好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

この手順の全体的な目標は、生理学的流動条件下での白血球トランス内皮移動中の内因性接合部、テリン、およびpcam1の分布を追跡することです。これは、まず、プロコ勾配を使用して健康なボランティアの全血から多形核白血球またはPMNを単離することによって達成されます。第2のステップは、フロー実験開始の30分前に、フロースライドで培養したA TNFアルファ刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞単層に蛍光標識抗体を添加することです。

これにより、生理的流動条件下での好中球輸走中の内皮細胞の接合部ダイナミクスの可視化が可能になります。次に、蛍光標識されたTNFアルファ刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞を含むフロースライドをフローシステムに接続し、顕微鏡ステージに置きます。ポンプは、リザーバーからフローチャンバーを通ってシリンジにフローバッファーを引っ張ります。

最後のステップは、注入ポートを介してPMNをフローシステムにゆっくりと注入することです。最終的に、PMNは共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して視覚化されます。数分後、白血球が出現し、付着して転生します。

実験はいつでも停止できます。この手法が静的トランスマイグレーションアッセイなどの他の既存の方法よりも優れている点は、この手法を使用すると、生理学的フロー条件下での実際の接着とトランスマイグレーションを研究できることです。これは、白血球が一方の根を他方の根よりも選択する理由、つまりPGAと細胞内移動を理解するのに役立ちます。

これは、蛍光標識された抗体で細胞細胞の結合を視覚化することによって行われます。この実験用のヒト臍帯静脈内皮細胞またはHU Xは、内皮増殖を添加した培地を使用して、フィブロネクチンコーティング皿で製造元の指示に従って培養します。中程度。細胞培養物は、細胞が80〜90%に達すると、pH 7.4の室温PBSで慎重にそれらを洗浄し、トリプシンはトリプシンと遠心分離後の細胞です。

培地を使用して、ミリリットルあたり800, 000個の細胞で懸濁します。実験では、前日のプレートにフィブロネクチンをコーティングしたフローチャンバーを使用します。フィブロネクチンの各チャネルに80, 000個の細胞をコード化したフローチャンバーを投入し、細胞懸濁液をインキュベーターで一晩中ピペットで上下に動かし、翌日には摂氏37度と二酸化炭素5%

スライドを45度の角度でゆっくりと傾けて、フローチャンバースライド内のメディアをリフレッシュします。チャネル自体ではなく、リザーバー内のメディアのみを取り外すことをお勧めします。チャネル内の培地を除去すると、ピペッティングによる培地の引きずり力により、内皮細胞が失われ、死滅する可能性があります。

位相差顕微鏡で確認する 内皮細胞が単層を形成しているかどうか。細胞が100%コフルエントでない場合は、100%コンフルエンスに達するまで1日2回培地を交換します。細胞が100%coの流暢さに達したら、炎症性メディエーターを含む培地で細胞を刺激します。

TNFアルファで一晩中uixを刺激するTNFアルファは、ICAM ONEやVA M1などの細胞接着分子の内皮IEのアップレギュレーションの炎症表現型をもたらします。多形核白血球またはPMNを単離する前に、単離されたPMNを洗浄し、事前に調製したストック溶液の100ミリリットルまでのフローアッセイで使用するためのフローバッファーを準備します。100マイクロリットルの新鮮な1モル塩化カルシウム、2.5ミリリットルのヒトアルブミンで、200グラム/リットルのストック濃度と0.1グラムのグルコース

0.45ミクロンのフィルターを使用してフローバッファーをろ過します。pH 7.4 の PBS 中の 10% クエン酸三ナトリウムまたは TNC 溶液も、PMN の分離前に調製されます。PMN は、健康なボランティアからヘパリン エットナトリウムに集められた 20 ミリリットルの全血から分離されます。

まず、15ミリリットルのチューブで全血を10%PBST NNCで1対1に希釈します。次に、最も遅い設定のピペットボーイを使用して、希釈した血液20ミリリットルを、新しい50ミリリットルチューブ内の密度1.130グラム/ミリリットルの水中の12.5ミリリットルのコロイド溶液に慎重にピペットでピペットします。血液の添加中は、1 つのチューブを含むチューブを 45 度の角度で傾ける必要があります。

チューブを遠心分離機に慎重に置き、低加速で800Gで室温で20分間回転し、遠心分離が完了したらブレーキを無効にします。すべての液体を取り除き、各チューブに氷冷した赤血球溶解バッファーを入れて赤血球を溶解します。チューブを氷の上に置いたまま、サスペンションがブレーキを有効にした状態で摂氏4度で500GSで5分間暗赤色の遠心分離機になるまで、チューブを逆

得られたペレット画分には、赤血球と一緒にPMNが含まれており、上清を取り除き、ペレットを氷で2回洗浄します。500 Gで4°Cで5分間冷冷溶解バッファー。2回目の洗浄から上清を除去した後、ペレットをフローバッファーで室温で再懸濁し、自動セルカウンターを使用してPMN濃度を決定します。

最後に、PMNをフローバッファーに10〜6細胞/mLの1回で懸濁し、室温で保持して内皮接合部VAカドヘリンとpcamを標識します。pcam LOR 6 47抗体を1〜100希釈で、カルシウム非依存性FEカドヘリンZI抗体を1〜50希釈でVE培養液に加え、フローチャンバー内で培地に添加し、摂氏37度で30分間インキュベートします。アッセイ用のPMNを調製するには、PMNを37°Cのウォーターバスに15分間入れてから、フローシステムに注入します。

チューブを空のフローチャンバーに接続し、気泡の形成を防ぐために暖かいフローバッファーを充填します。フローシステムを設定するとき。シリコンチューブを使用して、空のフローチャンバーの片側を20ミリリットルのシリンジを含むシリンジポンプフローシステムに接続します。

フローチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。アッセイは、63 x オイル対物レンズと摂氏 37 度、二酸化炭素 5% に設定された気候チャンバーを備えた共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して実行されます。空のフローチャンバーの反対側を摂氏37度のフローバッファーで満たされたリザーバーフラスコに接続し、シリンジポンプを始動しますすべてのチューブをフローバッファーで満たすために、ポンプはリザーバーからフローチャンバーを通ってシリンジにフローバッファーを引き出します。

このチューブにはインラインルアー注入ポートも含まれており、流れを止めて気泡を発生させることなく、PMNを針で実行中の実験に注入できます。次に、空のフローチャンバーをTNFアルファ処理VEを含むフローチャンバーと交換します チューブをつまんでからチューブを取り外し、VE.To を含むチャンバーに再接続します システム内の気泡を避けるために、チューブをつまんでクランプすることが重要です。セルを含むスライドを接続するとき。

顕微鏡の段階に流れの部屋を置き、ポスト毛細管ESの生理学的な流速に従って流れの速度を1 dime cminsの二乗に調節しなさい、それは1から5 dinesセンチメートルの二乗センチメートルの記録の差動干渉のコントラストまたはDIC fite LOR 6 47である。同時に 1 ミリリットルのシリンジを使用して、インライン ルアー注入ポートを介して PMN をフローシステムにゆっくりと注入します。数分後、白血球が現れ、付着して転生し、任意の瞬間に実験を停止します。

チューブをフローチャンバーから切り離し、アフィクランプ剤をフローチャンバーにピペッティングすることにより、内皮単分子膜の抵抗を測定し、抗体が内皮のバリア機能を妨害するかどうかをテストしました。VEが抗体クローン55 7 H 1を聴くことができた場合、またはアイソタイプコントロールを細胞に加えた場合、耐性の変化は観察されなかった。対照的に、VEタラのヒアブロッキング抗体CL75は、抵抗を劇的に減少させました。

RAP解析では、VE CADHERIN 55 7 H one抗体の存在下または非存在下で蛍光回復に変化は見られず、この抗体が好中球トランス内皮遊走またはTEM中にVEカドヘリン、VEカドヘリン、およびpcam one分布のダイナミクスを変化させなかったことが示されました。トップパネルは、白で縁取られた好中球が内皮に付着し、VEコヒーレントとpcamの分布を損なうことなく細胞間結合を横切っていることを示しています。ディアペデシス中、好中球が細胞を通って突出して、白で輪郭が描かれた細胞結合が内皮の上にある好中球である場合、VEコヒーレントとPケム1の局所分散が観察されます。

黄色の輪郭は、すでに内皮の下にある好中球膜を示しています。ディアペデシスの完了後、接合部は閉じてベコヒーレントになり、pcam 1はディアペデスの部位に再配置されます。トランス回遊した好中球の境界は黄色で縁取られています。

この手順に続いて、白血球がバガまたは経細胞根を使用して内皮を通過するかどうかなどの追加の質問に答えるために、白血球のトランス内皮移動を実行できます。