バレット食道の細胞の特徴のための免疫蛍光法

次の実験の全体的な目標は、薬物治療がBE細胞の細胞構造とタンパク質局在に及ぼす影響を評価することです。これは、ガラスカバースリップ上に増殖したBE細胞を、標準的な細胞培養条件で選択した薬剤とインキュベートすることによって達成されます。第2のステップとして、処理した細胞を固定剤でインキュベートし、タンパク質の構造と局在を維持します。

次に、固定be細胞を一次抗体および蛍光標識二次抗体と逐次インキュベートして、選択した標的タンパク質の変化を蛍光顕微鏡で可視化し、免疫蛍光染色の可視化に基づいて、be細胞の薬物処理がタンパク質の局在と細胞構造をどのように変化させるかを示す結果が得られます。この方法はバレット食道についての洞察を提供することができますが、癌や正常細胞などの他のシステムにも適用できます。この手順は、18ミリメートルのカバースリップをガラスのペトリ皿に入れ、オートクレーブで処理することから始めます。

次に、真空管に取り付けられた滅菌ガラスピペットを使用して、オートクレーブカバースリップを12ウェル組織培養皿に移します。その後、カバーは滅菌PBSとメディアで滑ります。次にトリプシン。

不死化された細胞は、自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、その後、培養培地中の細胞をミリリットルあたり20,000〜40,000細胞の濃度に希釈します。次に、カバースリップを含む各ウェルに1ミリリットルの細胞を入れます。ウェルあたり20、000〜40、000細胞の総細胞数の場合、滅菌ピペットチップを使用してカバースリップをウェルの底に優しく押し込み、細胞がカバースリップに付着することを確認します。

BE細胞を治療するには、選択した薬剤を37°C培地で所望の濃度に希釈し、チューブを繰り返し反転させるか、ボルテックスミキサーを使用してよく混合します。BE細胞の最初の着座から24時間後に治療を開始し、カバーに細胞を付着させることができます 薬物とビヒクルで処理されたサンプルプレートを事前にラベル付けし、実験用ペンで検査用ペンでスライドさせ、比較と制御を区別します。BE細胞の追加のカバースリップを、培地で希釈した0.1%ビヒクルで処理します。

その後、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度98%の細胞培養インキュベーターに入れます。薬物治療の所望のインキュベーション時間後、培地を吸引し、室温で1つのXPBSでカバースリップを迅速に洗浄します。次に、PBSを吸引し、4%PFAを含むPBSを1ミリリットルずつ各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートします。

次に、4%P-F-A-P-B-Sを吸引します カバースリップを室温でPBSで毎回5分間3回洗います。カバースリップは、必要に応じて4°CのPBSと0.1%PFAで1週間保管してください。固定されたPFA細胞を透過性の眼に当てて、抗体が細胞内標的にアクセスできるようにするために、PBSで希釈した50ミリモルの塩化アンモニウムと細胞を室温で10分間インキュベー

その後、室温のPBSで5分間一度洗います。これにより、バックグラウンドが減少し、抗体が細胞タンパク質に非特異的に結合するのを防ぐことができます。0.1%トロポニンと0.5%BSAを含む100〜300マイクロリットルのPBSでBE細胞を30分間インキュベー

次に、チャンバーの底に濡れたペーパータオルを重ね、その上に香水の層を置いて、正方形のバイオアッセイ皿を準備します。パルファムにラボペンで印を付けて、カバースリップを特定します。カバーを上向きにして細胞を鉗子と注射針を使用してパラムに静かに移します。

次に、0.5%BSAと0.1%サポニンの両方を含むPBSで一次抗体を希釈し、ブロッキング溶液を穏やかに拭き取ります。実験用組織を用いて、一次抗体溶液100μLを添加し、BE細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日。

スライドを0.5%BSAと0.1%トロポニンを含むPBSで室温で毎回5分間3回洗浄します。次に、蛍光タグで標識した二次抗体を、0.5%BSAおよび0.1%ponentを含むPBSで希釈します。希釈した抗体100μLを各カバースリップに加え、細胞を室温で2時間インキュベートします。

カバースリップを0.5%BSAと0.1%トロポニンを含むPBSで毎回5分ごとに3回洗浄します。洗浄バッファーを取り外し、カバースリップに100〜300マイクロリットルのPBSを追加します。鉗子でカバースリップをそっと持ち上げ、実験用ティッシュまたはペーパータオルを使用してPBSを拭き取ります。

次に、DPIを含む適切なAntifa封入剤15マイクロリットルをカバースリップに加えます。逆さカバースリップを、セルを下に向けてガラス製の顕微鏡スライドに置きます。その後、スライドをスライドフォルダーに入れ、室温で一晩直射日光を避けて、Antifa培地が硬化するのを待ちます。

Antifa培地が固まったら、スライドは摂氏4度または摂氏マイナス20度で顕微鏡で視覚化するまで保存できます。このステップでは、保管スライドをマイナス20°Cまたは4°Cから取り外し、室温まで温めます。顕微鏡と水銀アークランプの電源を入れます。

カバースリップを対物レンズに向けて顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置きます。次に、DAPIフィルターを選択し、シャッターを開きます。画像が表示されるまで、接眼レンズを通して見ながら対物レンズに焦点を合わせます。

すべての細胞がdpiで染色されているため、核は容易に観察できるはずです。この図では、適切な画像処理ソフトウェアを使用して画像を収集し、CPCでスリップを覆い、CPDをビヒクルまたはSRC阻害剤の1マイクロモルで処理しました。SKI6 0 6を24時間、細胞を固定して染色した。

記載されたプロトコルによれば、緑色で示されたβカテニンを、特異的抗体およびLOR 4 88に結合した二次抗体を用いて可視化し、一方、核を青色で示されたDPIで染色した。β-カテニンが核から細胞膜までの位置の変化に注目してください。SKI 6 0 6 による治療後。

このビデオを見れば、バレット食道を免疫蛍光染色してタンパク質の局在や細胞構造を調べる方法についてよく理解できるはずです。