Name: の莢膜血清型肺炎球菌ラテックス凝集による (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶラテックス凝集法によるStreptococcus pneumoniaeの莢膜血清型判定法。簡便で迅速な診断微生物学手法として、試薬調製と品質管理の重要性を理解し、検査室での実装方法を習得する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作業は、ビル&メリンダ・ゲイツ財団が資金提供し、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラムによる貢献を受けたPneuCarriageプロジェクトの一部でした。

社内ラテックス試薬の調製<ol><li>グリシン緩衝食塩水（GBS）の調製<ol><li> 1.5グラムのグリシン、11.7グラムの塩化ナトリウムおよび200mlのガラス製ビーカーに100mlの蒸留水を加える。 </li><li>マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。 </li><li>メスシリンダー500mlに混合を移し、200ミリリットルの合計を作るために蒸留水を加える。 </li><li> 、200ミリリットルのビーカーに戻って解決策を移し、pHをチェックし、5M水酸化ナトリウムで8.2に調整してください。注：水酸化ナトリウムは腐食性で、個人用保護具を着用してください。 </li><li>フィルターは250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、0.22μMのフィルターと複数の60ミリリットルの注射器を用いて溶液を滅菌する。 </li><li> RTで保管してください。 </li></ol></li><li> 0.2％ウシ血清アルブミンGBSの調製<ol><li> 200mlのガラスビーカーにウシ血清アルブミン（BSA）粉末を0.2g、およびGBS 100ミリリットルを加え、マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。 </li><li>フィルター250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、いくつかの60ミリリットルの注射器を使用して、0.22μMのフィルターを通して溶液を滅菌する。 </li><li> 4℃で保存。 </li></ol></li><li>ラテックス試薬調製<ol><li> 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。 注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。 </li><li>滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後ラテックス試薬（ すなわち、プール、グループ、タイプまたは因子）を調製されるための適切な肺炎球菌血清を25μl加える。混合する5回転倒。 </li><li>滅菌生理食塩水1,080μlにラテックス粒子の120μLを添加することにより、ポリスチレンラテックス粒子1:10に希釈する。 注：これは、より大きな体積で製造することができるが、ラテックス試薬が生成されるたびに新たに作製する必要がある。 </li><li> 1に（ステップ1.3.3で調製した）午前1時10分ラテックス懸濁液1,000μl加え、000μlの1時40抗血清懸濁液（ステップ1.3.2で調製した）。混合する5回転倒。 </li><li>ゆっくりと回転ホイール上で37℃でインキュベートする（ 例えば38.5センチ、直径の車輪4 rpm）で2時間。 </li><li> 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、優しく滅菌生理食塩水2mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、GBSの1ミリリットルを追加して、静かにペレットを再懸濁します。 </li><li>ラベル5ミリリットルにラテックス懸濁液をピペットにキャップをスクリュー管。 GBSの別の1ミリリットルを追加します。 </li><li> 0.2％BSA（w / v）の液（pH 8.2）（ステップ1.2で調製した）を含有するGBSの2ミリリットルを追加します。防腐剤としてアジ化ナトリウム（w / v）の10％の40を添加する。 注：アジ化ナトリウムは吸入すると有害であり、皮膚や眼への刺激性である。これは、吸入暴露の危険性を最小にするように、それは、むしろ粉末形態より調製された10％溶液を購入することが望ましい。手袋などの保護具（この試薬を取り扱う際のdスプラッシュゴーグル）を着用する必要があります。詳細については、製品安全データシートを参照してください。 </li><li> 4℃で保存ラテックス試薬。 </li></ol></li><li>陰性対照ラテックス試薬の調製<ol><li> 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。 注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。 </li><li>滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後25μlの正常ウサギ抗血清を追加します。混合する5回転倒。 </li><li>段階的に上記の1.3.10に1.3.3のように実行します</li></ol></li></ol>ラテックス試薬2。品質管理（QC） <ol><li> RTにラテックス試薬を持参してください。使用直前に、穏やかにチューブを数回反転させてラテックス試薬を混合する。 </li><li>ガラス顕微鏡スライド上に15μlのピペッティングして自己凝集のための試薬を確認し、ステップ4.7と以下の4.8のように進んでください。 Aいいえがあってはならないラテックス粒子のgglutination。試薬は、白とスムーズに表示されます。 </li><li>低継代肺炎球菌分離株のパネルに対する試薬をテストします。分離株のパネルは「ターゲット」血清型の分離株（試薬の具体的な血清型がテストされている）と &#39;非標的」血清型（通常は交差させない他の血清型の分離株が含まれている必要があり、手順3でのように調製したばかりの増殖させた培養物を使用してください）試薬と反応する。 QCを受けて、各ラテックス試薬のための各標的および非標的血清型のうちの少なくとも1つの単離を含めます。特定の血清型の唯一の標的または非標的血清型、テストつの異なる分離株が存在する場合。 注：テストパネルは侵襲性疾患および/または型培養コレクションにまれであるそのうちのいくつかは、各血清型のいくつかの分離株を含むべきである。彼らはしばしば血清型に対してより厳しいあるので、いくつかのキャリッジ単離物に含めることが好ましいことがある（データは示していない）、それによってさらに容量oをテストする試薬fと試薬が分離株の侵襲性とキャリッジの両方を血清型のできる可能性があることを保証します。 </li><li>標的および非標的の肺炎球菌によるラテックス試薬のテストを続行しますが、手順3と4以下に記載した方法に従って分離します。 </li><li>少なくとも年に一度、その後は品質管理、製造時の試薬および。 注：試薬はQCに合格しなかった場合、バッチは破棄され、新たな準備がなされなければならない。リピートQCに障害が発生した場合では、試薬はOrtika ら 、2013 8および以下の説明で説明されている代替方法を使用して製造することをお勧めします。 </li></ol>血清型用肺炎球菌培養の調製<ol><li>無菌ループを使用すると、肺炎球菌の単一コロニーを選択 一次接種物は、プレート表面の約3分の1を覆うように固体の非選択性血液寒天上にこれを分離し、連勝。単一のコロニーのためのストリーク。 注：脱線維素ウマやヒツジ血液から調製されたプレートが適している。しかし、ヒトの血液またはクエン酸処理動物の血液を用いて調製した血液プレートはありません。 </li><li> 5％CO 2の雰囲気中で37℃でプレートO / Nインキュベートする。 </li><li>純度のプレート上での成長を観察し、血清型別のために十分な成長があることを評価する。 注：肺炎球菌分離株の純粋培養は、血清型別に必要とされている。プレート表面の約3分の1をカバーする当社の経験、コンフルエント、またはコンフルエントに近い成長では通常、血清型別を完了するのに十分である。肺炎球菌培養物が自己分解しやすいかもしれたように、血清型別のために準備文化がサブカルチャーの24時間以内にテストする必要があります。血清型が始まる前に、15以上の20分に、インキュベーターから培養プレートを服用しないでください。 </li></ol>ラテックス凝集血清型を実施4。 <ol><li>冷蔵庫からすべてのラテックス試薬を除去し、それらを約室温に温めるimately 30分。使用直前に、静かに試薬を混合するためにチューブを反転。 </li><li>顕微鏡スライドにラベルを付けます。 </li><li>顕微鏡スライド上の陰性対照ラテックス試薬15μlのを置きます。 </li><li>ループが約半分になるように滅菌した使い捨て1μlのループを使用すると、肺炎球菌文化のスイープを取る。 </li><li>静かに陰性対照ラテックス試薬の滴に近いスライドの表面上に接種物を汚す。接種物をガラススライド上に表示されるはずです。 </li><li>迅速かつ徹底的にループを使用して、陰性対照ラテックス試薬に接種材料を混ぜる。ドロップがその最初のサイズよりさらに広がっていないことを確認してください。 </li><li>両端にそれを持って、スライドをピックアップ。前後に1分間のスライドをロック。ゆっくりと移動する液体を保持し、液滴の大きさが増加しないように注意してください。 注：別の方法として、プレートロッカーを使用しています。 </li><li>によって、すなわち （巨視的凝集のために守って裸眼）、黒背景に対してサスペンションのクリア。 </li><li>ネガティブコントロールラテックス試薬は凝集を示さないか、クリアは上記のステップ4.1から4.8に陰性対照ラテックス試薬用のテストラテックス試薬の交換、文化のテストを続行した場合。新鮮なループは、毎回使用する必要があります。プールで始まるラテックス試薬のテストを続行します。 </li><li>陽性の検査が得られるまで連続して &#39;プール&#39;ラテックス試薬のそれぞれをテストします。 注：プールのテストの順序は、例えば、最初のスライド上の3つの可能性が最も高いのプールをテストすることにより（特定の血清型のローカル発生率を反映するために&#39;ラウンド&#39;で行うことができる肯定的な反応が得られない場合、テスト）などが陽性反応が得られるまで、第二スライド上の残りのプールの最も可能性の高い次の3。これは、必要な時間と試薬を最小にする、最も一般的な血清型が最初にテストされることを保証する。 </li><li>抗血清の製造元のキーを使用すると、陽性プールで表現されている個別の抗血清を決定します。 </li><li>上記の手順4.1から4.8のように、「グループ」または「タイプ」を決定するために、個別に陽性プールに含まれているグループやタイプのそれぞれをテストします。 </li><li>抗血清の製造元のキーを参照することによって、その結果を決定します。 &#39;タイプ&#39;が（ 例えば、血清型5）と判定された場合、それ以上の試験は必要とされず、この結果が記録されている。 </li><li> &#39;グループ&#39;が（ 例えば、グループ19）と判定された場合、試験される因子を決定するために、製造者のキーを参照する。個人の要因」のラテックス試薬とテストを続行し、最終的な血清型（ 例えば、血清型19B）を決定する。 </li></ol>

<ol><li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010%3A+estimates+of+incidence%2C+severe+morbidity%2C+mortality%2C+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li>
<li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease%3A+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li>
<li>Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatzke%2C+C+%22Vaccine%22">Vaccine</a>. , (2013).</li>
<li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li>
<li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Int+Health%22%5BJournal%5D)">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li>
<li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+%28Pneumotest-Latex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li>
<li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li>
<li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li>
<li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays%3A+a+cost-effective+technique+for+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li>
<li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li>
<li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+Appl+Chem%22%5BJournal%5D)">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li>
<li>Pneumococcus Key to S. pneumoniae types and pneumococcal diagnostic antisera. SSI Diagnostica. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> (2013).</li>
<li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li>
<li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li>
<li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li>
<li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li>
<li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Malays+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li>
<li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ラテックス凝集は、肺炎球菌血清型のため、簡単な、迅速かつ安価な方法である。市販の肺炎球菌ラテックス凝集試薬が利用可能であるが、それらは現在、すべての既知の肺炎球菌血清型10,12を区別しません。しかし、ラテックス凝集試薬は、容易に特定の肺炎球菌莢膜抗原に対して惹起購入した抗血清を用いて社内で製造することができる。ここに記載の方法において、抗体は、受動ラテックス凝集試薬のセットを作るためにラテックス粒子に結合している。 肺炎球菌の多糖カプセルは18,19を分離する上でラテックス粒子に結合した特異的抗体が抗原に接続すると、正のラテックス反応が起こる。抗体に付着したラテックス粒子は、特定の抗体 - 抗原反応は拡大せずに可視化することを可能にする。 ラテックス凝集法は、ハイスループット実験室のANに適した方法である資源の乏しい設定のためにもdは。ラテックス凝集法の主な利点には特殊な装置がテストを実行するために必要とされないことであり、試薬が4°C 8で保存した場合、少なくとも2年間の貯蔵寿命を有し、それは、安価で簡単かつ迅速であることを実行する。ラテックス凝集法による肺炎球菌分離株の血清型は、約10分を要し、最大4つのラテックス試薬は、1つのスライド上で並行して試験することができる。血清型の有病率は、関連する疫学的状況のために知られている場合にはさらに、テストは膨化試験17と同様に、最も一般的な血清型を含むプールが始まるのラウンドで行うことができる。このアプローチは、血清型を決定するために必要なテストの数を最小限に抑える。この方法はまた、異なるオペレータ間の高度に再現可能である（データは示さず）。ラテックス凝集型別の欠点は、試薬を製造するには、約4時間を考慮して、時間を消費することである。複数レアージュもののNTSは容易に並列的に製造することができる。さらに、いくつかの抗原は、いくつかの抗血清との交差反応で、その結果、異なる肺炎球菌血清型間で共通している（ 例えば 、血清型29、42とグループ35）。しかしながら、これらの交差反応（通常はより問題交差反応性抗体を除去するために前吸収される）は、市販の抗血清と追加の反応テーブルを使用する場合によく特徴づけされているが、存在する血清型を区別するために、製造業者によって提供される。抗体は、ラテックス粒子上に適切に位置合わせされていない場合、ラテックス試薬はまた、クロス反応し得る;これらは、QCの障害として検出される。われわれの経験では、厳格なQCは、市販の抗血清を製造するために使用される場合にも、この方法の成功の中心である。 QCは、試薬ごとに約15分かかりますし、適切な品質管理のセット上記のように隔離するに依存しています。 ここで説明する方法は、陽性反応ウェルw iを与える試薬になる試験期間薄い。われわれの経験では、偽陽性（データは示されていない）、実際にはまれである。時折偽陰性反応が観察される。通常、これらは、特定の抗血清の既知の問題（ 例えば、血清群6分離株はプールB抗血清と反応しない場合があります）、または分離株によるカプセル発現のダウンレギュレーションに関連している。偽陽性または陰性反応が「盲端」結果につながる多くの場合のように、製造業者によって提供される血清型algrorithmを使用することも重要である。反応は解釈が困難であるときに、これらのケースでは、そして、私たちはそのような膨張反応などの代替の方法で繰り返しテストおよび/またはテストすることをお勧めします。 いくつかのトラブルシューティングが時折満足なラテックス試薬を行う必要がある。ここで説明する方法では、抗体は、受動的吸着15,19を介してラテックス粒子に結合しているので、重要な変数はどれだけかを判断使用される抗体の濃度は、ラテックス粒子の表面を覆い、抗体の活性部位15,20のその後の位置合わせされている。不十分なまたは過剰な抗体をラテックス粒子に結合している場合にはその結果、抗体-抗原反応は最適ではなくなり、不満足な試薬は15,20,21を製造することができる。抗体価は、抗血清の異なるロット間で変化したように、希釈液の標準セットは、ウェル8を実行する試薬を生成しない場合があります。有用な出発点は、1:40希釈の抗血清を使用し、これが成功しない場合、さらなる抗血清を希釈することである。私たちの経験では、これは通常は問題を解決します8。症例数が少ないでは試薬は、標的分離株を用いて検査したときにサスペンションのクリアを伴わない弱い凝集を示してもよい。抗血清を希釈し、これらの場合に、試薬の質を改善しないが、良好な試薬は通常、遠心分離を省略することによって製造することができ、洗浄が8,22ステップ </sup&gt;。 抗体被覆ラテックス粒子は、多くの異なる微生物15,20の検出、同定または血清型のための診断微生物学で一般的に使用される。このように、ここで説明する方法は、適切な抗血清を入手し、適切なQC手順が採用されて提供され、他の目的のためのラテックス試薬を調製するために適切であり得る。

肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、特に資源の乏しい設定1,2で、世界的に5歳未満の子供における罹患率および死亡率の主要な原因である。肺炎、敗血症など生命を脅かす状況にローカライズされた感染症から肺炎球菌疾患の範囲とは、1,2髄膜炎。 肺炎球菌の90以上の血清型は、それらの莢膜多糖3の差に基づいて同定されている。現在のワクチンは、莢膜多糖を標的とし、侵襲性疾患の原因となる主要な4種の血清型からの保護を提供する。肺炎球菌血清型を分離することは台車や病気に対するワクチン接種の影響を評価するだけでなく、より広範な疫学的情報5,6を提供するために重要である。肺炎球菌血清型の現在の「ゴールドスタンダード」方法は膨化試験であるが、それは時間がかかり、perfoするためにいくつかのスキルが必要ですRM 7。ラテックス凝集は、世界保健機関7が推奨する代替血清型別法である。ラテックス凝集は、実行することが迅速かつ簡単であり、世界中で多くの研究室8-11に採用されている。重要なのは、ラテックス凝集法は、肺炎球菌血清型10,12-14ための膨化試験に匹敵する精度を示している。全体として、このメソッドは、リソースの乏しい設定だけでなく、ハイスループットラボに最適です。 ラテックス凝集試薬（「ラテックス試薬は&#39;）ラテックス粒子15に対する抗体の結合によって作成される。陽性反応では、これらの標識された粒子は、特定の抗原の存在下で凝集。市販のラテックス試薬は、血清型の制限された範囲で使用できます。ラテックス試薬はまた、市販の抗血清10を用いて社内で製造することができる。抗血清（「プール」）の混合物だけでなく、肺炎球菌sに特異的な抗血清さらにグループ内での血清型を定義するためのerogroups（ 例えば、グループ19）、個別の血 ​​清型（ 例えば、血清型5）、および特定の抗原に対する（ &#39;要因&#39;、 例えば 、血清型19Aを認識要因19cは）16用意されています。 この原稿は、ラテックス粒子に市販の抗血清の受動的な添付ファイルを用いたラテックス試薬の製造における主要なステップの概要を説明します。品質管理（QC）本方法の態様が記載されており、肺炎球菌血清型のためのラテックス試薬を使用するためのプロトコルが含まれている。

<table><tbody><tr><td>ポリスチレン、800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td>または<td>必要に応じて他の容量</td>に基づく微粒子</tr><tr><td>正常なウサギ血清</td><td>抗体オーストラリア&nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>または必要に応じて他の容量、使用前にRTに持参</td></tr>してください <tr><td>肺炎球菌(Neufeld)抗血清</td><td>SSI Diagnostica</td><td>さまざまな</td><td>使用前にRTに持参してください <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>A-4503</td><td>使用前にrRTに持参</td></tr>してください<tr><td>アジ化ナトリウム10%(v / v)溶液&nbsp;</td><td>VWRインターナショナル</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>注意:吸入すると危険です;皮膚と目への刺激性</td></tr><tr><td>エッペンドルフ セーフロックチューブ、2 ml</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030 120.094</td><td>丸底</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>メルク</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>校正済み使い捨て接種ループ 1 & マイクロ;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>注意:腐食性が高い</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>馬の血液寒天培地(HBA)プレート</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>使用前にRTに持参してください <a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td></tr><tr><td>回転ホイール</td><td>ワイブル・エンジニアリング・デベロップメント・コーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン平底スクリューキャップチューブ、5ml</td><td>テクノプラス</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>針なし60mlシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>ミレックス-GPシリンジフィルターユニット、0.22 以上m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td> 血清<td>型決定の鍵 <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>肺炎球菌因子血清の鍵</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>グループ内の血清型の決定には、 <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a</td></tr><tr><td>>*ほとんどの材料</td><td></td><td></td><td></td>で代替ソースが利用可能です</tr></tbody></table>

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

ラテックス凝集試薬は、微生物の診断、同定、血清型決定に広く使用されています。Streptococcus pneumoniae(肺炎球菌)は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因です。現在のワクチンは肺炎球菌嚢を標的としており、90種類以上の莢膜血清型があります。したがって、肺炎球菌分離株の血清型検査は、ワクチン接種プログラムの影響を評価し、疫学的な目的のために重要です。世界保健機関(WHO)は、血清型肺炎球菌の「ゴールドスタンダード」であるQuelung試験の代替方法として、ラテックス凝集を推奨しています。ラテックス凝集は、比較的簡単で、迅速で安価な方法です。そのため、リソースの乏しい環境や、大量のワークロードを抱えるラボに適しています。ラテックス凝集試薬は、ラテックス粒子に受動的に結合する市販の抗体を利用して、社内で調製できます。この原稿では、ラテックス凝集試薬の製造方法と品質管理方法について説明し、時間と費用対効果の高い逐次試験アプローチについて詳しく説明します。
この生産方法と品質管理方法は、他のテスト目的にも適しているかもしれません。

ラテックス粒子に結合型特異的抗体は、肺炎球菌のカプセルに結合し、抗体標識された粒子の凝集が15に移行する。 図1（a）は、目に見える凝集や背景のクリアすることを特徴とする陽性反応を示す場合に正のラテックス反応が起こるサスペンション。陰性反応は、滑らかで、白色の残りのラテックス凝集試薬懸濁液（図1B）によって特徴付けられる。陽性反応は1分の時間間隔（約20秒、通常の検出可能）の終了前に観察されるべきであるように、試薬が最適化されています。私たちは、1分間の時間間隔の後の​​反応を読むことをお勧めしません。ごくまれに、反応は（データは示していない）背景懸濁液をクリアすることによって伴わないドロップのエッジの周りの弱い凝集を表示したり、背景なしのクリアと「糸」が表示されます。これらは、最もなどである<html> LY否定的な反応。このような場合、私たちは再試験および/ ​​または別の血 ​​清型別法（例えば膨張反応17）を使用してさらに調査することをお勧めします。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> 図1の正および負のラテックス凝集反応。陽性反応（A）または負の反応（B）を示すラテックス凝集試薬と混合肺炎球菌単離物の調製。背景の消去に伴う凝集が.There陰性対照ラテックス試薬または陰性試験反応（B）において目に見える凝集しない陽性反応（A）に見られる。写真8は、許可を得て使用。「ターゲット= &quot;_ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ラテックス凝集試験は、 肺炎連鎖球菌の血清型のための、簡単、迅速かつ安価な方法であり、また広く診断微生物学に適用されている。この原稿は、ラテックス凝集試薬、品質管理手順の内製および肺炎球菌血清型に対するこの技術の応用を説明しています。

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

本手順の目的は、ラテックス粒子に結合した抗血清を用いて、streptococcus pneumoniae分離株の血清型判定を行うことです。肺炎球菌分離株の血清型判定における最初のステップは、陰性コントロールラテックス試薬を用いてテストを行うことです。次に、陽性反応が観察されるまで、ラテックスプール試薬を用いて肺炎球菌分離株をテストします。第3ステップでは、抗原製造業者の判定表を用いて適切な試験試薬を選択し、陽性プールに含まれる群および型を用いて分離株をテストします。最終ステップでは、必要とされるすべての因子ラテックス試薬を用いて分離株をテストし、抗血清製造業者の判定表に従って結果を解釈し、最終的な血清型を決定します。この手法の他の方法（qu testなど）に対する主な利点は、顕微鏡を必要とせず、比較的シンプルかつ迅速に実施できる点にあります。この手順を実演するのは、当研究室のリサーチアシスタントであるBelindaです。まず、2 mLのマイクロ遠心チューブにラベルを貼ります。抗体結合ステップにおいて粒子が沈降するのを防ぐため、ラウンドボトムのものを選んでください。1000 µLピペットを用いて、チューブに975 µLのグリシン緩衝生理食塩水を加えます。次に、調製中のラテックス試薬に必要な肺炎球菌抗血清を25 µL加えます。これを5回反転させて混ぜ合わせた後、120 µLのポリスチレンラテックス粒子を1080 µLの滅菌生理食塩水で希釈します。これを5回反転させて、1000 µLのラテックス懸濁液を1000 µLの抗血清溶液にピペッティングで混ぜ合わせます。さらに5回反転させて混合した後、37 °Cのインキュベーターに移し、低速回転ホイールにセットします。混合物を2時間インキュベートし、その後、粒子を1,100 ×gで15分間遠心分離します。1000 µLピペットを用いて上清を除去します。上清を捨て、ペレットを2 mLの滅菌生理食塩水に再懸濁します。次に、混合物を再度遠心分離し、上清を捨てて、洗浄したペレットを1 mLのグリシン緩衝生理食塩水に再懸濁します。懸濁液を5 mLのスクリューキャップチューブに移し、グリシン緩衝生理食塩液をさらに1 mL加えます。次に、0.2%BSA含有グリシン緩衝生理食塩液を2 mL加えます。その後、10%アジ化ナトリウムを40 µL加えます。保存剤として使用する場合は、必ず物質安全データシート（MSDS）を遵守してください。アジ化ナトリウムを使用する際の安全上の注意事項を確認してください。次に、抗体メーカーのキーを参照し、試薬に対してテストすべき適切な品質管理分離株を決定します。次に、これらの陽性と陰性のコントロール血清型分離株を用いて試薬をテストします。品質管理試験は非常に重要です。この工程により、正しく反応する試薬が作製されたことが確認され、不可欠な管理ステップとなります。品質管理を通過した試薬は4 °Cで保存してください。まず、培養の準備から始めます。滅菌ループを用いて単一のコロニーを選択し、非選択的血液寒天培地プレートの3分の1に接種します。その後、プレートを画線し、単一コロニーを得ます。プレートを37°C、5%二酸化炭素雰囲気下で一晩インキュベートします。翌日、SYPを開始する前に、ラテックス試薬を冷蔵庫から取り出し、室温に戻しておきます。プレートをインキュベーターから取り出します。培養物は純粋であり、増殖がコンフルエントまたはほぼコンフルエントである必要があります。プレートの3分の1以上の領域に、陰性コントロール用ラテックス試薬を数回反転させて滴下します。15 µLを採取し、ラベルを貼った顕微鏡スライドガラス上にピペッティングします。次に、滅菌済みの1 µLループを用いて、ループの中心が約半分になるまで培養液を掃取します。ループ上の内容物を、陰性対照試薬の液滴の近くにゆっくりと塗抹します。ガラス上に接種菌が見えることを確認します。次に、ループを用いて、接種菌をラテックス試薬の液滴に混ぜ合わせます。この際、液滴がスライドガラス上で広がらないように注意してください。スライドの両端を持ち上げ、ゆっくりと前後に揺らします。液体をゆっくりと回転させながら、液滴がスライド全体に広がらないようにしてください。1分間スライドを揺らし続け、その後、結果を判定します。結果は暗い背景に対して赤色に見えます。陰性コントロール試薬の液滴は、凝集やクリアリング（透明化）がなく、変化がないはずです。陰性コントロール試薬で反応が起きないことが確認できたら、陽性反応が得られるまで、各プールラテックス試薬の検査を開始してください。各試薬について、同一の手順を用い、新しい滅菌ループを使用してください。通常、1枚のスライドで3つのプールを検査します。反応を判定する前に、スライドを1分間揺らしてください。ラテックス反応が陽性の場合、ラテックス粒子に付着した特異抗体が肺炎球菌の莢膜に結合し、標識粒子の凝集が起こります。通常、これに伴い背景の懸濁液に一部透明化が見られます。陰性反応では、ラテックス試薬の懸濁液は凝集や透明化を起こさず、滑らかな白色のままとなります。時折、陰性と推定される反応において、背景の懸濁液の清澄化を伴わずに、液滴の縁辺部で弱い凝集が見られることがあります。また、これら2つの曖昧なケースのいずれにおいても、背景の清澄化がなく、粘り気のある外観を呈する陰性推定反応が見られることがあります。再試験を行うか、別の型判定法を試みてください。陽性反応が得られたら、メーカーの判定表を用いて、そのプール混合物に含まれるグループまたは型を特定します。次に、そのプールを構成するグループまたは型を分離株で試験し、陽性反応が観察されるまで継続します。型が特定された場合、それ以上の試験は不要です。ただし、グループが特定された場合は、製造元の判定表を参照して、血清型を特定するためにどの因子の試験が必要かを確認してください。因子の試験結果が判明したら、再度判定表を参照して最終的な血清型を決定します。この簡便で低コストな手法を習得すれば、血清型の判定に使用できます。正しく実施すれば、肺炎球菌の分離は10分で完了します。それでは、この手順を実施します。各テストにおいて、テスト試料や試薬を相互汚染させないよう、常に新しい滅菌済みのループやピペットチップを使用することが重要です。このビデオを視聴することで、肺炎球菌のセロタイプ判定に使用するラテックス試薬の調製および使用方法について十分に理解することができます。

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

レプトスピラタンパク質の表面露出を評価するために効率的な方法が記載されている。方法は、特にレプトスピラ細胞の脆弱な外膜の崩壊を回避するために設計されています。この手法にはいくつかのネガティブコントロールの雇用は、外膜と抗体反応の特異性の整合性を評価する必要があります。...

レプトスピラ表面に露出したタンパク質の免疫蛍光アッセイ

ウイルスの受容体分子を利用して、最近開発された新たな粒子の凝集反応（PA）アッセイは、ポリオウイルス（PV）の迅速かつ容易に識別することができました。この記事では、PVの識別のためのPAのアッセイのための手順が表示されます。...

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

このビデオでは、オプソノバクテリアと免疫細胞との相互作用を調べるためのオプソノアドヒアランスアッセイを実演しています。蛍光標識細菌を抗カプセル抗体を含む試験血清で処理し、マクロファージとインキュベートします。マクロファージを蛍光染色した後、マクロファージ表面に付着した細菌を顕微鏡で観察し、可視化します。...

抗カプセル抗体によるカプセル化細菌のオプソニン化を評価するためのオプソノアドヒアランスアッセイ

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ、キャリッジの自然なモデルとワクチン開発で使用するための潜在的なモデルを提供しています。この技術は貴重まだ複雑で、人間に病原体を導入することにより、臨床的リスクを伴います。私たちは詳細なプロトコルを開発した。...

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

膨張反応は肺炎球菌血清型のためのゴールドスタンダード技術です。この技術は、顕微鏡と、特定の肺炎球菌血清を利用し、一般的に世界的なリファレンス·研究所で使用されています。...

の莢血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;膨張反応を使用して、

の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

この opsonophagocytic 殺害の試金を使用してに対応し、さまざまな治療法や条件に基づいている細菌を殺す免疫細胞の貪食能力を比較します。クラシック、この試金はオプソニンとして細菌に対する抗体のエフェクターの機能を評価するためのゴールド...

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

遺伝的コード拡張は、定義された部位のキャリアタンパク質に対角関数群を持つ非天然アミノ酸の導入に適用される。この二元性機能は、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために、炭水化物抗原の部位選択的結合に対してさらに使用される。...

ワクチン用非天然アミノ酸組み合わせとクリック化学を組み合わせた均質なグリココンジュゲート

ここでは、自然にDNAを獲得する能力を利用して遺伝子改変できる 肺炎球...

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

マイコプラズマ・ニューモニエ感染症では、血清学的検査は良好な結果を生み出すことができますが、免疫学的交差反応のために特異性は低くなります。この論文に記載されている社内抗原捕捉ELISAは、高い種特異性を保証し、肺炎球菌の正確な診断のための信頼できるスクリーニング検査であることが示されています。...

マイコプラズマ・ニューモニエの特異的検出のための抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(英語)

3チャンネルデュアルレポーター蛍光フロー分析システムを使用して、ヨーロッパおよび北米でライムボレリア症を引き起こす異なる ボレリア...

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

学ぶラテックス凝集法によるStreptococcus pneumoniaeの莢膜血清型判定法。簡便で迅速な診断微生物学手法として、試薬調製と品質管理の重要性を理解し、検査室での実装方法を習得する。

の莢膜血清型

さらに動画を探す