに18ミリメートルのカバースリップを配置。転写は、真空管に取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて12ウェル組織培養皿にの18mmカバーガラスオートクレーブ。滅菌PBSやメディアでカバーグラスを洗う。 </li><li>トリプシン処理し、不死化細胞を数える。細胞USIを数える自動細胞カウンターまたは血球計数器をngの。 20,000〜40,000細胞/ mlの濃度に培養培地中の細胞を希釈する。 </li><li>各ウェル20,000〜40,000個/ウェルの総細胞数のためのカバーガラスを含むへの細胞の1ミリリットルを配置します。 </li><li>優しく細胞がカバーグラスに付着することを保証するために井戸の底にカバースリップをプッシュする滅菌ピペットチップを使用してください。 </li></ol> BE細胞の3。薬物療法<ol><li>所望の濃度に暖かい（37℃）培地で選択された薬物を希釈し、繰り返し転倒やボルテックスミキサーを使用してよく混ぜる。経験的に決定された薬物濃度。カバーガラスの上の細胞の付着を可能にすることで、細胞の初期播種治療後24時間を開始</li><li>比較対照のために、培養培地中に希釈し、0.1％の車両（ジメチルスルホキシド[DMSO]または薬剤は、化合物を可溶化するために使用される）と一緒に細胞の追加のカバーガラスを扱う。薬剤を同定し、VEのための研究室のペンでラベルプレートhicle、サンプルを処理した。 37℃、5％CO 2、湿度98％に設定し、細胞培養インキュベーター中に細胞を置き、所望の時点インキュベートする。 </li></ol> 4。免疫蛍光染色<ol><li>固定<ol><li>薬物治療の所望のインキュベーション時間後、培地を吸引し、室温（RT、25℃）で1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で迅速にカバースリップを洗浄する。 </li><li> PBSを吸引し、各ウェルに4％PFA [4％PFA / PBS]を含む1mlのPBSを添加し、室温で30分間インキュベートする。 </li><li> 4％PFA / PBSを吸引し、室温でPBSでカバーグラス3倍、5分間ずつ洗浄します。必要に応じて、4℃でのPBS/0.1％PFA中1週のための店のカバースリップ。 </li></ol></li><li>透過化/ブロッキング 抗体が細胞内標的にアクセスできるように固定されたPFAの細胞を透過。細胞外タンパク質を表面化するために、1×PBS/0.5％のBSA溶液に追加サポニンずに 、後続のすべての手順を実行します。 <ol><li>室温で10分間PBSで希釈した50のNH 4 Clでインキュベートすることにより、バックグラウンドを減少し、5分間に一度、RT PBSで洗う。 </li><li> 0.1％サポニンおよび0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSの100〜300μlの30分間、細胞をインキュベートBE。水で調製し、4℃で保存し、濾過滅菌し、10％の在庫からサポニンを希釈</li></ol>注：これは、0.5％BSAの添加に起因するカバースリップを阻止することによって細胞タンパク質に対する抗体の非特異的結合を防止する。あるいは、抗体の非特異的結合を減らすために5％に希釈したヤギ血清をBSAに置き換えてください。 </li><li>人間の商工会議所の作製<ol><li>湿ったペーパータオルでチャンバーの底を積層して正方形のバイオアッセイディッシュを用意し、その上にパラフィルムの層を配置します。 </li><li>穏やか鉗子、シリンジ針を使用してパラフィルムカバースリップ上に、上向きに細胞を移す。 </li><li>カバースリップを識別するためのラボのペンでパラフィルムをマーク。 </li></ol></li><li>一次抗体インキュベーション<ol><li> 0.5％BSAおよび0.1％サポニンの両方を含有するPBS中で一次抗体を希釈する。 </li><li>優しく実験室の組織を使用してブロッキング溶液をオフにブロットおよび一次抗体溶液100μlを加える。 4℃で一晩BE細胞に一次抗体をインキュベート</li></ol></li><li>二次抗体インキュベーション<ol><li>スライドは室温で5分間ごとに、PBS/0.5％のBSA/0.1％のサポニンで3回洗浄します。 </li><li>二次抗体が一次抗体が発生された種を認識することをPBS/0.5％のBSA/0.1％のサポニン中の蛍光タグで結合させた二次抗体を希釈します。 </li><li>各カバーグラスに希釈した抗体を100μlを加える。室温で2時間、二次抗体をインキュベートする。 </li></ol></li><li>洗濯やカバーガラスの取り付け<ol><li> PBS/0.5％のBSA/0.1％のサポニンでカバースリップ3X、5分間ずつ洗浄します。洗浄緩衝液を除去し、カバーグラスをPBS 100〜300μlを加える。 注：二重反の場合体染色は、繰り返しての議論に概説された情報に応じて必要な追加の一次および二次抗体を用いて4.4から4.5を繰り返します。 </li><li>ピンセットを使用して、穏やかにカバーグラスを持ち上げ、実験組織またはペーパータオルを使用してPBSをオフブロット。 </li><li>ガラス顕微鏡スライド上に、細胞ダウン、カバーグラスに4を含む適切な退色防止封入剤 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）の15μLを加え、カバースリップを反転。 </li><li>スライドフォルダにスライドを置き、ハードセット退色防止媒体が硬化させるために室温で一晩直射光からインキュベート、メーカーの指示に従って。抗退色媒体がセットされた後、スライドを顕微鏡的視覚化するまで4℃又は-20℃のいずれかで保存することができる。 </li></ol></li></ol>カバーガラスの5。顕微鏡可視化染色された細胞を、共焦点顕微鏡またはIFが可能なアップライトmicroscopのいずれかを介して画像化することができるE。共焦点顕微鏡は、離散深度で高解像度の画像を提供するが、直立顕微鏡が速く有用な画像を生成することができる。簡潔にするために、イメージングの方法は、標準的な顕微鏡を提示されている使用して細胞であっても染色した。一般的には、画像をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）または類似のフルオロフォア（ すなわち緑色蛍光タンパク質）に、テキサスレッドおよびDAPIは、これらのフルオロフォアを識別することのできるフィルタを備えた顕微鏡を必要とします。互換性の蛍光プローブを決定するためにプロトコルを開始する前に、顕微鏡をチェックしてください。 <ol><li>標準IF顕微鏡イメージング<ol><li> -20℃または4℃から保存されたスライド/カバースリップを削除し、それらを室温に加温することができます。顕微鏡と水銀アークランプの電源をオンにします。 </li><li>カバーガラスは、顕微鏡ステージ上に目的の方に向けた状態で顕微鏡スライドを配置します。油浸対物レンズを使用するために、カバーガラス上にイマージョンオイルの滴を追加します。 </li><li> DAPIフィルターを選択し、シャッターを開いてください。 </li&gt; <li>画像が表示されるまで、接眼レンズを通して見ながら目的の焦点を合わせる。すべての細胞はDAPIで染色されるので、核は容易に観察する必要があります。 </li><li>各画像処理ソフトウェアを用いて画像を収集する。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrett%27s+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma%3A+time+for+a+new+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li>
<li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Barrett%27s+esophagus+in+the+US%3A+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li>
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<li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett%27s+adenocarcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase%2C+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett%27s+esophagus+cell+lines%3A+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li>
<li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic%2C+Barrett%27s+cell+line+%28BAR-T%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li>
<li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461(2011).</li>
<li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+benign+Barrett%27s+epithelial+cells%2C+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li>
<li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+lifespan+of+Barrett%27s+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit%3A+a+useful+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li>
<li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li>
<li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60%28c-Src%29-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+%CE%B2-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li>
<li>Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin%2FCatenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li>
<li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li>
<li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々は、これらの細胞に対する標的療法の生理学的効果の解明に向けたBE細胞のIFを適用するための方法を説明してきました。我々はBE細胞に対してこれらの手順の使用を記載してきたが、我々は、これらの方法はまた、異なる細胞型13,17,18様々に適用可能であることを見出した。また、これらの手順は、特定のターゲットのための染色を最適化するいくつかの方法で変更することができる。 我々は適切なIFの際に直接的な影響を与えつのパラメータが固定の選択である見つける。我々は、上記の手順で固定のために4％PFA / PBSの使用を記載しているが、別の固定剤も適用可能である。冷メタノールで固定は（-20°C）で20分間のPBSで洗浄した後、特定のタンパク質/抗体13に適している。固定用の冷メタノールを使用することは細胞を透過する必要性を否定します。しかし、固定剤の選択（4％PFA / PBSまたは冷メタノール）が経験的に決定されなければならない。 </p&gt; 上記で概説した手順は、単一のタンパク質の可視化を記述...

バレット食道（BE）は、食道の正常扁平上皮および胃食道逆流症（GERD）1から生じる胃内容への慢性暴露の結果での化生変化です。 BEは、GERDへの反応に対する防御機構であると考えられているがBEの存在は、食道腺癌（EAC）、有意に低い生存率1を搬送する疾患のリスクの増加を与える。現在の推定は、米国人口の5.6％がBEていることを示唆しているBEは、しばしば無症候性であるように、しかしながら、それはBEの大部分は2診断未確定のままであると考えられる。逆流性食道炎とEACの両方の発生率は、継続的な成長3を見てきたように、この情報が潜在的にEACにBEの進行を防止に向けた治療的アプローチを提供することが特に、EACにBEの進行に関与する分子メカニズムを理解することが重要になってきている。 1の現在のパラダイムをもたらした。慢性炎症、外傷、および胃内容物への長期暴露に起因する遺伝毒性損傷はEACに腫瘍の進行を促進BE病変に対する選択圧を及ぼす。遺伝子変異の数は、EAC進行することで中に同定されている。しかし、これにもかかわらず、細胞のシグナル伝達における正確な変化および細胞構造および機能に対するその後の影響についての明確な理解の欠如がある。 インビトロ細胞株において不死化に特に標的化治療化合物の効果を調査において、細胞シグナル伝達の効果を研究するための有用なツールである。 BE不死細胞株の最近の商業的利用可能性は、そのような研究を可能にする。そのような広く使用されている生存率アッセイなどのハイスループットアッセイは、細胞増殖およびsuの際に標的療法の効果を評価する上で貴重であることができるが4-6 rvival、これらのアッセイは、細胞の形態に依存細胞シグナル伝達の効果を問い合わせるために有用ではない。免疫蛍光染色（IF）は、細胞の形態、増殖、および生存特性および関与するタンパク質の際に標的療法の効果を調査するための有用な技術である。当研究室では、薬物治療7の可能な化学予防治療とバイオマーカーの輪郭を描くことを望んでも細胞株の際に臨床的に利用可能な薬剤の効果を評価するためにIFを用いて、不死化細胞株に向けて、これらの方法を適応している。同様に、EACでのこれらの技術の適用は、BEと食道不死化細胞株は、EAC進行8-10にBEに関する重要な知見を描写している。標的療法で処置したBE細胞の分析は、細胞構造およびタンパク質局在化の変化の特徴付けを可能にする、値を有するIF我々は見つける。ここでは、Cに不死化細胞のIFのための私達の方法を提示薬物治療をharacterize。

<table><tbody><tr><td>CP-A(メタプラスチック細胞株)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4027</td><td></td></tr><tr><td>CP-B(高品位異形成細胞株)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4028</td><td></td></tr><tr><td>CP-C(高品位異形成細胞株)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4029</td><td></td></tr><tr><td>CP-D(高品位異形成細胞株)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4030</td><td></td></tr><tr><td>ケラチノサイト-SFM(1x)、Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1x)、フェノールレッド&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified, HI</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>PSN antibiotic mixture</td><td>Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズP36931</td><td></td></tr><tr><td>円形ガラスカバースリップ18 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-183-86</td><td></td></tr><tr><td>&β;-カテニン一次抗体(ウサギ)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9562S</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルーア488(ヤギ抗ウサギ)</td><td>ライフサイエンス</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>10 cm TC処理PS皿、滅菌USA</td><td>サイエンティフィック</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルTC処理PSプレート、滅菌済み</td><td>USA Scientific</td><td>5666-5180</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン - フラクションV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>SKI-606 (ボスチニブ)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1014</td><td></td></tr><tr><td>Square Bioassay Dish&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82024-546</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット、フリントガラス</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>ネクセロム ミニ セル カウンター</td><td>ネクセロム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セロメータ カウンティング チャンバー</td><td>ネクセロム</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス アポトーム顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

バレット食道の細胞の特徴のための免疫蛍光法

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

食道腺癌（EAC）は、全生存期間の17％未満の割合とEACの発生率は過去20年間に劇的に上昇しているがあります。 EACの主要な危険因子の一つは、バレット食道（BE）、慢性の胸焼けに応答して正常食道扁平上皮化生の変化である。 EACとBE、EAC者になるの進行に関与する分子事象、特に変更されたシグナル伝達経路の尋問の間に十分に確立された接続にもかかわらず、ほとんどわかっていない。これの多くは、これらの疾患を研究するために利用できるin vitroモデルにおいて適切性の欠如に起因している。最近では、不死化細胞株BEは、BEのインビトロ研究を可能にする商業的に利用可能になっている。ここでは、治療用化合物への曝露後の細胞シグナル伝達および構造体のインビトロ特徴付けを可能に 、BE不死化細胞株の免疫蛍光染色のための方法を提示する。これらの技術の適用は、HELうpはEACの進行者になるに関与するメカニズムへの洞察を開発し、EACの治療および予防のための潜在的な道を提供する。

記載された手順の適用から得られた結果の例を、 図1A〜Dに示されている。 CP-DおよびCP-Cを用いたカバーガラスの細胞は24 Srcファミリー阻害剤の1μM、SKI-606との時間、またはビヒクル（DMSO）処理し、ヘレン·ジャンクショ​​ンおよびWntシグナル伝達タンパク質、βについて上記の手順を用いて染色したBE -カテニン。細胞核の標識はDAPI（青色）で標識することによって達成しながら、β-カテニンの可視化は、緑色蛍光団に結合した抗ウサギIgGで標識することによって達成された。カバースリップは、ハード実装設定され、細胞は63X/1.4Nプランアポクロマート対物レンズを用いてレーザ走査共焦点顕微鏡を用いて画像化した使用して顕微鏡スライドに取り付けられた。選択された緑色のフルオロフォアは、488nmで励起され、505〜nmの発光フィルターを用いて可視化した。同様に、DAPIは、405 nmおよび410から460 nmのフィルターを使用して収集された放射で励起した。チロシンキナーゼのSrc、iの活性Sは、特に高度異形成12であることで増加した。細胞質/核から大腸と前立腺癌細胞...

バレット食道の分子ドライバーを改良し、情報のための識別可能な必要性がある。免疫蛍光染色は、細胞形態学上の細胞シグナル伝達の効果を理解するために有用な技術である。私たちは、バレット食道細胞において治療上の処置を評価するための免疫蛍光染色を使用するためのシンプルで効果的なプロトコルを提示する。

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

本実験の全般的な目的は、BE細胞における細胞構造およびタンパク質局在に対する薬剤処理の影響を評価することです。これは、ガラスカバースリップ上で培養したBE細胞を、標準的な細胞培養条件下で選択した薬剤とともにインキュベートすることによって達成されます。第2段階として、処理したBE細胞を固定液でインキュベートし、タンパク質の構造と局在を保持させます。次に、固定したBe細胞を一次抗体および蛍光標識二次抗体で順次インキュベートし、蛍光顕微鏡を用いて選択した標的タンパク質の変化を可視化します。免疫蛍光染色の可視化に基づき、薬剤処理によってBe細胞のタンパク質局在および細胞構造がどのように変化するかを示す結果が得られます。この手法はバレット食道に関する知見を提供しますが、がん細胞や正常細胞を含む他のシステムにも適用可能です。まず、18 mmのカバーガラスをガラス製ペトリ皿に入れ、オートクレーブ処理することからこの手順を開始してください。次に、真空管に接続した滅菌ガラスピペットを用いて、オートクレーブ滅菌済みのカバーガラスを12ウェル組織培養プレートに転写します。その後、カバーガラスを滅菌PBSおよび培地で洗浄します。続いて、トリプシン処理を行います。不死化細胞を自動細胞計数機またはヘモサイトメーターで計数し、その後、培養液で細胞を希釈して、濃度を 20,000 から 40,000 cells/mL に調整します。次に、カバーガラスが入った各ウェルに細胞懸濁液を 1 mL ずつ分注します。1ウェルあたりの総細胞数を 20,000 から 40,000 cells にするため、滅菌済みのピペットチップを使用してカバーガラスをウェルの底へそっと押し下げ、細胞が確実にカバーガラスに接着するようにします。BE細胞を処理するために、選択した薬剤を37 °Cの培地で目的の濃度まで希釈し、チューブを繰り返し反転させるかボルテックスミキサーを使用してよく混合します。細胞がカバーガラスに接着するように、BE細胞を播種してから24時間後に処理を開始してください。比較群と対照群を区別するため、薬剤処理およびビークル処理のサンプルプレートにラボペンでラベルを貼ります。さらに別のカバーガラス上のBE細胞を、培地で希釈した0.1%のビークルで処理します。その後、細胞を37°C、5% carbon dioxide、98% 湿度の細胞培養インキュベーターに入れます。薬物処理の所定のインキュベーション時間が経過した後、培地を吸引し、室温のXPBSを用いてカバースリップを速やかに洗浄します。次に、PBSを吸引し、各ウェルに4% PFAを含むPBSを1 mL加え、室温で30分間インキュベートします。次に、4% PFA-PBSを吸引します。カバーガラスを室温のPBSで5分間ずつ3回洗浄します。必要に応じて、カバーガラスを4°CのPBSおよび0.1% PFA中で1週間保存してください。抗体が細胞内ターゲットに到達できるように、固定したPFA細胞を透過処理するため、PBSで希釈した50 mM 塩化アンモニウムを用いて室温で10分間インキュベートします。その後、室温のPBSで5分間、1回洗浄します。これによりバックグラウンドを低減し、抗体の細胞タンパク質への非特異的結合を防ぎます。BE細胞を、0.1% troponinおよび0.5% BSAを含む100〜300 µLのPBS中で30分間インキュベートします。次に、チャンバーの底に濡らしたペーパータオルを敷き、その上にパラフィン層を設けて、正方形のバイオアッセイ皿を準備します。カバーガラスを識別できるよう、パラフィンにラボペンで印を付けます。ピンセットと注射針を用いて、カバーガラスを細胞面が上になるように注意深くパラフィンの上に移します。次に、0.5%BSAおよび0.1%サポニンを含むPBSで一次抗体を希釈し、ブロッキング溶液を穏やかに吸い取ります。ラボ用ティッシュを用いて、一次抗体溶液を100 µL添加し、細胞を4°Cで一晩インキュベートします。翌日、0.5%BSAおよび0.1%トロポニンを含むPBSで、室温にて5分間ずつ3回スライドを洗浄します。次に、蛍光タグ結合二次抗体を0.5%BSAおよび0.1%ponentを含むPBSで希釈します。希釈した抗体100 µLを各カバーガラスに滴下し、室温で2時間インキュベートします。0.5% BSAおよび0.1% troponinを含むPBSで、カバーガラスを5分間ずつ3回洗浄します。洗浄バッファーを除去し、カバーガラスに100～300 µLのPBSを加えます。ピンセットでカバーガラスをそっと持ち上げ、ラボ用ティッシュまたはペーパータオルでPBSを吸い取ります。次に、DPIを含む適切なAntifa封入剤15 µLをカバーガラスに加えます。細胞面を下にして、カバーガラスをガラス製顕微鏡スライドに載せます。その後、スライドをスライドフォルダーに入れ、Antifa封入剤を硬化させるため、室温で一晩、直射日光を避けて保管します。Antifa培地が凝固したら、顕微鏡観察までスライドを4 °Cまたは-20 °Cで保存できます。このステップでは、保存していたスライドを-20 °Cまたは4 °Cから取り出し、室温に戻します。顕微鏡と水銀アークランプの電源を入れます。カバーガラスを対物レンズ側に向けて、顕微鏡スライドをステージ上に設置します。次に、DAPIフィルターを選択し、シャッターを開きます。接眼レンズから覗きながら、像が現れるまで対物レンズの焦点を合わせます。すべての細胞をdpiで染色しているため、核は容易に観察できるはずです。適切な画像処理ソフトウェアを用いて画像を収集します。この図のカバーガラス上のCPCおよびCPDは、溶媒または1 µMのSRC阻害剤SKI 606で24時間処理され、その後、細胞を固定し染色しました。記載されたプロトコルに従い、緑色で示されたbeta cateninを特異的抗体およびLOR 4 88結合二次抗体を用いて可視化し、核を青色で示されたDPIで染色した。SKI 6 0 6による処理後、beta-cateninの局在が核から細胞膜へと変化していることに注目されたい。このビデオを視聴することで、タンパク質の局在や細胞構造を調べるために、バレット食道を免疫蛍光染色する方法について十分に理解することができます。

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生物学

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出典:Ear, P. H., et.al. 小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特性評価。J. Vis. Exp.

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同一食道がん患者からの腫瘍オルガノイド、がん関連線維芽細胞および対応する線維芽細胞の確立

学ぶバレット食道細胞の免疫蛍光染色法。薬剤処理によるタンパク質局在と細胞構造の変化を蛍光顕微鏡で可視化し、治療効果を評価する有用なプロトコルを解説します。

バレット食道の細胞の特徴のための免疫蛍光法

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