へのガイドインビボシングル単位記録

次の実験の全体的な目標は、チャネルルートイン2を発現するマウスの皮質間ニューロンから高品質の細胞外単一ユニット記録を取得することです。これは、高インピーダンスの記録電極を組織全体に送り込み、青色光パルスに対するスパイク応答からニューロン間を同定することによって達成されます。電気信号は、適切な進行速度と安定した十分に分離された記録を得る可能性を示す変化について監視されます。

良好な単一ユニットの分離が達成できない場合、または逆に光応答性ニューロンにほとんど遭遇しない場合は、記録電極を交換してください。結果は、光がニューロンに光学的に識別された応答を誘発する信頼性と、この戦略で得られる典型的な信号対雑音比を示しています。光刺激アプローチは、標準的な細胞外増幅器と青色光を使用して、遺伝的に同定された細胞タイプを標的とする、アクセス可能で安価な方法です。

これは、聴覚皮質を麻酔する中で特定の内部ニューロンをポン引きするための我々の戦略であるが、より一般的な点は、スパース細胞型よりも他の皮質領域に適用されるこの手順を開始する。動物を腹腔内注射によるケタミンマイネカクテルで麻酔した後、脳定位固定装置または他の頭部保持装置に入れ、頭蓋骨がしっかりと固定されていることを確認します。これは、安定したシングルセル記録を維持するために不可欠です。

次に、眼に眼軟膏を塗布して乾燥を防ぎ、動物の体温を摂氏37度に維持してCI胸骨ドレーンを行い、記録の安定性を高め、メスの刃で後頭蓋骨から組織を取り除き、CI胸骨を露出させます。次に、ブレードの先端でドラに小さな切り込みを入れて、脳脊髄液を排出します。次に、メスを使用して、関心のある皮質領域に対して小さな開頭術を行います。

その後、硬膜を取り除き、露出した皮質を温かいアロの層で覆います。アグロスを生理食塩水で湿らせておきます。舌スタンド電極を用意します。

電極をガラスキャピラリーチューブに瞬間接着剤と加速器で接着します。次に、グリップ用の熱収縮チューブを追加します。その後、電極を電動または油圧のマイクロミクロンマニピュレーターに取り付け、皮質表面に直交して移動するように設定します。

アース線を皮膚の下に滑り込ませ、頭蓋骨に当てます。頭の側面や首の後ろの筋肉との接触は、筋グラフのアーチファクトを生成する可能性があるため、避けてください。電気信号は、単一ユニット記録に適した細胞外増幅器を使用して増幅され、好ましくはインピーダンスチェックモードが装備されています。

進行中のスパイク活動は、2つのオシロスコープとパワードスピーカーのセットで監視されます。次に、電極をアグロスに通し、そのインピーダンスをテストして、7〜14メガオーム以内にあることを確認します。先端が皮質の表面を破ると、マイクロマニピュレータ上のこの位置をゼロにします。

記録の深さを最適に推定するには、電極の先端がゼロの深さで皮質表面から出ていることを視覚的に確認します。聴覚皮質への浸透の終わりに電極を引き抜くとき、このゼロ設定値が皮質のレベルに対応することを確認するために、刺激誘発電界電位を監視します。電極を最初の数百マイクロメートルの組織に通しながら、局所電位の極性が100マイクロメートルの深さで逆転することを確認します。

次に、青色光源に結合した光ファイバーを手動のマイクロマニピュレータに実装します。指定された幅と持続時間のTTLパルス列を供給できる制御ユニットを使用して、光源の出力を調整します。次に、両方のオシロスコープで信号をモニタします。

光ファイバーの先端での総光量をパワーメーターで測定します。この値を使用して、放射照度をファイバー コアの断面積で割って日射照度を計算します。10 から 15 ミリワット/平方ミリメートルの範囲の値から開始します。

顕微鏡を使用して、ファイバーの先端をアロスの表面にできるだけ近づけます。電極が組織に入るビームの中心にビームを置きます。次に、arosの電極で光のアーティファクトを確認します。

パルスひずみを配信します。電極に対して光ファイバーを再配置し、入射光の角度を変更することにより、過渡光のアーチファクトを排除します。アーティファクトが続く場合は、光の電力を下げてみてください。

次に、電極を脳内を毎秒約1マイクロメートルの速度でゆっくりと進めます。1つのオシロスコープを使用して、電極の進行中の活動を監視します。レーザーパルスをトリガーオフするためにもう一方を使用します。

オーディオモニターで誘発された光のかすかなハッシュを聞きます。これは、電極がチャネルオプシン陽性セルに近づいていることを示しています。次に、光が呼び起こされたらすぐに進行速度を遅くします。スパイクは、オシロスコープで個別にトリガーするのに十分な大きさです。

それを始めてください。横軸のスケールを調整して、スパイク波形の正確な形状を観察します。この時点で、電極の前進を停止し、電極が組織に定着するのを待ちます。

これは、安定した録音のために重要です。数分経ってもS/N比が改善しない場合は、さらに5マイクロメートル進めて待ちます。繰り返しになりますが、活動電位のピークまたはトラフが電圧しきい値で確実に捕捉できるようになるまで、このプロセスを繰り返します。

録音中はノイズフロアよりかなり上に設置してください。1台目のオシロスコープで進行中のアクティビティを監視します。同時に、2番目のオシロスコープを使用してスパイクのサイズと形状に注意を払い、スピーカーでの音の品質に注意してください。

セルが電極に近づきすぎているか、離れて漂っていることを示す急激な変化に注意深く耳を傾けてください。スパイクが大きくなり、歪んだ場合は、電極を引き出します。小さくなったら電極を進めます。

2マイクロメートルステップでゆっくりと動かし、スパイクの品質を確認します。すべてのスパイク波形を広範囲のしきい値に重ね合わせます。均一な高さの一貫したスパイク形状が 1 つだけ表示されます。

ほとんどのPV陽性細胞は、1秒間発火を維持できます。信号が隣接するニューロンからのスパイクで汚染された場合は、電極を進めて侵入ごとに新しい細胞を探し、皮質の深さ全体を通して電極を下げます。多くの貫通後に光応答性ニューロンが検出されない場合、または逆に、記録が隣接するチャネルからのスパイクで日常的に汚染されている場合、オプシン陰性細胞は、新しい電極を試してください。

この図は、光学的に同定された3種類のニューロン間からの記録例を示しています。細胞は、スパイクの信頼性の高いバーストで検索パルス列に応答します。ここに示されているのは、100 tr ラインのスパイクと平均補間波形です。

これらの名簿プロットは、光によって誘発されるスパイクの一貫したタイミングを示しています。電力のサンプルの最初のスパイク待機時間。ここでは、Volin陽性のインターニューロンを紹介します。

光刺激アプローチは概念的には非常にシンプルですが、驚くほど難しく、収率も低い場合があります。実際に。ガラスパッチ電極はパラメタルニューロンに強く偏っているため、内部ニューロンを取得することはあまりありません。

一方、テトロスでは、光に応答するニューロン間ニューロンがたくさん得られるのですが、スパイクが小さく、重なり合う波形が多いため、確実に1つのユニットに分類するのが非常に困難です。私たちはこれをさまざまな方法で達成しようと試みており、内部ニューロンについては、これらの鋭い10〜14メガ電極が、遠くからのオークスパイクの光を検出するのに十分な大きさである必要があるリスニング半径の点で適切なバランスをとっていることがわかりましたが、これは良好な単一ユニットの分離を達成するのに十分な制限が必要です。しかし、それにはいくつかのブードゥー教があります。

それができない場合は、その電極を捨てて、機能する電極が見つかるまで次の電極に進むだけで、多くの時間を節約できます。