行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

この手順の全体的な目標は、行動するミツバチの2つの独立したニューロン処理段階への長期アクセスを使用して、嗅覚コーティングと記憶形成を研究することです。これは、最初に絶縁された銅マイクロワイヤーとカスタムメイドのホルダーから低コストのマルチチャネル電極を組み立てることによって達成されます。次のステップは、頭部のカプセルの一部を取り出して、蛍光色素で処理した2つの電極を露出した脳に挿入して、生きたミツバチを準備することです。

3番目のステップは、花の匂いとフェロモンで刺激しながら、嗅覚経路の2つの独立した神経錠剤または管から記録することです。その後、脳を解剖した後、別の蛍光トレーサーをアンテナローブに注入して、標的ニューロンを埋め戻します。次に、埋め戻されたトラックと電極トレースを視覚化して、ニューロン構造の3次元再構成を作成します。

最終的には、アンテナローブとキノコ本体などの異なる処理レベルでの2つのニューロン集団間の臭気コーティングの関係は、これらの手法を使用してより理解できます。したがって、既存の方法のこの技術の主な利点は、当社のマルチチャネル電極が非常に小さく、組み合わせて使用できるため、固定された後に脳の異なる領域で同時に記録できることです。柔軟なワイヤーにより、行動する動物を数時間安定して呼び出すことができます。

この方法は、動物が環境から生命のOLFファクトリーをどのように受け取り、認識し、最終的に計算するかを理解するなど、神経病理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この二重記録技術は、匂いのコード化と一般的なニューロンネットワークの根底にあるメカニズムについての洞察を提供することができます。また、無脊椎動物や愛情、神経生物学の他のモデル生物にも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、キノコの体の内部葉や垂直葉などの形態学的ランドマークのみを使用してミツバチのニューロンを識別するために多くのトレーニングが必要なため、苦労するでしょう。このプロトコルでは、標準の電極インターフェースボードに適合する電極アダプターを構築します。まず、3本の短い絶縁ワイヤを18ピンコネクタにはんだ付けします。

次に、プレキシガラスプレートをカットし、最も長い辺に沿って浅い溝を挿入します。次に、はんだ付けラグをプレキシガラスプレートにねじ込み、プレートをコネクタの上部に接着します。次に、3本の短いワイヤーを使用してベースをラグに接続します。

次に、ガラスキャピラリーをプレキシガラスプレートの溝に配置します。キャピラリーはスライドしてネジで固定できる必要があります 極小ピンを使用して、ガラスキャピラリーを約5ミリメートル外側に伸ばします。キャピラリーとピンは、電極マイクロワイヤーを支え、安定させるために使用されます。

次に、3本のマイクロワイヤーを配置します。アクセスを容易にするために粘着テープの助けを借りて、ガラスキャピラリーは12ボルトのはんだ付け針接着剤を使用して取り外すことができます。ワイヤーとLMPデンタルワックスは、ワイヤーの最後の3分の1を接着しません。

次に、このマルチチャネルマイクロワイヤアセンブリを電極アダプターに接続します。延長されたガラスキャピラリーをマイクロワイヤーと平行に配置します。このアタッチメントを、重なり合うガラスキャピラリーと細長いピンに沿ってデンタルワックスで固定します。

次に、極小ピンから2〜3センチメートル、電極端から2〜3センチメートル伸びる電極線をトリミングします。次に、キャピラリーを電極アダプターに固定し、ネジを使用してすべてを所定の位置に固定します。摂氏360度で。

ワイヤーの端をラグに対して垂直にはんだ付けします。次に、インピーダンスが1キロヘルツで約300キロオームであることを確認して、十分に強い電気接点があることを確認します。次に、2番目の電極アダプターのチャネルをマスター電極に接続し、基準電極と筋肉電極をマスター電極ベースにはんだ付けします。

最後に、マスター電極をヘッドステージのインターフェースボードに取り付けます。ミツバチを入手した後、2番目の電極を別のアダプターに固定し、1つを氷の上で固定するまで冷やします。次に、頭を露出させてミツバチを標準のプレキシガラスホルダーに固定します。

加熱したデンタルワックスを目の付け根と頭と胸部の接合部に塗布し、頭を固定します。ワックスを使用し続けて、ヘッドカプセルの触角のスケープアイを固定します。前方を向く必要があるフェイゲルにワックスを塗布することは避けてください。

Pro Boisはインピンジメントを受けないようにする必要があります。動けるか確認してください。次に、ヘッドカプセルを剃ってアクセシビリティを向上させます。

次に、ミツバチが消費するすべての30%のショ糖をミツバチに与えます。これにより、良好な調製、生存率、組織の水分が確保されます。次に、マイクロメスを使用して、目の境界線に沿って垂直に、アンテナベースの上で水平にカットします。

O細胞の眼の下で切断を続け、緩んだキューティクルを取り除きます。咽頭下腺は、気管と同様に脇に移動させる必要があります。これにより、電極を挿入するための経路がクリアされます。

参照電極である35ミクロンの銀線を挿入することから始めます。まず、同側の複眼に小さな切り込みを入れます。次に、電極をそれに押し込みます。

次に、外側O細胞眼の下の筋肉投影領域に2本目のワイヤーを挿入します。後で電極の位置を視覚化するには、電極を 0.5 モルの塩化カリウムと 5% Alexa Hydrocyte 4 88 の溶液に 3 分間浸します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、2つの電極を脳に配置します。

キノコ本体のアンテナローブと垂直ローブを特定して、自分の向きを確認します。ここでは、1つの電極が180ミクロンの深さの横方向のアンテナローブ管にあり、もう1つの電極は内側のアンテナローブ管にあります。約300ミクロンの深さで挿入。

2つのコンポーネントを使用して電極を固定することにより、電極の配置を完了します。シリコンが脳の上の空間全体を覆っているため、組織の乾燥も防ぎます。次に、細胞外に記録された信号からユニット活性を抽出するための記録に進みます。

利用可能なスパイクソーティングソフトウェアを使用してください。分化した電極チャネルを使用します。3つの電極チャンネルすべてにテンプレートマッチング技術を同時に適用して、単一のスパイクイベントを説明するさまざまな波形の組み合わせを検出します。

そして最後に、適切なユニット分離のための制御です。記録された3つの微分電極チャネルの単一スパイクイベントに対する主成分分析を使用します。録音後、シリコンと電極をミツバチから慎重に取り外します。

次に、ハチリンガー溶液で脳をすすぎ、腺と気管を取り除きます。次に、マイクロピペットを使用してアンテナローブに注入し、5%マイクロルビーを1モルの酢酸カリウムに溶解します。これにより、葉のトラックに順行性ラベルが提供されます。

ここからは、すべてのステップを最大限暗闇で実行します。再び蜂のリンガーで脳を3回すすぎ、染料を30〜45分間インキュベートします。ミツバチを冷蔵庫で冷やして固定します。

次に、脳を分離します。脳を0.1モルPBS中の4%パラアルデヒドに摂氏4度で一晩固定し、穏やかに攪拌します。これに続いて、脱水とクリアリングのための標準的なプロトコルを マイクロルビートレーサーでアンテナローブ内の投影ニューロンを埋め戻した後、これらのニューロンの投影ビューをZ軸に沿ったオルソスライスから組み立てました。

2つの電極上のAlexa Hydrocyte 4 88色素は、内側アンテナローブトラクトと外側アンテナローブトラクトに挿入されていることを示しています。染色された標的細胞と電極挿入部位の3D再構成を用いて、2つのアンテナローブトラクト軌道の概略図を作成し、2つのアンテナローブトラクトから同時に記録し、異なる匂い濃度のハチを刺激しながら、時間処理を調査しました。活動は、その後の処理段階で評価されました。

アンテナ葉投射ニューロンと外因性ニューロンの母集団ベクトルの主成分分析は、投射ニューロンの臭気が長引いて刺激よりも持続することを示しています。対照的に、外因性ニューロン集団では、臭気オンタイプと臭気オフタイプのみが表されました。したがって、活動を経時的に見ると、右側の外因性ニューロン集団は、投影ニューロン集団が匂い誘発活動を発達させ始める少し前に匂い分離活動を示しています。

臭い刺激は灰色でマークされています。使いこなすと、電極を作るのに約30分かかります。ミツバチの準備と電極の標的領域への挿入は、適切に行われれば、さらに30分で行うことができます。

この手順を試みる際には、すべてのステップを習得するまでに多くの練習と忍耐が必要であることを覚えておくことが重要です。電極線を接続ポイントまで持ち上げ、目的の脳の手の届く範囲から記録する場合は特に注意してください。その開発後、ミツバチの脳の解剖学の確固たる知識が必要でした。

この技術により、神経病理学と昆虫の嗅覚の分野の研究者は、ミツバチの行動におけるさまざまなニューロン経路と脳中枢の活動との間の正確な時間的関係を調査することができました。このビデオを見れば、2つの脳領域と行動するミツバチから同時に記録するためのマルチチャンネルマイクロワイヤ電極の構築方法と使用方法について十分に理解できるはずです。また、記録電極の正確な位置を視覚化できる必要があります。