Name: 行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: 学ぶミツバチの嗅覚処理と記憶形成のための二つの脳領域からの同時細胞外長期記録法。多チャンネル電極を用いて行動中の個体でアンテナ葉とマッシュルームボディから神経活動を記録し、嗅覚コードの神経メカニズムを解明する。

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著者は、電極挿入側のトレースを確立してくださったIsabelle Reus氏、LabViewプログラミングのTobias Rosenbaum氏、データ分析と有益な議論を提供してくださったAnneke Meyer氏に感謝します。電極開発の初期段階での議論と実践的な支援を提供してくれたRandolf Menzelに感謝します。さらに、MS-Bへのポスドク関連のBrian Smithに感謝します。この作業は、ドイツ研究振興協会(DFG、SPP 1392、Ro1177/5-2)からWRへの支援を受けました。

1。電極の構築（図1） <ol><li>商業用多チャンネルアンプシステム1,2,25の電極インターフェースボードに合う電極アダプタの製造。 <ol><li> 18ピンコネクタベースに接着小さなプレキシガラスのプレートを使用してください。 </li><li>プレキシガラス板にネジ止め3の別々のはんだ付けラグへの絶縁電線の3短い断片（ 図1 A1〜A3）とベースを接続します。 </li><li>ガラスキャピラリを簡単に移動することができ、ネジで所定の位置に保持することがここでプレキシプレートに溝（ 図1 B1）を挿入します。 </li><li> minutienピンを使用して5ミリメートル程度ガラスキャピラリーを拡張します。 </li><li>安定化とサポートを保証するminutienピンとガラスキャピラリーに沿って微細電極ワイヤを取り付けます。 </li></ol></li><li>マルチチャンネルマイクロワイヤー生産（Ryuichy岡田32,33から採用） <ol><li>スパン3マイクロワイヤ（ポリウレタンコーティングされた銅線、15それらは互いに隣り合って配置されているような方法（ 図1のB2）中のミクロン直径）。 </li><li> （電極先端）（ 図1、B3）、それらを一緒に接着する部分の配線に沿って低融点歯科用ワックスの薄膜（50°C）を広めるために12 Vのはんだ付けの針を使用してください。このセクションでは、電極アダプタとマイクロワイヤを接続するために後で使用されるように、気が動転数センチ（電極端）のまま。 </li></ol></li><li>マルチチャンネルマイクロワイヤーは、電極アダプタに接続する<ol><li>ホルダーからガラスキャピラリを取り外し、電極先端にminutienピンで固定して下さい。マイクロ電極（Figure1のB3）に平行な位置にそれを持って来る。 </li><li>低融点歯科用ワックスを使用してminutienピンに電極チップを接着し、（小さ ​​な矢印が1 B3図 ）minutienピンからと電極端で2〜3センチ突き出し、先端に微小電極をカット。 </li><li>キャピラリーSLスリップightly裏面電極アダプタに。 （ 図1〜B4）、それを修正するためにネジを使用してください。 </li><li>断熱材（ 図1、B4）の溶融を確実にするために周りに360℃の温度ではんだ付けガンを用いて、はんだ付けラグに3線の緩い端を半田付けします。はんだ付けした後、十分な電気的接触（〜300オーム）があることを確認してください。 </li><li>ヘッドステージの電極インタフェースボードに電極（マスター）の1をマウントし、別々のアダプタの他のマルチチャネル電極（スレーブ）を固定します。マスター電極（ 図1のC1）にスレーブのチャンネルに接続します。さらに、マスター電極ベースを参照するだけでなく、筋肉の電極（図1 C2）を半田付けします。 </li></ol></li></ol> 2。ビー準備（図2） これらの記載された実験では、無脊椎動物の動物であるミツバチ（ ミツバチ ）したがって、使用のための具体的な倫理的な許可を必要としない、使用されています。 <ol><li>他人34,35によって示されるように、朝のハイブの入り口にミツバチ飼料収穫機（Aにミツバチ ） をキャッチします。 </li><li>固定化（5から10分）まで砕いた氷の上でミツバチを冷却し、頭部が露出するようにします（ 図2のA）で、標準的なプレキシグラスホルダーや金属管に1を修正。頭の動きを最小限に抑えるために低融点歯科用ワックス（〜50°C）を使用し、複眼や首の基礎を中心にホルダーに丁寧に頭を固定します。 </li><li>鞭毛に触れることなく頭部カプセル（ 図2のB）にアンテナのSCAPIを固定するために、低融点ワックスを使用してください。アンテナの鞭毛が前方指摘される必要がある。ミツバチが自由に口吻を動かすことができることを確認してください。 </li><li>頭の上に邪魔されずに表示してアクセスを確保するために、頭部カプセルを剃る。 </li><li> saturatiまで、30％スクロース溶液で蜂フィード脳組織と動物のよい実行可能性（ 図2のC）の十分な湿潤を確保するために。 </li><li>垂直方向、水平方向複眼と触角拠点上だけでなく、単眼の下の境界線に沿って慎重に切開を行い、キューティクルの緩み個（ 図2 D）を外します。 </li><li>丁寧に下咽頭腺を取っておくと、クリアな視界と挿入（ 図2E、2F）を電極に前脳へのアクセスを確保するため気管を削除します。 </li></ol> 3。電極の挿入 図2に示す例の場合、一方の電極は、L-ALTは、m-ALT 2に照準他方を目指して配置されている。特定のランドマークを使用して、他の標的領域は、例えばALおよびMB出力領域1について、同様に可能である。 <ol><li> （関心のある領域にマイクロマニピュレータを使用して電極を配置する<stroNG&gt;図2Gおよび3A）。 M-頭の中の場所を内側MBの垂直葉からALとの間の電極を対象とする。内外側頭の中のPNの分岐点より上に挿入部位を確認してください。約180ミクロン（ 図2E）の深さに脳内に電極を突出している。電極垂直ローブと、ALの真ん中の側面との間に仮想線の中央に横方向の大脳（LH）は、以下のL-ALTのPN記録場所のため。約300μm（ 図2E）の深さに電極を挿入します</li><li>キューティクルの小さなカットを通じて同複眼に参照（銀線、約25μm径）を挿入します。横単眼下の筋肉の投影領域内に別の銀線を挿入します。注：必要に応じて、ハチの学習動作は、私が関与している筋肉のM17を、記録することにより、高い時間精度で監視することができます25で説明したようにハチ36の口吻拡張応答（PER）をn個。 </li><li>しっかりと脳と頭部カプセル内の電極を固定するため、乾燥から脳を防ぐことができます2成分のシリコン（ 図2H）で脳上記空間全体をカバーしています。注：録音は日 ​​まで時間持続することができ、ミツバチは、たとえば古典的条件付け手順（ 図2H）の間に記録され、異なる匂いの大きなパネルで刺激することができます。 </li></ol> 4。データ収集と前処理<ol><li>次の要件を満たす適切な収集ソフトウェアを使用します。分25 kHzでサンプリングレートを;アナログ1,25または電極チャンネル間のデジタル2クロス分化;バンドは、スパイクイベントを抽出するために、8000 Hzまで300Hzのからフィルタを通す。 </li><li> TEMPL例えば、単一のユニット活動を抽出するために使用可能なスパイクソーティングソフトウェアを使用Spike2ソフトウェア（ 図3）に含まれるマッチング技術を食べた。 </li><li>さらなる分析のために（ 図4）または主成分分析（PCA）のための集団ベクトルを算出する（ 図5）は、市販のソフトウェアを用いて臭気応答を平均し、単一のユニットを計算するために、抽出された単位のタイムスタンプを使用する。さらに、単一のユニットと人口応答待ち時間を分析するために、最近の出版物1,2,25を比較してください。 </li></ol> 5。相対電極位置の可視化（図4） <ol><li> 5％のいずれかの溶液に電極チップを浸しアレクサは、Alexaの記録前実験と0.5 M塩化カリウム溶液に溶解させた488ヒドラジド568または5％ヒドラジド。 </li><li>実験の後、慎重に電極と覆うシリコンを外し、蜂リンゲル液で脳をすすぎ、腺や気管を取り外し、tetramethylrhodamiの小さな結晶を挿入するNデキストランまたは順行のALTにラベルを付けるために、ALに1.0Mの酢酸カリウムで解決5％溶液を挿入します。暗闇の中で次の手順を実行します。 </li><li>色素が取り込まれ、別の30〜45分間蜂リンゲル液で3回脳を洗浄する前に、その軸索管（30〜45分）（ 図4A）に沿って投射ニューロンにより輸送することができます。 </li><li>固定化するまで氷上に蜂を冷却し、慎重に頭部カプセルから脳を削除します。 4％ホルムアルデヒドを含む0.1 M PBS溶液中ですすぐことによって脳を固定し、4℃で一晩それを維持</li><li> 0.1のPBS（10分ごと）に脳を2回洗浄する前に、少なくとも12時間待ってください。 </li><li> （昇順アルコールシリーズで脱水する前に、トリトンX-100 0.1 M PBSで希釈した0.2％、30％、50％、70％、90％、95％、3×100％エタノール、20分間、20分間、脳の3回洗う各ステップ）。 </li><li>顕微鏡スライドとSにサリチル酸メチルで脱水脳を埋め込むカバースライドでそれをEAL。 </li><li>共焦点レーザー走査顕微鏡を使用し、高調波複合プランアポクロマート対物レンズ（10×0.4 NA液浸）を使用して、すべての2-5ミクロンの光学セクションとしての脳をスキャンします。 tetramethylrhodaminデキストランおよび電極位置のために488nmの波長に対して568 nmの波長を用いて組織を励起。 </li><li>再構築ソフトウェアで3Dで画像スタックから染色された脳構造と電極の経路を再構築する（ 例えば 。AMIRAやフィジー）（ 図4）。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

この記事では、カスタム設計されたマルチチャンネルマイクロワイヤ電極の製造および使用方法を示しています。記載された電極は、単一のユニットと（詳細は1,2,25を参照）、単一の試料内での待ち時間の測定値と異なるニューロンと異なるneuropilsの他の時間応答特性のために特に便利です人口活性の両方を記録するのに適している。さらに我々は永久に日まで時間持続ミツバチの振る舞い​​に、安定した長期的な録音を可能にするために、マイクロワイヤ電極を実装する方法が示されている。 細胞外のマルチユニット記録は、空間情報と組み合わせ、高い時間分解能を達成するための有利なツールとなりました。我々の場合において、これらの神経路は、平行又は2つの異なるneuropils 1のいずれかである。複数のニューロンが並列に単一ニューロンレベルで、高時間分解能で記録し、分析することができる。マルチユニット記録41 -イングスは、最初の昆虫39に、後に哺乳類38で適用された。実質的な進展は、細胞外多チャンネル記録技術42,43の開発·改良を達成した。これは、例えば、新たな電極44または新規のスパイク45を選別し、クラスタリングアルゴリズムの開発を含む。 48 -細胞外多単位記録技術の一般的な方法は、46に記載されている。この動画に示される自己内蔵の電極は、さらに、電極あたりのマイクロワイヤを追加することによって適合させることができる、マイクロワイヤは、先端の間の測定可能な一定の距離を得るためにねじられ得る。両方の手順は、しかし、柔軟性が低下し、電極の厚さの増加につながる。 一般的にスズメガ、イナゴやゴキブリ40,49のようなはるかに大きな昆虫細胞外記録用に使用されるシリコンプローブに比べて- </商標&gt; 51記載のマイクロワイヤ電極は、可撓性小さく、潜在的な脳の動きに容易に対応でき、従って、確実にはるかに広い行動レパートリーを示すミツバチやアリのような小さな社会性昆虫で使用することができる。記載されたマイクロワイヤは、ラウンド柔軟で小さく、目標は長く勉強している場合は明らかな利点で、周囲の組織への、したがって害が少ないながら、ほとんどのシリコンプローブは、その挿通チャンネルに沿って軸索と神経組織を切断する構造のような鋭いシャンクを持っている無傷で行動する動物での短期可塑性。マイクロワイヤ電極の別の利点は、その低コスト製造及び取り扱いが容易である。代わりに、慎重に高価なシリコーンプローブを洗浄の電極線を新たに、したがって、輻輳の欠如の問題を前に、脳への挿入および切断される。さらに、それはどちらか異なるneuropiles 1○内に挿入同じ製剤内の複数のマイクロワイヤ電極を使用することが可能であるRトラクト2我々はここに示したよう。このアプローチは、異なる神経処理レベルでの応答潜時との相互作用のような時間的な側面を分析し、比較することが特に有利である。 我々は細胞外記録された信号は、 それ自体が一つの細胞活性を反映していないという事実を認識しています。それは、常に電極チップの周りの電圧活性の化合物である。信号源を特定するために、一方の電極内で隣接する二つのマイクロワイヤーチャネルの差が常に計算されます。このように単一ユニット活動を抽出するために使用されるスパイク信号のソースは、常に1つまたは容易に識別可能なスパイク波形が得られる他の電極チャネルのいずれかに非常に近かった。遠くからの信号は、近隣neuropilsの筋活動や活動のように、比較可能な形や振幅を想起させると同時に、両方の電極に到達し、この手順によって破棄されます。 Spike2のテンプレートマッチング技術を用いて、私たちは同じではありません、単一のユニット活動を得るために非常に自信を持って、単一ニューロン活動に非​​常に近い。しかし、スパイクソーティングの問題は、細胞内記録技術を用いることによって回避することができる。 鋭い電極やパッチピペットのいずれかでの単一細胞記録は、単一のニューロンの生理学的特性についての徹底的な知識を許す。しかし、昆虫の神経細胞とその神経突起の小さなサイズ（ 例えば 。ミツバチのために、1μm未満のPN 52）のみ短期録音を管理可能である。さらに、内細胞の録音は侵襲的かもしれませんし、場合によっては時間的な制限のためのもう一つの理由である細胞に害を与える可能性があります。昆虫におけるin vivo細胞内記録はほとんど1時間を長持ちしない。シングルに識別ニューロン、腹側の不対maxilarニューロン＃1（VUMmx1）からの細胞内記録マーティンハンマー53の先駆的な仕事のために十分であった時間ウィンドウ。彼はLでし報酬経路に直接インクをその活性を。アーネMauelshagen 54が細胞内に特定されキノコ体の外因性ニューロンの活性を登録して、古典的条件の間に茎外因性ニューロン＃1（PE1）。彼らはケニヨン細胞の電気刺激後にLTPを見つけたとき、同じニューロンはメンツェルとマンツ55の焦点が合っていた。しかし、岡田ら56は、細胞外記録中のPE1の識別のために、細胞内で十分に特徴付けられたスパイクパターン（ダブル、トリプルスパイク）を使用することができます。両方の方法の全てを組み合わせた後、特定されたニューロンおよび細胞外の長期的な記録から細胞内記録は、将来の調査のための強力なツールになるかもしれません。 しかし、私は彼らの時間応答の関係を分析するために日までに何時間かけて異なる処理レベルで同時に複数のセル（単位）を記録するために鋭利な電極を使用して、および/あるいはプラスチックの変更ほとんど不可能だ。 62 -最初のカルシウムイメージングは、カルシウム感受性色素を用いたミツバチ57,58に近付くと匂い応答の空間パターンの分析は、59アクセス可能だった。しかしながら、多くの場合、カルシウム感受性色素は、再度ハチの寿命と分析された細胞の固有の特性を制限侵襲的な操作を介して脳組織に導入しなければならない。この問題は、遺伝的に導入されたカルシウムセンサー63,64を使用してショウジョウバエのような他のモデル生物で克服される。それらはおそらく匂い応答の時間的な特性に影響を与えるカルシウムバッファとして作用することができるように、しかし、一般的に、カルシウムセンサは、他の制限を導入することができる。カルシウムイメージングまたは計算の手法と組み合わせて同時細胞内記録は、画像の適切な時間分解能が65,66を処理することを証明することができます。しかし、画像処理自体の時間分解能は、早咲きのですR限られた。 2光子イメージングは、より高速なシーケンス68を取得することができるかもしれませんが、光収集システムは、通常は、5月20日Hzの67の時間分解能で、CCDイメージングを使用しています。しかし、増加のサンプリングレートは常に空間分解能の損失と一緒に行く。さらにミツバチで使用されるカルシウム感受性染料も取得時間69を減少させ、漂白を受ける。 昆虫における他の生理学的記録技術と比較して、当社の柔軟なマルチチャンネルマイクロワイヤ電極は、単一のユニットと蜂を振る舞うの人口神経活動への長時間アクセスを確保。 我々は、異なる記録部位間の時間的符号化態様の分析を容易に同じ動物において、異なる処理段階で、これらの2つの電極を使用する方法を実証した。ここで示す電極の建物の基本的な方法昆虫研究課題とモデルに依存して、簡単に拡張されているできるおよび/または適合させることができる。例えば、それはマルチチャネル電極を製造するために3つの単一ワイヤよりも多くを使用することが考えられる。また、記録部位の数は拡張され、二つ以上の管またはneuropilsの時間的局面を観察することが可能であることができる。私たちの願いは、この方法は多くの科学者を鼓舞し、小さな脳で洗練された神経細胞の処理の理解に積極的に貢献することである。

ミツバチだけでなく、他のほとんどの昆虫は重く嗅覚に依存しています。とりわけ彼らは向き、交尾、同種との通信、および採餌のための嗅覚を使用しています。そのほかには、嗅覚系を精緻フローラルの匂い刺激に関連した行動を学習するの豊かなレパートリーに貢献しています。 （5 -口コミ3を参照）これらの動作は容易に制御された実験条件下で研究することができる。彼らの&quot;ミニ頭脳」（cp. 6）神経細胞の比較的小さな数字でミツバチ神経活動の監視中に嗅覚コーディングや学習を研究するのに適したモデル生物になります。 昆虫だけでなく、哺乳動物の嗅覚系は、（レビューのために7,8を参照）を大幅に類似の組織を示している。ミツバチにアンテナ10,11に沿ってsensillaeに位置し約80,000受容ニューロン9は neurに環境匂い刺激を翻訳onal信号。嗅覚受容ニューロンからの軸索は、脊椎動物の嗅球に匹敵する糸球体の組織を持っている触角葉（Al）を、支配する。 ALは、約4,000局所介在ニューロン（LN） ​​によって相互に接続約164の糸球体を含む（総説については12を参照されたい）。特にミツバチでは、LNSは斑状の横方向の接続を提供し、異なる部分集団は、元素及びconfigural嗅覚符号13,14性質を有することがことが最近示された。 ALは、内側と外側触角葉管（m-及びL-ALTを生じさせる腹と背側半葉に細分さ​​れることが示された。以前はm-および内側 - と横触角葉のprotocerebral用L-APTと呼ばれる管内15から17）。ここでは昆虫の脳の統一命名法のための最近の努力によって導入された新しい道の専門用語は、18を使用します。両方のALTは（L-およびM-ALT）410（L-ALT）、または510（M-ALT）uniglomerular projeいずれかを組み合わせてctionニューロン（PN）、それぞれ15,16,19。両方の管のPNには、最近（レビューのために17,20参照 ）、平行2のコードの臭いに示されており、両方の管は、シナプスケニヨン細胞（KC）、キノコ体（MB）は、プリンシパルニューロンと発散接続を形成する。 23 -各MBは約172,000 KCの21が含まれています。 MBは、刺激の統合、学習、および記憶形成に関与することが知られている。のVerticaまたはα-ローブと水平またはベータローブ22,24：KCののAXOの樹状突起は、主に2つの出力領域を有し、花柄（キノコの茎）を形成する。 MBの出力は、約400外因性ニューロン（JA）24に収束する。嗅覚の情報処理を担当するが、ほとんど垂直のローブ22の腹側面を支配するENS。最近では、この領域に記録されたENには、臭気報酬の関連付け25をコードすることが示されている。 としての時間的29 -昆虫だけでなく、脊椎動物の嗅覚系内pectsは、潜在的なコーディングの原則26のような重要かつ重要な側面となっている。同時に、高時間分解能での異なるサイトから複数のニューロンを記録することができるために、我々は蜂の嗅覚系で異なる標的領域に導入され、カスタマイズされたマルチチャンネルワイヤ電極を用いた二重マルチユニット記録技術を確立しました。このアプローチは、単一のニューロンと、パラレル嗅覚経路、デュアル嗅覚経路2または別のその後のneuropils 1間の神経細胞の集団のレベルでミツバチの嗅覚系で時間的処理を分析し、比較することを可能にします。最近、電極の異なる構成を使用して、ローカスト嗅覚系30で同様の実験的なアプローチを背景不変の臭気認識31のための時空間コード化メカニズムを解析することができました。目当方、確立されたデュアル録音が同時に神経活動プロファイルに関する空間情報を収集できます。 カルシウムイメージングから得た広い空間サンプリングに比べてこの方法は、2スポットから録音することができます。しかしながら、カルシウムイメージング技術と比較して利点は、従来のCCD撮像又は2光子イメージング取得のいずれかによって提供することができない活動電位の記録の高い時間精度である。ここで説明する細胞外電極は、恒久的に移植された電極のドリフトを回避し、脳や頭部カプセルと比較して固定されている。これはシャープな細胞内の電極の使用量に比べて明らかな利点である。細胞内記録とカルシウムイメージングと比較したもう一つの利点は、何時間から日までの範囲の拡張、神経観測時間である。これは、学習と記憶形成の神経相関を調査するための重要な前提条件である。マルチのその他の利点単位記録はさらなる議論の項に概説されています。 この方法論の概要では、カスタム設計ワイヤ電極の製造手順は、32,33とミツバチの脳内の長期的なマルチユニットレコーディングに適してから適応、表示されます。さらに、これらのタイプの電極が永久的に多くの刺激プロトコルを可能にするために長期間にわたって同時にL-及びm-ALTを記録するためにミツバチ嗅覚系内の2つの異なる記録部位に注入する方法の一例が示されている2。記録位置の確認のために記録部位の染色後の記録可視化のための例とプロトコルを提供する。

<table><tbody><tr><td>パラフィンオイル</td><td>フルーカ</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>臭気</td><td>シグマ アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>4% ホルムアルデヒド</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>メタノールフリー</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>BioChemica</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>サリチル酸メチル</td><td>Roth</td><td>4529.1</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン デキストラン、10,000 MW (Microruby)</td><td>Invitrogen</td><td>D7162</td><td>キー ダーク</td></tr><tr><td>アレクサ 488 ヒドラジド</td><td>Invitrogen</td><td>A-10436</td><td>キープ</td></tr><tr><td>ダーク アレクサ 568 ヒドラジド</td><td>Invitrogen</td><td>A-10437</td><td>キープ ダーク</td></tr><tr><td>ビー リンガー ソリューション</td><td>See Brill et al.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリウレタン被覆銅線</td><td>エレクトリゾーラ</td><td>15 & マイクロ;m径&P155断熱材</td><td></td></tr><tr><td>デンタルワックス&nbsp;</td><td>デンスプライデトレイ</td><td>64103015S1</td><td>中程度の融点</td></tr><tr><td>歯科用ワックス</td><td>フレキサポナール&nbsp;</td><td>124-202-00</td><td>低融解ワックス</td></tr><tr><td>KWIK SIl</td><td>WPI</td><td>03L</td><td></td></tr><tr><td>18ピンソケット</td><td>コンラッドエレクトロニック</td><td>189634-62</td><td></td></tr><tr><td>ホットメルト接着剤</td><td>コンラッドエレクトロニック</td><td>827673</td><td></td></tr><tr><td>はんだ付け針</td><td>コンラッドエレクトロニクス</td><td>830283</td><td>12V</td></tr><tr><td>はんだ付け端子ラグ&nbsp;</td><td>Conrad Electronic</td><td>531901</td><td></td></tr><tr><td>Glaselectrodes</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>V2A 0.2 x 12 mm</td></tr><tr><td>Switchable Headstage</td><td>Tucer Davis Technologies</td><td>SH16</td><td></td></tr><tr><td>Headstage connection module</td><td>NPI</td><td>INT-03M</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Module</td><td>NPI</td><td>PDA-2F</td><td></td></tr><tr><td>データ集録ボード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI-6123, Ni-6143</td><td></td></tr><tr><td>集録ソフトウェア</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>ラボビュー 8.2</td><td>カスタムデザイン</td></tr><tr><td>スパイクソーティング&nbsp;</td><td>CED&nbsp;</td><td>Spike 2 v7.11</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2008B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Leitz</td><td></td><td>マニュアル</td></tr><tr><td>AGワイヤー</td><td>WPI</td><td>AGT05100</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>Leica</td><td>TCS SP2 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>AMIRA</td><td>Mercury Computer Systems&nbsp;</td>2000<td></td><td>/02/05</td></tr></tbody></table>

行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

哺乳類や昆虫の両方における神経情報が異なる上位と下位の脳センターで処理されます。これらのセンターは、収束し、フィードフォワードおよびフィードバック配線を含む発散解剖学的な接続を介して接続されている。さらに、同じ起源の情報が部分的に異なる、時には同じ脳の領域へと並列経路を介して送信されます。これらの配線戦略、特にお互いに自分の時間的依存関係の進化の恩恵だけでなく、計算上の利点を理解するためには、高い時間分解能で同じ準備で別の管またはneuropilesの単一ニューロンへの同時アクセスを持っていることが必要である。ここでは、2以降のneuropiles 1、触角葉（AL）は、まず嗅覚処理段階とキノコ体（MB）、高次の統合センターINVOでマルチユニット活動を記録するためにユニークな細胞外の長期的なアクセスを実証することによってミツバチに集中学習および記憶形成、又はMBとALを接続する2つの平行な神経管2にLVED。後者の例として選択した、完全に説明される。支持ビデオフレキシブルマルチチャンネルワイヤ電極の構成と永久挿入が実証される。マイクロワイヤ電極チャネルの対の差動増幅を大幅にノイズを低減し、信号源は、電極先端の位置と密接に関連していることを検証する。使用するワイヤ電極の機械的柔軟性は、従来の余分およびin vivo記録技術における細胞内に比べて明らかな利点である、日まで多くの時間にわたって安定した侵略的な長期的な録音を可能にする。

「この議定書は、個々のミツバチ内の2つの異なる処理段階での同時録画を可能にし、さらに例えば経由で学習と記憶の基本的なメカニズムをテストすることができます。、拘束されたミツバチの中エアコンPER。 &quot;これは、神経処理の時間的な側面を分析するための前提条件である。この方法は、蜂の嗅覚系の神経回路網を解明するために、異なる科学的アプローチのために容易に適応可能である。例えば、この方法は、ミツバチのデュアル嗅覚経路、L-及びm-ALTのPN（ 図5）内のPNの一時的な処理を分析するために（i）が使用される。 図5Aに同時にM-ALTのPNで記録されたL-ALT PNの1例は10トライアル平均として与えられ、カラーコード化された熱プロットとして5異なる臭気濃度の点での応答の強さと待ち時間を示している。 11リットルと13ミリアンペアと7ミツバチの平均LTのPN（ 図5B、5C）は 、応答の強度並びに反応潜時の両方が、ある程度まで、付臭剤濃度を反映していることを示している。増加の付臭剤濃度との反応潜時は（ 図5B、5C）が減少しつつ、この例でのPNは、その応答の強さを増加させる。この結果は、かなり限られ、分析匂い物質に対してのみ有効ですが、それでも、AL 37の最近の計算モデルと一致している。ハチのALにおける臭気濃度符号化は非線形計算の基礎となる符号化または他の特性は依然として将来的に分析する必要が根底にあるかどうか。さらに、この方法は、（ii）の二つの連続処理段階、およびAL-MB-出力（ 図6）で集団活動に時間的な側面を比較するために使用することができる。主成分分析（PCA）は、臭気計算が長くなることを示しており、一方、ENにおけるPNレベルでの全体の臭気プレゼンテーションを長持ちセットのオンとオフだけ臭気は人口活性（ 図6）で表されていましたね。 PNの活動はまだ（cp. 動画1）を開発したとき、それによって、EN人口はの時点ですでに最大活性に達した。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> 。。。図1 3チャンネルのマイクロワイヤ電極の製造A1）は、3つのワイヤの末端が位置11、13及び16におけるICピンコネクタに半田付けされているA2）フォーはんだラグは、プレキシガラス、プラスチック基板にねじ止めされ; minutienピンは、その後、プラスチック板に取り付けられたガラスキャピラリの先端に挿入される。A3）は、プラスチック板をICピンコネクタの上面に接着され、各ワイヤの自由端が上部はんだ付けの一方にはんだ付けされているラグ。 &lt;細い銅線を電極ホルダを装備する強い&gt; B1）は、毛細血管をもう一度取り出すことがあります。B2）ホルダーのベースは、カスタムで修正されているデバイスを揃えるた。三つ銅マイクロワイヤは、B3）平行マイクロワイヤは、歯科用ワックスと一緒に接着されており、キャピラリ場所（長い矢印）に戻され、各端部で溝に沿って整列し、粘着テープで固定されている; （短い矢印）が接着されたマイクロワイヤは、次いで、歯科用ワックスと毛細管に取り付けられ、その端部が切断される。B4）銅線の三緩い端部はと電気的に接触させること、従って3つのトップはんだラグに半田付けされているICピンコネクタC1）二つの完全に組み立てられた電極は、単一のヘッドステージで使用するために相互に接続することができる。C2）は、この目的のために、一方の電極（左、スレーブ）のピンは、右（他方の電極に絶縁電線を介して接続されているマスト）小胞体、ヘッドステージに接続されており;ヘッドステージ接続される電極はまた、筋肉（M17）および基準電極（参照）からの入力を収集することができる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。準備とハチの脳内への永久電極挿入。A）蜂氷上で固定化後プレキシグラスホルダーに挿入されている。鞭毛（FL）とScapus（SC）とのアンテナ示されています。B）の頭や触角が歯科用ワックスを使用して固定されている。C）頭部カプセルを剃毛し、ハチは砂糖水が供給される。D）頭部カプセルを開いた。 E）は、脳の上部から腺および気管を除去した後、異なるneuropilesおよび主要なランドマークを容易に区別することができる。のALTの軌道は一緒に示されている電極が挿入されているマーク。 （MB：キノコ体、他：触角葉、OL：光葉、α：アルファローブまたは垂直葉、ALT：触角葉管、E1：M-頭の中の録音のための電極挿入側、E2：L-ALTのための電極挿入側録音）。F）リファレンス（REF）と筋肉の電極（M17）がキューティクルや複眼に少し穴に頭部カプセルに挿入されます。G）のワイヤ電極を適切な場所で脳内に挿入されます。H）した後、二成分シリコンを用いた所定の位置に電極を固定し、ミツバチが依然としてPERを示している（ 例えば 、砂糖水を使用して）調整することができる。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> 2神経管と単一のユニット抽出（スパイクソーティング）。Aの図3。細胞外記録 </str実験装置のオング&gt;）模式図。ハチは、プレキシグラスホルダーに固定されている。匂い刺激は、ガラス管を介して提供される。二つの電極シャンクが露出蜂の脳から記録している。B）の濃度で水溶液中の蜂蜜の500ミリ匂い刺激に両方の管に興奮応答を示すL-およびm-ALTのPN（緑と紫のトレース）からの同時録音33℃での1:100スパイクは、単一活動電位がソートされ、色分けされている手順をソートした後）50μVC：それぞれがAのバー内の電極のはんだ付けラグから色分けされたラベルと区別チャンネルを表す線をプロットした。ソートされたユニットのオーバーレイは波形の分離を示しています。D）のスパイク間隔ヒストグラムは、適切なスパイクソーティングの証としてソートユニットの分離品質を示しています。ユニットの耐火期間内にスパイクが存在しないことに注意してください。E）に 2つのビュー（E1、E2）から互いにソート単位の距離を示している主成分分析とソート部の3次元クラスタリング。円はカラーコード化されたユニットが1管内記録から3チャンネルの倍率で見える活動電位を示している）空間で、SDに似ており、主成分空間Fのクラスタの重要な差別化を示し、2.5倍マハラノビス距離を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。記録後の可視化と記録位置の3次元再構成。前外側の最大強度の位置合わせで、Z軸に沿ってオルソスライスのA）の投影図とMBおよびLHに対するAlから突出uniglomerular投射ニューロンの逆行埋め戻し。細胞内のトレーサーMicroruby（tetramethylrhodaminデキストラン）を記録実験の後、ALに挿入した。アレクサとの2つの電極の染色から最大強度の位置合わせで、Z軸に沿ったオルトスライスのAL証明適切PN染色。B）は投影図の内部ステンド糸球体は、M-ALT（E1、矢印の電極配置を示す488ヒドラジド）およびl-ALT（E2、矢印）。トレーサーアレクサヒドラジド488は、周囲の組織電極に移動し、電極挿入部位を染色する。注、アラバマ州の著名な染色は表面的な加工品である。C）染色された標的細胞の3次元再構成（PNS）と、A、B（右側から電極挿入部位）を一緒にミツバチの嗅覚システムの概略図と（左L-およびm-ALT軌跡の表示のある側）。唯一uniglomer、注意してくださいウラルのPN管が示されている。 ：触角神経、他：触角葉、LH：横ホーン、MB：キノコ体、E1、E2：電極挿入部位、M-ALT：内側触角葉管、L-ALT：横触角葉管、C：尾、 R：吻側、M：中間、L：横<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> 図5。デュアル嗅覚経路内の臭気濃度符号化の例。A）熱プロットは、単一のL-ALT（緑）の応答を示しており、単一のM-ALT PN（紫）は匂い物質に反応して、個々のミツバチから同時に取得臭気濃度の増加にヘキサナール（1から1:100まで10 -6）。各行は10トライアルSTIMの平均であるulation。発火率は差し引か自発的活動に関連して発火率である相対強度の変化として示されている。B）7を記録ミツバチから11リットルと13メートル、頭の中のPNの人口反応潜時。各ハチの両方で管からのPNを同時に記録した。集団応答待ち時間は、両方の管からPNの内の臭気濃度の増加と共に減少する待ち時間を示す。 99ミリ秒でのアンテナの匂い応答開始はelectroantennogramsを経由して記録し、PN応答待ち時間から差し引かれる。最低濃度応答での待ち時間の測定のために余りに弱く、そのため、除外された。Cに注意してください）人口は、応答の強さが増加している臭気濃度が増加すると、Bの場合と同様のPNから発火率の応答。 L-ALTは強い応答の強さを示しています。 Bにおいては、Cの平均およびSDを示す。 <img alt="図6" fo:contenT-幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 図6ミツバチの嗅覚経路に沿って二次の処理段階における人口活性を比較するデータは、1 -ヘキサノール、2 -オクタノンで刺激した20匹の動物で記録した。A）各行が一つの突起の偽色コード化された平均発火率を表す。 1 - ヘキサノール10臭い反復にわたって計算されたニューロン（PN）。臭気のプレゼンテーションは、時間0から始まり、3秒間続いた。、B、A）と同様に同じ番組）が、キノコ体外因性ニューロン（JA）のために。 Aに示すマトリクス）を、1 - ヘキサノールによる匂い刺激中のPN集団ベクトルと見なすことができる。我々は、2 -オクタノンで匂い刺激中に集団ベクトルの同じ種類を計算し、時間次元を維持する主成分分析（PCA）における両方のベクターを使用した。C）最初の3つの主成分（PC1、2および3）であった触角葉出力に、PNアンサンブル活動の臭気の分離を説明するために、互いに対してプロット。匂いの発症までの時間は黒でマークされています。 1 - ヘキサノールを用いた刺激の3秒の間に活性が青色で表示されている。 2 - オクタノールによる刺激時の活動は、赤で表示されている。さらに、我々は1 - ヘキサノールのセット（水色）と2 - octanonen（ピンク）の匂いの後に活動の1.5秒（ポスト）を示す。 PNアンサンブルのレベルで、非常に明確な軌道を想起させる、両方の匂いが「定点」長持ち全体匂い刺激期間に定住ことに注意してください。臭気がオフセットした後にのみ軌道が匂い刺激せずに、バックベースラインの活動に移行します。D）と同じ分析はキノコ体の出力でのアクティビティを表すENアンサンブルのレベルで行われていた。 PN活性と比較臭気が少なく明確な軌道を呼び起こす。さらに「固定点」観測できない。最初は匂い誘起軌道INTE臭気はまだ存在するが、ベースライン活性にrmingle。オフセットだけ臭いは、追加の軌跡を誘発。 <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">映画の1。</a>時間PN-人口ベクトル（左）とEN人口ベクトルの主成分分析後に軌道を誘発され、臭気の評価、解決、アッパー部分は最初の3つの主要コンポーネント（PC1が含まれる（右図6 CPを。）。図2及び図3）は、互いに対してプロットした。下のパネルは、経時的にPC1、2,3の評価を示す。匂い刺激は灰色のバーでマークされている。すべてのパネルが同期された。 contraintuitiveのようですが、それ以前の1で議論されて含まれる層の接続性と特性によって説明できる現象は、ENの人口の活動は、PNの人口アクティビティの前にわずかに始まることに注意してください。

2異なる脳neuropilesまたは2つの異なる解剖学的管から同時に細胞外の長期的な記録は、ミツバチに設立された。これらの録音は、単一のニューロンでだけでなく、行動する動物でのアンサンブルのレベルで異なる脳領域間での神経処理の時間的な側面の調査を可能にする。

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

本手順の全体的な目的は、行動中のミツバチにおける2つの独立した神経処理段階への長期的なアクセスを通じて、嗅覚コーディングと記憶形成を研究することです。まず、絶縁銅マイクロワイヤとカスタムメイドのホルダーを用いて、低コストのマルチチャンネル電極を組み立てます。次に、生きたミツバチの頭部カプセルの一部を取り除き、蛍光色素で処理した2本の電極を露出した脳に挿入して準備を整えます。第3のステップでは、花の香りやフェロモンで刺激を与えながら、嗅覚経路にある2つの独立したニューロピルまたは神経束から記録を行います。その後、脳を解剖し、異なる蛍光トレーサーを触角葉に注入して標的ニューロンを逆行性に染色します。こうして得られた染色経路と電極による追跡記録を可視化し、ニューロン構造の3次元再構成を作成します。最終的に、触角葉やキノコ体といった異なる処理レベルにある2つのニューロン集団間における臭いコーティングの関係を、これらの手法を用いてより深く理解することが可能になります。したがって、既存の手法に対する本手法の主な利点は、マルチチャンネル電極が非常に小さく、組み合わせて使用できることであり、これにより、電極を固定した後、脳の異なる領域から同時に記録できる点にあります。また、柔軟なワイヤーを使用することで、行動中の動物において数時間にわたり安定した記録を行うことができます。この手法は、動物が環境からどのように嗅覚情報を得て、知覚し、最終的に処理するのかを理解するなど、神経病理学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この二重記録技術は、においコーディングおよび一般的な神経ネットワークの基礎となるメカニズムへの洞察を提供できます。また、無脊椎動物や感情および神経生物学における他のモデル生物にも適用可能です。一般的に、この手法を初めて行う方は、キノコ体の中央葉や垂直葉のような形態学的指標のみを用いてミツバチのニューロンを特定するには多くのトレーニングが必要であるため、困難を感じるでしょう。本プロトコルでは、標準的な電極インターフェースボードに適合する電極アダプターを作成します。まず、3本の短い絶縁電線を18ピンコネクタにハンダ付けします。次に、プレキシガラス板を切り出し、最長辺に沿って浅い溝を設けます。続いて、プレキシガラス板にはんだ付け端子をネジで固定し、板をコネクタの上部に接着します。最後に、3本の短い電線を用いて、ベースと端子を接続します。次に、ガラスキャピラリーをプレキシグラスプレートの溝に配置します。キャピラリーはスライド可能で、ネジで固定できる必要があります。微細ピンを用いて、ガラスキャピラリーを外側に約5 mm伸ばします。このキャピラリーとピンを使用して、電極マイクロワイヤーを支持し、安定させます。次に、3本のマイクロワイヤーを配置します。アクセスを容易にするため、粘着テープを用いて、12 Vのはんだ付けニードルグルーでガラスキャピラリーを取り除きます。LMP歯科用ワックスでワイヤーを固定しますが、ワイヤーの末端3分の1は接着しないでください。次に、このマルチチャネルマイクロワイヤーアセンブリを電極アダプターに接続します。延長したガラスキャピラリーをマイクロワイヤーと平行に配置します。重なり合ったガラスキャピラリーとミニチュアンピンに沿って、歯科用ワックスでこの固定箇所を固定します。次に、電極線を、マイクロマニピュレーターピンから2〜3 cm、および電極端から2〜3 cm分を残してカットします。続いて、キャピラリーを電極アダプターに固定し、ネジを使用してすべてを安定させます。温度は360 °Cに設定します。ワイヤーの端をラグに対して垂直にハンダ付けします。次に、1 kHzにおけるインピーダンスが約300 kΩであることを確認し、電気的接触が十分に強固であるかを確認してください。続いて、2つ目の電極アダプターのチャンネルをマスター電極に接続し、リファレンス電極と筋電極をマスター電極のベースにハンダ付けします。最後に、マスター電極をヘッドステージのインターフェースボードに取り付けます。ミツバチを氷上で冷却して不動化した後、2本目の電極を別のヘッドアダプターに固定します。次に、頭部を露出させた状態で、ミツバチを標準的なプレキシガラス製ホルダーに固定します。加熱した歯科用ワックスを目の基部および頭部と胸部の接合部に塗布し、頭部を固定します。引き続きワックスを用いて、触角の柄節（scape）を頭 capsule 上で固定します。この際、前方を向いている必要がある鞭節（flagellum）にはワックスを塗布しないように注意してください。Pro Boisに干渉がないことを確認してください。可動性を確認します。次に、アクセス性を向上させるために頭被膜をシェービングします。次に、ミツバチに30%sucroseを飽和するまで与えます。これにより、良好な前処理、生存率、および組織の水分量が確保されます。続いて、マイクロメスを用いて、複眼の縁に沿って垂直に、および触角の基部の上の水平方向に切開します。O細胞の眼の下をさらに切開し、緩んだ角質層を除去します。下咽頭腺と気管は脇に除けてください。これにより、電極を挿入するための経路が確保されます。まず、参照電極である35 micronの銀線を挿入します。最初に、同側の複眼に小さな切り込みを入れます。次に、そこから電極を挿入します。次に、外側O細胞眼の下にある筋肉突出領域に2本目の電極を挿入します。後で電極の位置を可視化するため、電極を0.5 molar 塩化カリウムおよび5%Alexa Hydrocyte 4 88溶液に3分間浸します。続いて、マイクロマニピュレーターを使用して、2本の電極を脳内に配置します。キノコ体（mushroom body）の触角葉（antenna lobe）と垂直葉（vertical lobe）を確認して、方向を定めます。ここでは、一方の電極を触角葉外側路（lateral antenna lobe tract）の深さ180 µmに、もう一方の電極を触角葉内側路（medial antenna lobe tract）に、深さ約300 µmまで挿入します。2つのコンポーネントを用いて電極を固定し、電極配置を完了させます。脳の上の全領域をシリコンで覆い、組織の乾燥を防ぎます。その後、記録を行い、細胞外記録信号からユニット活性を抽出します。利用可能なスパイクソートソフトウェアを使用します。分化させた電極チャンネルを使用してください。3つの電極チャンネルすべてにテンプレートマッチング手法を同時に適用し、単一のスパイクイベントに相当する異なる波形 संयोजनを検出します。最後に、ユニットが適切に分離されているかを確認します。記録された3つの分化電極チャネルの単一スパイクイベントに対して主成分分析を行います。記録後、ミツバチからシリコンと電極を慎重に取り除いてください。次に、脳を bee ringer solution で洗浄し、腺と気管を除去します。その後、マイクロピペットを用いて、1 molar potassium acetate に溶解した 5%micro ruby を触角葉に注入します。これにより、葉の路に順行性ラベルが付加されます。ここからのすべての工程は、完全な暗所で行ってください。脳を再び bee ringers で3回洗浄し、染料を30～45分間インキュベートします。ミツバチを冷蔵庫で冷却し、固定します。次に脳を摘出します。脳を 4% Para aldehyde（0.1 molar PBS）で、4 °C で緩やかに攪拌しながら一晩固定します。その後、標準的な脱水および透明化プロトコルに従います。触角葉の投射ニューロンに micro ruby tracer を逆行性に標識した後、Z軸に沿ったオルソスライスからこれらのニューロンの投射像を構築しました。2本の電極上のAlexa Hydrocyte 4 88染料により、それらが触角葉の内側および外側のトラクトに挿入されていることが示されています。染色された標的細胞と電極挿入部位の3D再構成を用いて、2本の触角葉トラクトの軌跡の概略図を作成しました。異なる濃度の臭気でミツバチを刺激しながら、2本の触角葉トラクトから同時に記録を行うことで、時間的処理について調査しました。活性は、その後の処理段階で評価されました。触角葉投射ニューロンおよび外在性ニューロンの集団ベクトルに対する主成分分析から、投射ニューロンにおける臭気応答は持続的であり、刺激終了後も維持されていたことが示されました。対照的に、外在性ニューロンの集団では、臭気オン型と臭気オフ型のみが表現されていました。したがって、時間経過に伴う活動を見ると、右側の外在性ニューロン集団は、投射ニューロン集団が臭気誘発活動を展開し始めるわずか前に、臭気分離活動を示しています。嗅覚刺激は灰色で示されています。習得すれば、電極の作成には約30分かかります。適切に行えば、ハチの準備と標的領域への電極挿入は、さらに30分で完了できます。この手順を試みる際は、習熟するまであらゆるステップにおいて多くの練習と忍耐が必要であることを忘れないでください。特に、電極線を接続点まで配線すること、および目的の脳領域から記録を行う際には細心の注意を払ってください。これには、発育後のミツバチの脳解剖に関する確かな知識が必要です。この手法により、神経病理学および昆虫の嗅覚分野の研究者は、行動中のミツバチにおける異なる神経経路と脳領域の活動との間の正確な時間的関係を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、2つの脳領域および行動中のミツバチから同時に記録するための多チャンネル・マイクロワイヤ電極の作製方法と使用方法について、十分に理解することができます。また、記録用電極の正確な位置を可視化する方法についても習得できるはずです。

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

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