水からのウイルス濃度のため、小容量の手順

本実験の全体的な目的は、元来ウイルス濃縮の最適化のために設計された小規模手法を用いて、水からのウイルス回収を最適化することです。水中のアデノウイルスを濃縮するための正電荷フィルターとしては、ガラスセルロースフィルターが最適であることが分かりました。また、二次溶出においては、フィルター表面からアデノウイルスを溶出させるために、セライトを用いた二次濃縮法が最適であることが証明されました。得られたこの手法は、テストしたすべてのフィルターと溶出の組み合わせの中で最高の回収率を示し、水道水から最も多くのアデノウイルスを回収することができます。

大容量濃縮などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、より少量のサンプル量を利用するため、多くの濃縮変数を迅速かつ容易に評価できる点にある。

本プロトコルの準備として、1 mLあたり10～100,000 MPNの0.22 µmフィルター滅菌済みウイルス溶液を含む、必要なすべての溶液を用意してください。

まず、滅菌した水道水 1 L を量り取ります。これを磁気撹拌子を入れた 2 L ビーカーに移します。水を撹拌しながらチオ硫酸ナトリウム 0.7 g を加え、完全に溶解させます。次に、1 M の酸または塩基のストック溶液を滴下して、pH を 7 から 7.5 の間に調整します。続いて、水にウイルスをスパイクします。調製したウイルス溶液 1 mL を全量加えます。フラスコを滅菌ラップで覆い、ウイルスが水に混ざり合うまで 10 分間静置します。

その間に、Milliporeフィルターを準備します。まず、パッケージから取り出し、上部ボウルと下部スクリーンの間がしっかりと密着していることを確認します。次に、フィルターのコルク材が1リットルのサイドアームフラスコの縁にぴったりとはまるか確認してください。続いて、フィルターの上部ボウルを取り外し、ピンセットを用いて47 millimeterの正電荷フィルターディスクをフィルタースクリーンの中央に正しく配置します。その後、ボウルを再度取り付け、反時計回りに回して固定します。

滅菌シリンダーを用いて、スパイクした水道水を100 milliliters量り取ります。次に、その水を2 literフラスコに取り付けられた調製済みフィルターハウジングに transferred します。フィルター内の正電荷ディスクは、プリーツ状のガラスセルロースまたはナノアルミナガラスファイバーを使用してください。フィルターに残った水を通すために、緩やかな真空を用いることができます。

次に、フィルターハウジングを250 milliliterのサイドアーム付きフラスコに移します。100 millilitersのビーフエキスを量り取り、フィルター上にゆっくりと注ぎます。エキスをゆっくりと通過させ、緩やかな真空吸引を用いて残渣をろ過します。

その後、2つの二次濃縮オプションのいずれかを実施してください。

Celiteを用いてウイルスを濃縮するため、ウイルスを含む250 milliliterフラスコの内容物をスターラープレートに移します。撹拌子を用いて、小さな渦を作ります。次に、0.1 gramsのCelite粉末を100 millilitersのビーフエキスに加えます。Celiteを分散させ、溶液のpH調整の準備をします。0.1 molar塩酸を滴下し、pHを4.0まで下げます。

その後、溶液を10分間混合させます。混合している間に、47 milliliterのプリフィルターを2 literフラスコに取り付けます。次に、100 millilitersのビーフエキス-celite混合液をプリフィルターに通します。ろ過を完了させるために、弱い真空（吸引）を用いても構いません。

次に、フィルターハウジングのスパウトの端に金属製チューブクリップを取り付けます。このクリップに滅菌済みの15 milliliterポリプロピレン採取チューブを取り付け、その後、フィルターをフラスコに再度組み立てます。

次に、pH 9の1X PBS 5 mLを用いて、Celite粒子からウイルスを溶出させます。PBSの大部分が重力によって15 mLチューブに滴下するのを待ち、残りの液を弱真空で吸引します。有機凝集法を用いてウイルスを濃縮するため、ウイルスを含む250 mLフラスコの内容物をスターラープレートに移します。撹拌子を用いて、小さな渦を作ります。1 M 塩酸を滴下し、溶液のpHを3.5に調整します。その後、混合液を30分間撹拌します。その後、溶液を滅菌済みの250 mLコニカル遠心チューブに移します。4°C、2,500 gで15分間遠心分離します。遠心後、チューブを扱う際はペレットを崩さないように注意してください。上清を慎重にデカンテーションし、pH 9のPBS 5 mLでペレットを再懸濁します。ペレットが完全に溶解していることを確認してください。次に、再懸濁液を4°C、4,000 gで10分間遠心分離します。濃縮されたウイルスを含む上清を回収します。ペレットは廃棄して構いません。

本プロトコルの最適化において、3種類のセライトを比較した。粒径の大きいセライトを使用すると、ADV 40およびADV 41の両方の回収率が低下した。

フィルターからの溶出をpH 7.5から12の間で試験し、フィルターからADV粒子を回収するのに最も効果的な条件を検討しました。その結果、pH 10のビーフエキスおよびセライトを併用したガラスセルロースフィルターにおいて、最高の回収率が得られました。この結果は、ADV 40とADV 41で同様でした。

pH 10における牛肉抽出物は、有機凝集よりも優れていることが証明された。

最適化された手法を、25%のトリプシン添加、およびビーフエキスへの0.1%ポリリン酸ナトリウムの補充と比較しました。いずれの処理においても、ADVの回収率は有意に向上しませんでした。

この手法を習得すれば、適切に実施することで45分で完了させることができます。