リアルタイム神経細胞株に神経毒性および神経保護に関与する分子経路を描写するツールとしてのインピーダンスベースの細胞分析装置

本手順の全体的な目的は、インピーダンスベースの手法を用いて神経細胞株の細胞保護をリアルタイムで追跡し、保護過程におけるセカンドメッセンジャー経路の関与を明らかにすることです。これは、まずインピーダンスベースのリアルタイム細胞解析装置を用いて、増殖条件下で神経細胞株を培養することで達成されます。第二のステップでは、関連する可能性のある

神経保護治療を細胞株に施す前に、セカンドメッセンジャー経路を薬理学的に阻害します。次に、異なる実験条件下でリアルタイムセルアナライザーを用いて神経細胞株の状態を追跡します。最終的に、統計解析を用いることで、神経細胞の細胞保護におけるセカンドメッセンジャー経路のリアルタイムな関与を評価できます。

エンドポイント神経毒性アッセイのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、神経細胞株におけるTito保護およびTito毒性を、ラベルフリーの条件下でリアルタイムに評価できることです。この方法は、in vitroでの潜在的な神経保護化合物のよりハイスループットな評価に寄与し、神経保護に関与する分子メカニズムへの知見を提供することで、分子神経生物学分野における迅速な疑問の解決に役立ちます。まず、接着させた神経細胞株の層を洗浄します。例えばここでは、ヒト神経芽細胞腫S-K-N-S-H細胞をPBSで洗浄し、その後、37 °Cで5分間トリプシン処理します。

遠心分離によりトリプシンを除去し、その後、細胞を10 mLの増殖培地で再懸濁します。細胞数をカウントした後、増殖培地を追加して細胞濃度を3 × 10⁵ cells/mLに希釈し、次に組織培養フード内で室温にて、EPL 96の各ウェルに100 µLの増殖培地を分注して平衡化させます。30分後、37 °Cの二酸化炭素インキュベーター内にあるリアルタイムセルアナライザーステーションにEPL 96を挿入し、リアルタイムセルアナライザーソフトウェアを起動します。

次にレイアウトページで、実験に適したウェルを選択し、スケジュールソフトウェアページの編集ボックスに細胞の種類、細胞数、および目的の化学化合物の名称と濃度を入力します（ステップ1はあらかじめ設定されています）。バックグラウンド測定については、「ステップの追加」を選択し、ステップ2を「96時間、15分ごとに細胞指数を測定する」ように設定します。その後、「スタート」をクリックしてステップ1を開始し、培地のバックグラウンドインピーダンスを測定します。

次に、EPLを取り除き、100 µLの神経芽細胞懸濁液を加えます。各実験ウェルについて、EPL 96を静かに揺らしてウェル全体に均一にコーティングし、その後、細胞を沈降させるため、組織培養フード内で室温で30分間インキュベートします。EPL 96をリアルタイム細胞解析装置に戻し、ステップ2を開始してください。実験期間中の細胞指数値をモニタリングするには、プロットページで細胞曲線を確認し、細胞指数ページで24時間の生データを確認してください。

細胞を播種した後、実験を一時停止し、リアルタイム細胞分析装置からプレートを取り出します。各ウェルに、調製したばかりの目的の阻害剤を1 µLずつ分注します。その後、EPL 96を再度セットし、30分後に細胞インデックスの測定を再開します。再び実験を一時停止し、各ウェルから増殖培地を迅速かつ慎重に除去します。この際、接着細胞層を乱さないよう、ピペットチップの先端をウェルの隅に向けて吸引してください。直ちに、各ウェルに血清飢餓培地を200 µL、調製したばかりの目的の神経保護化合物を1 µL、および適切なウェルに目的のセカンドメッセンジャー経路阻害剤を1 µLずつ添加します。

その後、データ解析のために以前に設定した通り、96時間にわたり15分間隔でセルインデックスの測定を継続します。次に、プロットページで「normalized cell index」と「normalized time」関数を選択し、細胞培養への処置を行う直前のタイムポイントを基準としてセルインデックスを正規化します。これにより、実験間のばらつきを低減させます。プロットページで目的の実験条件のウェルをハイライトし、「add」をクリックして正規化セルインデックス曲線をプロットしてください。

次に、特定の時点における異なる処理条件下での細胞指数値の差異を統計的に解析するため、細胞指数ソフトウェアのページからすべての細胞指数タイムポイントの実験データをスプレッドシートファイルにエクスポートします。エクスポートしたスプレッドシートファイル内で、それぞれのタイムポイントにおける細胞指数値を選択します。最後に、統計ソフトを用いて、選択したタイムポイントの細胞指数値を一元または二元分散分析し、続いてポストホックテスト（事後検定）を行います。細胞への神経毒性刺激は細胞指数値の低下をもたらします。ここでは、S-K-N-S-H細胞を増殖培地で培養した際の細胞指数の上昇と、血清欠乏培地に切り替えた後の細胞指数の低下およびその後の新しい低レベルでの安定化が、これらのグラフに示されています。

5 µMのDOIおよび20 µMのIDEという2つのセロトニン2A受容体作動剤を、血清欠乏培地で細胞を培養した際に添加することで、神経保護効果が観察されます。神経保護研究における重要な課題は、細胞増殖への影響が、化合物の添加によって観察された細胞生存率への効果に寄与しているかどうかを確認することです。このグラフでは、5 µMのDOI処理がSKNS細胞の増殖に影響を与えないことが示されており、増殖が観察された神経保護効果に寄与していないことが示唆されます。

この最後のグラフでは、10 µMのホスファチジルイノシトール3キナーゼ阻害剤LY 2 9 4 0 0 2による処理が細胞生存率に及ぼす影響と、血清飢餓状態のSK NSH細胞に対するDOIの神経保護効果を観察することができます。LY 2 9 4 0 0 2は、血清飢餓段階におけるDOIの神経保護効果を抑制しましたが、同時に薬剤自体の毒性も一部に示しました。このビデオを視聴することで、リアルタイム細胞解析装置を用いて神経細胞株におけるCTO保護を追跡する方法と、保護におけるセカンドメッセンジャー経路の関与を明らかにする方法について深く理解できたはずです。