リアルタイム神経細胞株に神経毒性および神経保護に関与する分子経路を描写するツールとしてのインピーダンスベースの細胞分析装置

この手順の全体的な目標は、インピーダンスベースの手法を使用して、ニューロン細胞株のリアルタイムの細胞保護を追跡し、保護プロセスにおけるセカンドメッセンジャー経路の関与を明らかにすることです。これは、まず、インピーダンスベースのリアルタイム細胞分析装置で増殖条件下でニューロン細胞株を培養することによって達成されます。2 番目のステップでは、関連性がある可能性があります。

セカンドメッセンジャー経路は、細胞株を神経保護治療にかける前に薬理学的に阻害されます。次に、ニューロン細胞株の状態を、さまざまな実験条件下でリアルタイムセルアナライザーを使用して追跡します。最終的には、統計解析を使用して、ニューロン細胞の細胞保護におけるセカンドメッセンジャー経路のリアルタイムの関与を評価できます。

この手法がエンドポイント神経毒性アッセイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、神経細胞株のTito保護とtito毒性をリアルタイムかつ標識フリー条件下で評価できることです。この方法は、in vitroでの潜在的な神経保護化合物のよりハイスループット評価に貢献し、神経保護に関与する分子メカニズムへの洞察を提供することにより、分子神経生物学分野における迅速な質問に答えるのに役立つ。例えば、ここでは、ヒト神経芽腫S-K-N-S-H細胞をPBSと一緒に使用し、その後、細胞を摂氏37度で5分間トリプシンします。

遠心分離によってトリプシンを除去し、次いで細胞を10ミリリットルの増殖培地に再懸濁する。細胞をカウントした後、細胞をより多くの増殖培地で1ミリリットルあたりの濃度の10倍から5番目の細胞に希釈し、次いでEPL 96の各ウェルを100マイクロリットルの増殖培地と室温で組織培養フードで平衡化する。30分後、EPL 96を二酸化炭素インキュベーター内の37°Cのリアルタイムセルアナライザーステーションに挿入し、リアルタイムセルアナライザーソフトウェアを起動します。

次に、レイアウトページで、実験に適したウェルを選択し、ステップ1がプリセットされるときに、細胞タイプのセル番号と関心のある化合物の名前と濃度をスケジュールソフトウェアページの編集ボックスに入力します。バックグラウンド測定では、 [ステップの追加] を選択し、ステップ 2 を設定して、セル インデックスを 15 分ごとに 96 時間測定します。次に、[開始]をクリックしてステップ1を開始し、メディアのバックグラウンドインピーダンスを測定します。

次に、EPLを取り外し、神経芽腫細胞懸濁液を100マイクロリットル追加します。各実験ウェルにEPL 96を穏やかに渦巻かせてウェルを均一にコーティングし、次にプレートを組織培養フード内で室温でインキュベートして細胞が30分後に落ち着くようにし、EPL 96をリアルタイムセルアナライザーステーションに戻し、ステップ2を開始します。実験全体を通して細胞インデックス値をモニタリングするには、プロットページで細胞曲線を、細胞インデックスページで生細胞インデックスデータを24時間表示します。

細胞をプレーティングした後、実験を一時停止し、リアルタイムセルアナライザーステーションからプレートを取り外します。希釈したばかりの目的の阻害剤を1マイクロリットルずつ各ウェルに分注し、EPL 96を再ロードした後、30分後に実験用細胞指数測定を再開し、実験を再度一時停止し、迅速かつ慎重に増殖培地を各ウェルから取り出し、ピペットチップの端をウェルの角に向け、接着細胞層を破壊しないようにします。次に、直ちに200マイクロリットルの血清欠乏培地を各ウェルに加え、新たに希釈した目的の神経保護化合物1マイクロリットル、および目的のセカンドメッセンジャー経路阻害剤1マイクロリットルを適切なウェルに加える。

次に、データを解析するために以前に設定したように、15分ごとに96時間にわたって細胞インデックス測定を続行し、プロットページで正規化された細胞インデックスと正規化された時間関数を選択して、細胞培養物を変更する前の最後の時点に細胞インデックスを正規化します。実験間のばらつきを減らすため。プロットページで目的の実験条件のウェルを強調表示し、[追加]をクリックして正規化された細胞インデックス曲線をプロットします。

次に、細胞インデックスソフトウェアのページからすべての細胞インデックス時点の実験データをスプレッドシートファイルにエクスポートして、特定の時点における異なる処理条件下での細胞インデックス値の違いを統計的に分析します。エクスポートされたスプレッドシート ファイル内のそれぞれの時点のセル インデックス値を選択します。最後に、分散の1方向または双方向の分析で選択した時点の細胞指数値を分析します。その後、統計ソフトウェアを使用して細胞に神経毒性刺激を統計的に使用して、細胞指数値の低下を招き、ここで細胞指数が増加します。S-K-N-S-H細胞が増殖培地で増殖すると、細胞指数が上昇し、細胞指数の低下とそれに続く新しい低レベルでの安定化が続きます細胞を血清欠乏培地に切り替えることをこれらのグラフに示します。

2つのセロトニン、2つのアゴニスト、5マイクロモル、DOIおよび20マイクロモルIDEの神経保護効果は、細胞に血清欠乏を与えたときに、培地を観察することができる。神経保護研究における重要な問題は、細胞増殖への影響が観察された化合物の生存に寄与するかどうかです。このグラフでは、SKNS細胞の増殖に対する5マイクロモルのDOI処理の効果がないことが示されており、この増殖が観察された神経保護効果に寄与していないことが示唆されています。

この最終グラフでは、ホスファチジル初期3キナーゼ阻害剤LY 2 9 4 0 0 2の10マイクロモルによる治療が細胞生存に及ぼす影響と、血清欠乏SK NSH細胞に対するDOIの神経保護効果を観察できます。LY 2 9 4 0 0 2は、血清欠乏期におけるDOIの神経保護効果を阻害したが、それ自体が毒性作用も示した。このビデオを見れば、リアルタイムセルアナライザーを使用して神経細胞株のCTO保護を追跡する方法と、保護におけるセカンドメッセンジャー経路の関与を明らかにする方法について十分に理解できるはずです。