のライブイメージングショウジョウバエ幼虫の神経芽細胞

この手順の全体的な目標は、3 番目の Instar oph 幼虫からの無傷の CNS の解剖を詳細に説明することです。非対称幹細胞分裂、細胞分化、形態形成を研究するため。これは、最初に肉眼的解剖によって幼虫の体からCNSを植えることによって達成されます。

2番目のステップは、カスタムメイドのツールを使用した微細なマイクロダイセクションにより、末梢組織から無傷の脳を分離することです。次に、健康な脳をライブセルイメージングのためにマウントするか、化学固定と免疫蛍光法にかけ、最終的にスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、神経幹細胞の分裂を支配するイベントを示し、CNSの発生にメカニズム的な洞察を提供します。この方法は、幹細胞がんおよび神経発達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

幹細胞の増殖がどのように制御されているかを理解することで、ABER幹細胞分裂が腫瘍形成や小頭症と関連していることが分かっており、画像研究により、これらの幹細胞分裂を制御するメカニズムが明らかになります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、脳のマイクロダイセクションとマウントを学ぶのが難しいため、安定した手、忍耐、練習が必要なため、非常に重要です。この手順は、1つのスライドガラスに2滴の温かい解剖媒体を置くことから始め、1つは肉眼的解剖用、もう1つは精密解剖用です。

次に、いくつかの幼虫を培地ドロップの1つに移します。その後、幼虫の入ったスライドガラスを解剖顕微鏡に移します。次に、幼虫を含むドロップを拡大して、幼虫の前端と後端が見え

一対の鉗子で1匹の幼虫の中央部をつかみ、そのすぐ隣の別の領域を2対の鉗子でつかみます。次に、幼虫を半分に引き裂きます。カバー上のすべての幼虫に対して手順を繰り返し、滑らせて後半分を廃棄します。

幼虫を拡大して、前方の口のフックがはっきりと見えるようにします。その後、幼虫の口の反対側に小さな切開または切り込みを入れます フック 第3胸部と第1腹部のCLEバンドの間。次に、鉗子で口のフックをつかみます。

キューティクルを前方から後方向にそっと剥がし、CNSが露出するまで続けます。次に、組織を引き裂いて、CNSを残りの幼虫から分離します。CNSを傷つけないように注意し、腹側神経索が破れたり、視葉が歪んだりした損傷したサンプルを廃棄してください。

カバースリップのすべての幼虫に対して手順を繰り返します。次に、健康な外植組織を他のきれいな培地に移します。カバースリップに落とし、細かく解剖します。

解剖ピンを使用して、脳から末梢組織を切除します。脳と不要な組織の間にメスをスライドさせ、結合組織をスライドガラスに固定します。フックを使用して、不要な組織をそっとからかい取りながら、同時にシーソーの動きでメスをカバースリップに押し付けます。

ゆっくりと慎重に作業して、各脳からすべての椎間板を取り外してください。脳の形態を乱さないように注意してください。健康な脳には、無傷の腹側神経索と対称的な丸い視葉があります。

次に、透明なフィルムを上に向けて50ミリメートルのガス透過性培養皿を反転させ、皿の中央に少量の培地を堆積させます。次に、フックを使用して視神経ローブの下の脳をすくい上げ、それらを1つずつ皿の上のメディウムの滴に移します。ミディアムのドロップに5〜10個の脳を集めます。

次に、後で多くのメニスカスに閉じ込められるため、それらを1つずつ下に押し込みます。神経芽細胞が前腹側神経芽細胞を画像化できるように、脳の向きを変えます。腹側神経索を上に向けて脳を配置し、すべての腹側神経索がXY平面内で同じ方向を向くように脳を整列させます。

シリンジまたはプラスチック製の移送ピペットを使用して、4滴のハロカーボンオイルをガス透過性メンブレンにセットします。油の各滴の体積は、互いに、および媒体の滴と同等でなければなりません。完了すると、5つのドロップはウエスタンスタイルのサイコロの5つのファセットに似ています。

次に、カバースリップをアセンブリに下ろし、5滴すべてに同時に当たるようにします。サンプル全体の圧力を均一に保つことで、サンプルが乱れる可能性が低くなります。約3分待ちます。

オイルと媒体がカバーの重量で分散すると、解剖スコープの下に滑り込みます。カバースリップが触れるまでティッシュペーパーの芯で余分な媒体を取り除くことにより、カバースリップを脳の表面にさらに下げます、これは組織の歪みや脳の爆発を引き起こすため、脳は芯を超えません 前腹側神経芽細胞を画像化します。カバースリップは、腹側神経索の先端の方向にわずかに動かす必要があります。

これにより脳が回転し、脳葉がカバースリップに直接接触してイメージングが容易になり、その後、encによってチャンバーが密閉されます。カバーは少量のハロカーボンオイルで滑ります。カバースリップから滲み出る余分な油分は最小限に抑え、ティッシュで拭き取る必要があります。

イメージングの前に。マウントされたブレインのすぐ上にあるカバースリップに液浸油を一滴加えて、サンプルの真上に対物レンズを集中させます。マウントされたサンプルを摂氏25度のステージインキュベーターに静かに配置し、チャンバーを蓋で覆います。

次に、視葉の中央領域と内側領域に存在する大きな丸い細胞に焦点を合わせることにより、透過光を使用して中枢脳神経芽細胞を見つけます。所定の位置に設置したら、共焦点を使用してすばやく露出し、神経芽細胞の適切な位置と深さを決定します。深さを最初の10〜15マイクロメートルに制限します。

必要に応じて調整し、別のテスト画像を撮影します。軸方向のずれをなくすには、赤外線LEDを使用した連続自動集光装置を使用するか、手動で焦点面を補正します。目的の神経芽細胞が特定されたら、イメージングする前にすべてのパラメーターを最適化します。

次に、Z軸に1マイクロメートル間隔で12〜14枚の画像を収集して、神経芽細胞全体を画像化します。時間分解能を調整して、同じ神経芽細胞の単一または複数の細胞周期を捕捉します。単一細胞サイクルのイメージングには10〜32秒の間隔を使用し、複数の細胞サイクルには1〜3分の間隔を使用します。

次に、有糸分裂の期間を監視して、サンプルが健康であることを確認します。有糸分裂に15分以上かかる場合は、別の脳に移ります。健康な脳は、同じ視野内に多くの神経芽細胞を示し、数回の有糸分裂を経験します。

イメージングが完了したら、インキュベーションチャンバーを分解し、ガス透過性培養皿以外はすべて廃棄します。培養皿の表面を95%エタノールですすぎ、ティッシュで油を拭きます。この手順をさらに 2 回繰り返します。

ここに示されているのは、ホールマウント調製物中の神経芽細胞幹細胞分裂のライブイメージングです。これらは、細かい細胞分析のためにGFP Mosinを発現する神経芽細胞からの単一細胞周期のタイムラプス画像であり、単一の神経芽細胞周期は32時間間隔未満で画像化されています。そして、これらは、G-F-P-M-OとA GFP標識中心体マーカーの両方を発現する神経芽細胞からの連続した細胞分裂サイクルのタイムラプス画像です。

複数の神経芽細胞周期をイメージングする。脳は通常、2〜3時間にわたって1〜3分間隔で画像化されます。ホームマウント調製物からの固定幹細胞の共焦点プロジェクションを以下に示します。

両方の視葉にあるすべての神経芽細胞を画像化するには、20 倍の倍率が使用されます。この分析は、全体的な脳の形態を調べ、神経芽細胞の数を定量化するのに特に役立ちます。単一の視神経葉からの神経芽細胞の大部分は、40倍の倍率で視覚化できます。

いくつかの神経芽細胞の詳細な細胞解析には、100倍の倍率を使用する必要があります。この変異神経芽細胞は、各紡錘極に複数の中心体を示します。この手順を試行する際は、サンプルに当たる光の量を制限することで、写真の損傷を避けることを覚えておくことが重要です。

ホールマウント調製物で神経芽細胞の生きた分裂をイメージングするこの技術は、幹細胞生物学の分野の研究者が、発生中のショウジョウバエの脳の生きたネイティブコンテキストで非対称細胞分裂を探求する道を開きました。