Name: リアルタイム神経細胞株に神経毒性および神経保護に関与する分子経路を描写するツールとしてのインピーダンスベースの細胞分析装置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶインピーダンスベースの細胞分析装置を用いた神経細胞株のリアルタイム細胞保護モニタリング手法。第二メッセンジャー経路の神経保護への関与を薬理学的阻害で解明し、神経毒性評価と新規治療戦略の開発に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

研究で提示された実験に対する財政的支援は、スイス国立科学財団のMarie Heim-Vögtlinプログラムによって提供されました。
リアルタイムセルアナライザーのデータにおける統計的に有意な差をスクリーニングするための一連の修正MATLABプログラムを開発していただいたJohanna Nyffelerさんと、有益な議論をしていただいたYama Abassi博士に感謝します。

の調製<ol><li> 37℃に設定し、組織培養インキュベーター中、5％CO 2で、リアルタイム細胞分析装置のステーションを配置する。無菌条件下で組織培養フード内のすべての細胞培養処理および薬理学的治療を行う。 </li><li>注：培養のための標準的な条件と比較して異なる温度設定を必要とする神経細胞株は、それに応じて調整されるべきである。弱い接着細胞株について、E-プレート96のウェルの底の金微小電極と細胞の相互作用を容易にするために、コーティング剤を使用する。 </li><li>細胞培養治療のための薬理学的化合物の1,000倍ストック溶液（適切な溶媒中の神経保護剤または第二メッセンジャー経路阻害剤 - ジメチルスルホキシドまたは滅菌水）を準備し、-20℃で保管してください。以下の処理は、車両などの溶媒を使用してください。 </li><li>培養ヒト神経芽細胞腫DMEM / F1におけるSK-N-SH細胞約75％の密度に175cm 2の表面を有する細胞培養フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）（増殖培地）を補充した2培地。細胞増殖および細胞毒性に対する応答速度の点で実験との整合性を確認するために、（約10継代の）範囲内の細胞継代数にしてください。低い継代数が好ましい。 </li><li> PBSで付着SK-N-SH細胞層を洗浄し、そして37℃で5分間、0.05％トリプシン-EDTA溶液でトリプシン処理。遠心トリプシンを除去し、5分間170×gで細胞。 10ミリリットルの増殖培地中で細胞を再懸濁。セプター細胞カウンターで細胞を計数し、増殖培地で細胞を希釈して300,000細胞/ mlに細胞数を調整する。 </li></ol> 2めっき及びSK-N-SH細胞の増殖<ol><li> E-プレート96の各ウェルに100μlの増殖培地を追加し、平衡化し、室温で組織培養フード内で30分放置する。 E-PLAを挿入37℃のCO 2インキュベーター内でリアルタイム細胞分析装置局におけるテ96。 </li><li>リアルタイムの細胞分析装置のソフトウェアを起動します。レイアウトページで井戸が実験に含ま選択し、編集ボックスに、細胞型、細胞数、名称および細胞治療のために使用される化学化合物の濃度に関する情報を入力します。 注：このプロトコルの目的のためには、少なくとも4回の反復がそれぞれの治療のために推奨されている。 </li><li>スケジュールソフトウェア]ページでセルインデックスと各ステップのスイープ間の間隔を測定する掃引回数を選択することで、実験に含まれる「手順」を決定する。ステップ1バックグラウンド測定のために予め決められているので、セル·インデックスの96時間、15分ごとに測定し、設定してステップ2」ステップを追加します」を選択します。 注：治療のために、高速な反応速度と効果が期待されている、短い間隔でスイープを設定してください。 </li><li>自動的に所定のステップ1を開始するために[スタート]ボタンをクリックとメディアのバックグラウンドインピーダンスを測定。細胞がウェルに添加されると、この値は自動的に各データポイントでのソフトウェアによって減算される。 </li><li>増殖培地中300,000細胞/ mlの先にステップ1.5で調製した）細胞懸濁液を使用する。細胞毒性/神経保護研究および細胞増殖研究のために15,000細胞/ウェルに良く30,000細胞/。 E-プレートを取り出し、細胞毒性/神経保護研究のためにウェルあたり100μlの細胞懸濁液を追加し、50μlの細胞懸濁液及び細胞増殖研究のために、ウェルあたり50μlの増殖培地を追加します。ウェルあたりの細胞数は経験的に、各細胞株のために最適化される必要がある。 </li><li>静かに、細胞のさえメッキ用のE-プレート96を旋回させる。細胞がウェルの底に均等に落ち着く可能にするために、室温で組織培養フード内で30分間、E-プレート96のままにしておきます。 </li><li>リアルタイムの細胞分析装置ステーションにおいて、E-プレート96を挿入し、[スケジュールp上のステップ2を開始時代。ソフトウェアのセル·インデックス·ページ上でプロットページにあるセルの曲線と生セル·インデックス·データを表示することによって、実験を通してセル·インデックス値を監視します。 </li></ol> 3血清欠乏<ol><li> 24時間細胞をプレーティングした後、実験を一時停止、リアルタイム細胞分析装置ステーションからのE-プレート96を削除します。最終濃度×200に - DMEM / F12無血清培地で1,000倍ストックからセカンドメッセンジャー阻害剤を希釈する。それぞれの経路を阻害するため、細胞毒性を開始する前に、神経毒性/神経保護への関与で30分間、試験される第二メッセンジャー経路1μlの阻害剤で細胞を処理する。ステーションに、E-プレート96を返し、実験細胞指数測定を再開します。 </li><li> 30分後、再び実験を一時停止します。ピペット（またはマルチチャンネルピペット）で、E-プレート96のウェルから完全増殖培地を慎重に除去し、接着細胞層を破壊しないように注意しながらウェルの隅にピペットチップのエッジを導くことができる。 200μl/ウェルの無血清DMEM / F12培地（血清欠乏培地）を追加します。細胞の機械的攪拌を最小限にするために細胞培養培地の迅速な交換を確実。 </li><li>最終濃度×200無血清DMEM / F12培地で1,000倍ストックからそれらの神経保護効果について試験されるべき化合物を希釈する。実験計画に従って各ウェルに彼らの神経保護効果について試験する1μlの化合物および第二メッセンジャー経路1μlの阻害剤を追加します。 </li><li>増殖研究のための細胞では培地を変更しないでください。ウェルあたり1μlの治療および増殖培地で培養を継続し、増殖培地中の最終濃度×200に1,000倍の在庫から、試験する化合物を希釈する。 </li><li>以前に設定した96時間、細胞指数測定と15分ごとに継続して実験を再開します。 </li></ol> 4。データAnalysis <ol><li>神経毒性のために/神経保護データは、「正規化細胞指数」を選択することで、実験間のばらつきを低減し、プロットページの「時間を正規化」するために薬物治療や培地交換前の最後の時点に細胞指数を正常化。 </li><li>興味のある実験条件のためにプロットページで井戸を強調表示し、正規化された細胞指数曲線をプロットする「追加」をクリックする。 、または時間の関数としての正規化されたセル·インデックス·曲線などのセカンドメッセンジャー阻害の神経毒性/神経保護効果の動態を観察します。 </li><li>増殖に対する効果は神経保護/神経毒性作用に関与しているかどうかを評価するために、時間の関数として増殖培地中で試験薬物治療のための細胞指数​​曲線を観察します。 </li><li>結果の統計的評価を開始するために、Excelファイルにセルインデックスソフトウェアのページからすべてのセルインデックス時点の実験情報をエクスポートします<br/&gt;注：統計分析の最初のステップのp値は、ウェルチのt検定を使用して修正されたMATLABプログラムのセットがsemilogarithmicallyプロットした結果、（補助コードファイルとして提供される）時間スケールに対して反転軸を利用している。これらのプログラムは、全体のリアルタイム細胞分析実験の時間経過にわたってp値の検出を可能にするため、より詳細な統計分析のための時間ポイントの選択を支援する。プログラムの詳細については、補足資料を参照してください。 </li><li>特定の時点で異なる処理条件の下で細胞指数値の差の統計学的分析のために、エクスポートされたExcelファイルからの各時点での選択セルのインデックス値。統計ソフトウェアを使用してポストホックテストに続いて、分散の一方向または双方向の分析（ANOVA）を用いて選択された時点におけるセルインデックス値を分析する。 </li></ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
<li>Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBull%2C+S+%22Focus+on+Neurological+Diseases%22">Focus on Neurological Diseases</a>. , Health Protection Agency. (2007).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285-HT%29+induces+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+%28GDNF%29+mRNA+expression+via+the+transactivation+of+fibroblast+growth+factor+receptor+2+%28FGFR2%29+in+rat+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells.</a> J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).</li>
<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

現在のビデオ·記事の出版費用は、「ACEA Biosciences社」が主催した。

現在のプロトコルは、連続してラベルを含まない条件下で神経細胞株における化合物の神経保護/神経毒性作用を評価し、効果に関与するセカンドメッセンジャー経路への洞察を得るために、リアルタイム細胞分析装置の有用性を示す。 細胞毒性及び細胞増殖に対する薬物の効果を研究するためのリアルタイム細胞分析の効用が一般的に認識されていても、唯一のいくつかの研究は、神経関連細胞型においてそれを使用している。ガラントらは 、示されているが、私たちは、以前はそれが神経毒性を評価するために使用できる、ヒト神経芽細胞腫SK-N-SH細胞での5-HT 2A受容体アゴニストの神経保護を監視するリアルタイムの細胞分析装置の有用性を示しているヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞7,10におけるβ-アミロイドペプチド。最近の研究は、リアルタイム細胞分析装置は、測定されつつ確実に増殖および細胞死、細胞ことを示唆しているeuronal細胞株および神経前駆細胞は、一次ニューロンにおける細胞死を評価する上で、その精度は5発作の...

神経細胞死は、多くの脳関連障害1の病態生理学において重要な役割を果たしている。 体外毒性アッセイにおける信頼性と高スループットの利用可能性は、神経毒性のメカニズムにより良い洞察を得るために、薬剤開発の2中の治療候補としての神経保護分子を選択するのに役立つことが重要です。しかし、最も広く速度論的分割を可能としない単一の時点で神経毒性/神経保護を評価するin vitroで神経毒性assays.They で使用するには多くの制限があります。多くの場合、シグナル伝達経路に干渉し、同じ細胞集団においてさらなる研究を制限することができるラベルまたはプローブを使用し、多くの場合、労働集約的であり、多くの場合、機構的洞察を提供しない。本研究では、リアルタイムで及び下神経細胞株における神経毒性および神経保護を決定するために、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置の有用性を実証無標識効果に関与してセカンドメッセンジャー経路の解析を通って下流のメカニズムへの洞察を提供するための条件や。 以前の研究は、細胞毒性、ならびに標準的な技術3,4,5,6と比較して細胞株における細胞増殖への影響を決定するために、リアルタイム細胞分析の妥当性を確認した。例えば、良好な相関が基礎的な増殖条件下で、HeLa細胞における3つの異なる毒性パラダイムの後いくつかの時点で、標準的な細胞生存率WST-1アッセイの読み出し及び細胞指数値の間で観察された。細胞指数の測定によって評価し、標準的に使用されるスルホローダミンB（SRB）アッセイ4時微小管安定化剤パクリタキセル誘発A549およびMDA-MB-231細胞の増殖および細胞毒性に非常に類似した値を示した。不死化海馬ニューロンの神経細胞株では、HT-22細胞指数測定は能力tの検証されたO広く使用3-（4,5 -ジメチルチアゾール2 -イル）2,5 -ジフェニル-ブロミド（MTT）アッセイ5に対する細胞増殖、グルタミン酸細胞毒性および細胞保護作用を検出する。同じ研究において、MTTアッセイの結果とセル·インデックス·測定も汎カスパーゼ阻害剤QVD 5によって成長因子欠乏および細胞毒性の救出後の神経前駆細胞の増殖、細胞毒性を測定する際によく相関していた。バンデタニブ（血管内皮成長因子受容体および上皮成長因子受容体阻害剤）をNIH 3T3細胞に誘導される細胞毒性は、細胞指数値またはニュートラルレッド取り込みアッセイ6で測定し、同様の結果を示した。 私たちは、最近、セロトニン2Aの神経保護効果を評価するために、リアルタイム細胞分析システムを使用した（5-HT 2A）受容体アゴニスト（±）-2,5 -ジメトキシ-4 -ヨードアンフェタミン塩酸塩神経細胞株における（DOI）（ SK-N-SH細胞）およびセコの関与についてスクリーニングNDメッセンジャー経路観察神経保護7上でそれらの化学的阻害の効果をモニタリングを通じて。興味深いことに、5-HT 2A受容体は一般的であり、明確な第二メッセンジャー経路8の両方を活性化することができる（DOIとリスリド、それぞれのような）幻覚やnonhallucinogenic両方アゴニストを持っています。 提示技術の利点は、それが、日の過程で細胞生存に対するリアルタイム情報を収集するために関与するセカンドメッセンジャー経路を描写するために、神経保護の増殖効果の寄与の可能性を評価するために、最適な時間を選択することを可能にすることである同じ細胞集団に対する追加のエンドポイント研究のため。現在のプロトコルでのワークフローの概略図が図1に示されている。

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp;RTCA SPシステムバンドル</td><td>ACEA Biosciences</td><td>No: 00380601030</td><td>RTCA Analyzer、RTCA SPステーション、RTCAコントロールユニットE</td></tr><tr><td>プレート96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>で構成されています No: 05232368001</td><td>細胞を培養するために、RTCA SPステーション</td></tr><tr><td>SK-N-SH細胞</td><td>に挿入されます ATCC (LGC規格とのパートナーシップで)</td><td>HTB-11</td><td>関心のある別の接着性ニューロン細胞株に置き換えることができます</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>増殖を補うが、血清欠乏培地ではない</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>後でEプレートにメッキされる細胞の培養用 96</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 25300-054</td><td>組織培養フラスコで培養した細胞のトリプシン化用</td></tr><tr><td>Scepter 2.0 セルカウンター</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>細胞洗浄用</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-DOI 塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>5-HT2A アゴニスト 細胞培養治療</td></tr>用 <tr><td>LY-294002 塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>PI3-K 阻害剤 細胞培養治療用&nbsp;</td></tr><tr><td>マレイン酸リズリド</td><td>トクリス・バイオサイエンス</td><td>4052</td><td>細胞培養治療のための5-HT2Aアゴニスト活性を持つ化合物</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>LY-294002とマレイン酸リズライドを溶解するため</td></tr></tbody></table>

リアルタイム神経細胞株に神経毒性および神経保護に関与する分子経路を描写するツールとしてのインピーダンスベースの細胞分析装置

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

多くの脳関連障害は、それらの病態生理に関与する神経細胞死を持っている。関連する薬剤や下流経路の神経保護または神経毒性作用を研究するためのin vitroモデルの改善は、神経保護/神経毒性の分子機構への洞察を得ることに役立つだろうと、潜在的に医薬品開発を容易にすることができる。しかし、多くの既存のインビトロ毒性アッセイは、主要な制限があります-ほとんどがいない時間経過や効果の動態を観察することができ、単一の時点での神経毒性および神経保護を評価します。また、リアルタイムで神経保護に関与する下流のシグナル伝達経路に関する情報を収集する機会が非常に重要であろう。現在のプロトコルでは、ラベルフリーかつリアルタイムコンディット下の神経細胞株におけるセロトニン2A（5-HT 2Aの）受容体アゴニストの神経保護効果を決定するために、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置の使用を記載インピーダンス測定を用いてイオン。さらに、本発明者らは、第二メッセンジャー経路の阻害剤は、神経保護効果に関与する下流の分子を記述するために使用できることを実証している。また、細胞増殖への影響が観察された神経保護効果に寄与するかどうかを決定するために、この技術の有用性を説明する。システムは、セルのセンサーとして、ウェルの底面上に金微小電極アレイを交互に含んでE-プレートと呼ばれる特殊なマイクロエレクト​​ロニクスプレートを利用する。インピーダンス読み出しは、接着細胞、細胞生存率、形態、および接着の数によって修正される。細胞指数と呼ばれる無次元パラメータは、電気インピーダンス測定値から導出され、セルの状態を表すために使用される。全体的に、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置は、以上に寄与し、リアルタイム、ラベルフリー神経保護及び神経毒性の評価、および第二のメッセンジャー経路の関与の評価を可能にする治療候補を選択するためのin vitroでの潜在的な神経保護化合物の詳細かつ高スループット評価、。

<html> 血清枯渇は、リアルタイム細胞分析装置で連続的に監視することができる細胞指数値を、減少につながる 細胞への神経毒性刺激が提示された技術と、特定の神経毒性刺激と勉強細胞型に依存するのダイナミクスをリアルタイムで監視することができるセルインデックス値の減少につながる。 図2の増加を示しています細胞SK-N-SH細胞を、プラトー（緑色のライン）に達するまで増殖培地中で増殖させ、指数および細胞指数の低下が欠乏培地（赤線）の血清を細胞に切り替えた後、新たなより低いレベルで安定化させた。この低下は、血清の離脱による細胞接着の変化を表すことができる。 薬物治療の神経保護効果は、リアルタイム細胞分析装置で連続的に監視することができ &quot;&gt;（前処理）前に、添加化合物の神経保護効果を、同時に（同時処置）で、または神経毒性、刺激後（細胞の回復を示唆する）は、こうしてについての情報を提供する、リアルタイム細胞分析装...

改良されたin vitro神経毒性アッセイは、新しい神経保護化合物の同定を助けるでしょう。ニューロン細胞株の細胞毒性と細胞保護を決定し、セカンドメッセンジャー経路の関与を明らかにするためのリアルタイムインピーダンスベースの細胞分析装置の有用性が提示され、神経保護のメカニズムに関する洞察が得られます。

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

本手順の全体的な目的は、インピーダンスベースの手法を用いて神経細胞株の細胞保護をリアルタイムで追跡し、保護過程におけるセカンドメッセンジャー経路の関与を明らかにすることです。これは、まずインピーダンスベースのリアルタイム細胞解析装置を用いて、増殖条件下で神経細胞株を培養することで達成されます。第二のステップでは、関連する可能性のある神経保護治療を細胞株に施す前に、セカンドメッセンジャー経路を薬理学的に阻害します。次に、異なる実験条件下でリアルタイムセルアナライザーを用いて神経細胞株の状態を追跡します。最終的に、統計解析を用いることで、神経細胞の細胞保護におけるセカンドメッセンジャー経路のリアルタイムな関与を評価できます。エンドポイント神経毒性アッセイのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、神経細胞株におけるTito保護およびTito毒性を、ラベルフリーの条件下でリアルタイムに評価できることです。この方法は、in vitroでの潜在的な神経保護化合物のよりハイスループットな評価に寄与し、神経保護に関与する分子メカニズムへの知見を提供することで、分子神経生物学分野における迅速な疑問の解決に役立ちます。まず、接着させた神経細胞株の層を洗浄します。例えばここでは、ヒト神経芽細胞腫S-K-N-S-H細胞をPBSで洗浄し、その後、37 °Cで5分間トリプシン処理します。遠心分離によりトリプシンを除去し、その後、細胞を10 mLの増殖培地で再懸濁します。細胞数をカウントした後、増殖培地を追加して細胞濃度を3 × 10⁵ cells/mLに希釈し、次に組織培養フード内で室温にて、EPL 96の各ウェルに100 µLの増殖培地を分注して平衡化させます。30分後、37 °Cの二酸化炭素インキュベーター内にあるリアルタイムセルアナライザーステーションにEPL 96を挿入し、リアルタイムセルアナライザーソフトウェアを起動します。次にレイアウトページで、実験に適したウェルを選択し、スケジュールソフトウェアページの編集ボックスに細胞の種類、細胞数、および目的の化学化合物の名称と濃度を入力します（ステップ1はあらかじめ設定されています）。バックグラウンド測定については、「ステップの追加」を選択し、ステップ2を「96時間、15分ごとに細胞指数を測定する」ように設定します。その後、「スタート」をクリックしてステップ1を開始し、培地のバックグラウンドインピーダンスを測定します。次に、EPLを取り除き、100 µLの神経芽細胞懸濁液を加えます。各実験ウェルについて、EPL 96を静かに揺らしてウェル全体に均一にコーティングし、その後、細胞を沈降させるため、組織培養フード内で室温で30分間インキュベートします。EPL 96をリアルタイム細胞解析装置に戻し、ステップ2を開始してください。実験期間中の細胞指数値をモニタリングするには、プロットページで細胞曲線を確認し、細胞指数ページで24時間の生データを確認してください。細胞を播種した後、実験を一時停止し、リアルタイム細胞分析装置からプレートを取り出します。各ウェルに、調製したばかりの目的の阻害剤を1 µLずつ分注します。その後、EPL 96を再度セットし、30分後に細胞インデックスの測定を再開します。再び実験を一時停止し、各ウェルから増殖培地を迅速かつ慎重に除去します。この際、接着細胞層を乱さないよう、ピペットチップの先端をウェルの隅に向けて吸引してください。直ちに、各ウェルに血清飢餓培地を200 µL、調製したばかりの目的の神経保護化合物を1 µL、および適切なウェルに目的のセカンドメッセンジャー経路阻害剤を1 µLずつ添加します。その後、データ解析のために以前に設定した通り、96時間にわたり15分間隔でセルインデックスの測定を継続します。次に、プロットページで「normalized cell index」と「normalized time」関数を選択し、細胞培養への処置を行う直前のタイムポイントを基準としてセルインデックスを正規化します。これにより、実験間のばらつきを低減させます。プロットページで目的の実験条件のウェルをハイライトし、「add」をクリックして正規化セルインデックス曲線をプロットしてください。次に、特定の時点における異なる処理条件下での細胞指数値の差異を統計的に解析するため、細胞指数ソフトウェアのページからすべての細胞指数タイムポイントの実験データをスプレッドシートファイルにエクスポートします。エクスポートしたスプレッドシートファイル内で、それぞれのタイムポイントにおける細胞指数値を選択します。最後に、統計ソフトを用いて、選択したタイムポイントの細胞指数値を一元または二元分散分析し、続いてポストホックテスト（事後検定）を行います。細胞への神経毒性刺激は細胞指数値の低下をもたらします。ここでは、S-K-N-S-H細胞を増殖培地で培養した際の細胞指数の上昇と、血清欠乏培地に切り替えた後の細胞指数の低下およびその後の新しい低レベルでの安定化が、これらのグラフに示されています。5 µMのDOIおよび20 µMのIDEという2つのセロトニン2A受容体作動剤を、血清欠乏培地で細胞を培養した際に添加することで、神経保護効果が観察されます。神経保護研究における重要な課題は、細胞増殖への影響が、化合物の添加によって観察された細胞生存率への効果に寄与しているかどうかを確認することです。このグラフでは、5 µMのDOI処理がSKNS細胞の増殖に影響を与えないことが示されており、増殖が観察された神経保護効果に寄与していないことが示唆されます。この最後のグラフでは、10 µMのホスファチジルイノシトール3キナーゼ阻害剤LY 2 9 4 0 0 2による処理が細胞生存率に及ぼす影響と、血清飢餓状態のSK NSH細胞に対するDOIの神経保護効果を観察することができます。LY 2 9 4 0 0 2は、血清飢餓段階におけるDOIの神経保護効果を抑制しましたが、同時に薬剤自体の毒性も一部に示しました。このビデオを視聴することで、リアルタイム細胞解析装置を用いて神経細胞株におけるCTO保護を追跡する方法と、保護におけるセカンドメッセンジャー経路の関与を明らかにする方法について深く理解できたはずです。

real-time-impedance-based-cell-analyzer-as-tool-to-delineate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、細胞インピーダンスアッセイを介して、接着細胞の増殖を含む細胞イベントのリアルタイムモニタリングのプロセスを実演します。ここでは、接着細胞が絶縁体として機能し、電極間の電流の流れを制限し、インピーダンスを増加させます。...

細胞プロセスをリアルタイムでモニタリングするための細胞インピーダンスベースの解析

出典:Mudduluru, G., et.al. インピーダンスに基づくがん細胞の移動と浸潤のリアルタイム測定。J. Vis. Exp.

脳腫瘍細胞浸潤のインピーダンスに基づく測定

このプロトコルは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング、細胞の付着、増殖、運動性、および薬理学的および毒性刺激に対する細胞応答の定量化のための接着細胞のインピーダンススペクトルを記録し、分析する方法を検討します。内皮透過性および細胞 - 細胞および細胞 - 基質接点の評価の検出が強調される。...

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

この原稿は、フィールドポータブル電気細胞-基板インピーダンスセンサーで使用するためのニジマスギル上皮細胞を用いた流体バイオチップの調製方法を説明しています。...

毒性のための飲料水試料の迅速な評価のためのRTgill-W1細胞とのインピーダンスベースの流体バイオチップの製造および試験

ここでは、インピーダンス細胞分光法を利用した血液脳関門のin...

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。様々な治療条件下で癌細胞が移行し、侵入する能力を決定することは、治療戦略を評価する上で極めて重要である。このプロトコルは、神経膠芽腫癌細胞株のリアルタイム転移能力を評価する方法を提示する。...

がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定

侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。...

共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

ここでは、ヒト細胞におけるジカウイルスの感染と複製をリアルタイムで研究するための非常に簡単で簡単な方法として、細胞ベースの電気インピーダンス(CEI)の使用を示します。さらに、CEIアッセイは抗ウイルス化合物の評価に有用である。...

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

ここでは、インピーダンスベースのバイオセンサーであるECISとcellZscopeを使用して、脳内皮バリア強度を測定する手法を示します。脳内皮の in vitro...

がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定

我々は、神経形態を分析するためにコンピュータプログラムを開発しました。つの既存のオープンソースの解析ツールと組み合わせることで、私たちのプログラムは、ショール分析を実行し、神経突起、分岐点、および神経突起の先端の数が決まります。分析は、神経突起の形態で局所的な変化が観察できるように実行されます。...

複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

学ぶインピーダンスベースの細胞分析装置を用いた神経細胞株のリアルタイム細胞保護モニタリング手法。第二メッセンジャー経路の神経保護への関与を薬理学的阻害で解明し、神経毒性評価と新規治療戦略の開発に貢献します。

リアルタイム神経細胞株に神経毒性および神経保護に関与する分子経路を描写するツールとしてのインピーダンスベースの細胞分析装置

さらに動画を探す