Name: 好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学ぶ 好中球の血管内皮細胞遊出メカニズムを生理的流動条件下でリアルタイムイメージングする手法。VE-cadherinとPECAM-1の動態可視化により、細胞間と細胞貫通経路を区別し、炎症性疾患の治療戦略に貢献する知見を得る。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者は、原稿を批判的に読んでくださったP.L.ホルダイク博士に感謝します。AEDは、Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research(LSBR)フェローシップ(助成金#1028)によってサポートされています。JKは、Dutch Heart Foundation(2005T3901)の支援を受けています。JDvBはNHS Dekkerフェロー(助成金 #2005T039)です。

好中球は、インフォームドコンセントに署名した人の健康なボランティアから単離した。研究が人類の福祉のための制度や国のガイドラインを遵守して行われている。 ヒト臍帯静脈内皮細胞の1めっきとメンテナンス<ol><li>製造業者の指示に従って培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECを）。フィブロネクチン上のHUVECを育てる（FN）がメディアを使用して（脱イオン水に溶解した10μg/ mlの）料理がコーティングされ（内皮増殖培地（EGM-2）singlequotsを加えた内皮基本培地（EBM-2）培地）。実験のために4-8の通路の間に細胞培養を使用してください。 </li><li> 1日目：37℃で少なくとも2時間、5％CO 2のためにフィブロネクチンを100μl（PBS中10μg/ ml）を有するコート、フローチャンバー。 </li><li> 2日目：細胞を、80〜90％コンフルエンスに達し、RTリン酸緩衝生理食塩水（で慎重に洗浄した後、細胞をトリプシン処理PBS）pH7.4のメディアを使用して、800,000細胞/ mlで800×gで遠心分離し、再懸濁。プレートFNでコーティングされたフローチャンバーのすべての単一のチャネル80,000細胞、ゆっくり上下細胞懸濁液をピペット。 37℃のインキュベーター中、5％CO 2で培養O / N。 </li><li> 3日目：優しく45°の角度でスライドを傾けてフローチャンバースライドでメディアを更新します。 （ 図1Aを参照）。 メモ：のみ貯水池ではなく、チャネル自体のメディアを削除することを推奨します。チャンネル内のメディアの除去が原因ペッティングによって引き起こされるメディアのドラッグ力に内皮細胞の損失と死に至ることがある。 </li><li>内皮細胞単層（ すなわち、100％コンフルエント）を形成した場合、位相差顕微鏡により確認してください。細胞が100％コンフルエントでない場合、彼らは100％のコンフルエンスに達するまで、メディアを2回日を変更する。 </li><li>細胞がコンフルエントに達したら、培地で細胞を刺激する（ステップを参照1.1）炎症性メディエーター（TNF-α（10 ngの個/ ml）を含有する）。 、内皮の炎症性表現型をTNF-αの結果とHUVECをO / N（ すなわち、12時間）刺激すなわち 、アップレギュレーションなどのICAM-1およびVCAM-1の13のような細胞接着分子。 </li></ol>パーコール勾配を使用した2。多形核白血球の単離<ol><li>多形核白血球（PMN）を単離する前に：（フローバッファー以下と呼ばれる）、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N&#39;-2-エタンスルホン酸（HEPES）を調製-buffer。フローバッファを単離したPMN及びフローアッセイにおけるバッファとしての洗浄に使用される。フローバッファを準備するには：7.72グラムのNaCl（132 mM）を、4.76グラムのHEPES（20 mM）を、0.45グラムのKCl（6 mM）を、0.25グラムの硫酸マグネシウム•7H 2 O（1 mM）を、K 2 HPO 4•3Hを希釈脱イオン水1L中2 O（1.2ミリモル）と（この在庫が数週間、4℃で保持することができる）pH7.4に調整します。 </li><li>新鮮な100μlの1Mの塩化カルシウム＆＃を追加します。160;が​​200g / Lのストック濃度から（1 mM）を2.5 mlのヒトアルブミン（0.5％v / v）およびフロー緩衝液100ml（w / vの0.1％）、0.1グラムのグルコース。次に、0.45μmのフィルターを用いて、フローのバッファをフィルタリングします。注：このフローバッファは、すべての実験のために新たに調製する必要があります。 </li><li> PMNの単離の前に、10％のクエン酸三ナトリウム（TNC）PBS、pH7.4中の溶液を調製。 </li><li>健康なボランティアからのナトリウムヘパリンのvacuettes全血を20mlを収集します。パーコールの12.5ミリリットル（1.130グラム/ mlの密度で、水中の23％（w / w）のコロイド溶液）の上に慎重に、血液を希釈して50mlチューブとピペット20mlの10％PBS / TNCで1：全血の1に希釈新しい50mlチューブ中。慎重に遠心機でチューブを配置し、低加速し、RTで設定されていないブレークで800×gで20分間スピン。 注：パーコールに希釈した血液を追加する場合は、45度の角度でパーコール含有チューブを傾け、静かにチューブのウィットに希釈血液をピペットH最も遅いピペット男の子の設定。 </li><li>すべての液体を除去し、続いて500ミリリットルに氷冷した赤血球溶解バッファー（4.15グラムのNH 4 Clを[0.155 M]、0.5gのKHCO 3 [0.01 M]及び18.5ミリグラムEDTA（三重III）[0.1 mm]としたチューブを埋める赤血球を溶解するための氷冷H 2 O）である。サスペンションが有効になって休憩して、4℃で5分間の遠心分離500×gで、続いて暗赤色に変わるまで、時折転倒、氷上でチューブのままにしておきます。 注：ペレット画分を一​​緒に赤血球とのPMN（好中球、好酸球、好塩基球）が含まれています。 </li><li>上清を除去し、4℃で5分間500×gで氷冷溶解 - 緩衝液中で2回ペレットを洗浄。 </li><li> RTで流れバッファーでペレットを再懸濁し、血球計または自動細胞カウンターのいずれかを使用してPMNの濃度を決定する。 1×10 6細胞/ mlで、フローバッファ内のPMNをサスペンドし、室温で保管してください。 </li></ol>内皮ジャンクショ​​ンの3ラベリングアルは、VE-カドヘリンおよびPECAM-1 <ol><li> 1でPECAMアレクサフルオロ647抗体（クローンWM59）を追加します。1:50希釈HUVECに、培地で100倍希釈し、カルシウム非依存VE-カドヘリン-FITC抗体（クローン55-7H1）、（ステップ1.1参照）前生理的流れの条件下で好中球遊走の間に内皮細胞の接合動態を可視化するために、フロー実験を開始する30分間インキュベートする。 注：フローチャンバーに直接標識抗体を追加する前に、各チャネルのボリュームは100μLを超えていないことを確認してください。これは、可能な限り低い抗体費を維持するのに役立ちます。 </li></ol> 4 PMN TEMアッセイで流動<ol><li>前のフローシステムにそれらを注入する37℃で15分間水浴中にPMNを配置してください。 </li><li>目を設定する際の気泡の形成を防止する（ステップ4.3参照）、空のフローチャンバーにチューブを接続し、暖かいでいっぱいに（ 例えば、37℃）、フローバッファ電子フローシステム。 </li><li> 20ミリリットルの注射器を含むシリコーンチューブを使用して、シリンジポンプフローシステムに空のフローチャンバーの一方の側を接続し、顕微鏡のステージへの流れチャンバを置く。 </li><li> 37°Cフロー緩衝液（ 図1B）で満たされたリザーバフラスコに空のフローチャンバの反対側を接続し、フローバッファーですべてのチューブを充填するために、シリンジポンプを起動する。ポンプは、注射器に流動室を通ってリザーバから流れバッファを引っ張ってくる。注：このチューブはまた、PMNの流れを停止させ、気泡を作成せずに実行している実験に針を注入することを可能にする、インラインルアー注入ポートが含まれています。 </li><li>フローチャンバーを含むTNF-αで処理したHUVECを持つ空のフローチャンバーを交換し、フローバッファーを含むチューブを接続し、顕微鏡ステージ（ 図1C）に置きます。切断して再接続する前に、チューブを切っピンチピンチオフしないように、HUVECを含有するチャンバーmは、チューブおよび/またはフローチャンバ内の気泡の形成をもたらすことができる。 </li><li>ポスト毛細管細静脈において生理的流れ速度に応じて、1ダイン/ cm 2の流速を調整する（1-5ダイン/ cm 2）であった。 </li><li>レコード微分干渉コントラスト（DIC）、FITC（488nmの）およびアレクサフルオロ647（647 nm）を同時に共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて。 </li><li> 1ミリリットルの注射器を使用して、インラインルアー注入口（ 図1D） を介して 、フローシステム内にゆっくりのPMN（ステップ4.1）を注入する。 </li><li>数分後、白血球が付着現れ、転生。フローチャンバー内にフローチャンバー及びピペッティング固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）からチューブを外して、任意の瞬間に実験を停止します。 10分間の固定を可能にし、PBSで洗浄した。データは、（材料および機器の表を参照）画像ソフトウェアを用いて分析される。 NOTE：37°C、5％CO 2の恒温及び63X油を目的とした人工気象室を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて彼の実験を実行する。 </li></ol>

<ol><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis--an+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li>
<li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases%3A+%27+vascular+rheumatology%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224(2008).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li>
<li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+migration%3A+cell-cell+contacts+get+intimate%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li>
<li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li>
<li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li>
<li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li>
<li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li>
<li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li>
<li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro%3A+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li>
<li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li>
</ol>

著者には競合する金銭的利益はありません。

このプロトコルについては、これは、細胞アポトーシスおよび破壊単層をもたらすので、フローチャンバー内の気泡の形成を防止することが重要である。これを避けるために、私たちは、チューブをフローチャンバーに接続されている手順4.2および4.5、特に関心を払うように強調したい。プロトコルにおけるもう一つの重要なステップは、前のフローチャンバー（ステップ4.1）にそれらを注入する、37℃で15〜30分間、それらをインキュベートすることにより、室温に保たれているPMNのプライミングである。これは、彼らがそのような内皮でのICAM-1またはVCAM-1などの接着分子に付着させ、白血球インテグリンのプライミングになる。 このプロトコルは、好中球の遊走を研​​究するために限定されるものではない。また、単球またはリンパ球のような他の白血球の型を使用することができる。そのステップ4.1に注意して、 すなわち、白血球をプライミングすると、白血球の型の間で異なる場合があります。また、内皮細胞の他のタイプを使用することができる。このためには、臨界のままで例えば、TNF-αまたはIL-1βのような適切な炎症性刺激による内皮細胞を刺激する。好中球遊出に応答しない場合、人はN-ホルミル-L-メチオニル-L-ロイシル-L-フェニルアラニン（fMLPの）ペプチド16での好中球の短時間（5分）の治療を検討してもよい。これは内皮に付着し、それらをより受けやすいこと、さらに、それらのインテグリン、特に、好中球を刺激する。 典型的には、1ダイン/ cm 2の流速が用いられる。この流速は、後毛細血管細静脈、大部分の白血球経内皮遊走17を発生する部位で測定される。説明したフローチャンバーを使用して、10ダイン/ cm 2の流速を高めることができる。しかし、さらに剪断力を高めるためにはお勧めしません。これは、フローチャンバーからの細胞のチューブと剥離の不要な漏れの原因となります。 図3に記載した結果は、これらのことを示している抗体を視覚化し、白血球血管外遊出の際に、内皮細胞間結合の動力学を研究するために使用することができる。具体的には、既存のトランスマイグレーションアッセイに加えて、このプロトコルは、リアルタイムでの生理的な流れの条件の下で経移行から傍細胞を識別することができます。抗体は細胞間結合を染色するので、人は/ PECAM-1のサイトカドヘリンVE非正対VE-カドヘリン/ PECAM-1陽性接合を横切る白血球数を獲得することができます。このように、細胞間移行が傍細胞遊走識別することができる。 これは、これらの抗体は、それらが結合するタンパク質の機能を妨害しないことを強調することが重要である：本研究で使用PECAM-1抗体は、第二の細胞外ドメインに対して向けられる。抗体は、少なくともなかったことを示唆して拡散または単分子層を形成する際の欠陥を示さなかった抗体の存在下で播種した内皮細胞は、内皮細胞間同型相互作用を妨害。それに加えて、両方の抗体は、内皮単層を通って移動する好中球の能力を損なわない。さらに、抗体の非存在下または存在下で内皮単層を横切って遊出する好中球の数は変化しない（データは示さず）。重要なことは、共焦点レーザー走査顕微鏡は私たちに、同時に異なる蛍光チャネルおよびDICを記録する可能性を与えます。 好中球は、内皮細胞間の接合部を横断し、白血球が経細胞に対する他の、 すなわち、傍細胞上の1つの経路を選択する理由を理解するのに役立ちますときこのように、このアッセイは、同時に、VE-カドヘリンおよびPECAM-1のダイナミクスを研究することができます。

効率的かつ厳密に制御された白血球経内皮遊走（TEM）は、免疫監視および急性炎症などの生理学的プロセスに極めて重要である。しかし、特定の病態生理学的条件の下で、制御されない過度のTEMは、慢性炎症性疾患（ 例えば、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、喘息）、その結果が観察される。また、腫瘍細胞の転移の間に、経内皮移動の過程は、腫瘍細胞が1-3転移する循環を残すための器械である。具体的には、過剰な白血球または腫瘍細胞TEMを妨害するために、このプロセスの調節の詳細な理解が必要とされる。 これは、TEMプロセスは、異なる工程を経て生じると考えられる。ブッチャーとスプリンガーによって20年前にレビュー精液の研究では、TEM 4,5の処理を説明する多段階モデルにつながった。このモデルは、まだいくつかの広告が、当てはまるditionalの手順は、6が含まれています。アロンらは、内皮7の表面上に固定化されたケモカインの存在の必要性を説明した。最近では、それらは内皮自体が内皮頂端面8に提示されたケモカインを生成することを示した。また、同じグループは、TEM 7時の流れの状態の重要性を提唱。最近、2つの異なるルート白血球に焦点を当てたいくつかの出版物は、TEMの最終漏出段階で取ることができます。彼らは、すなわち 、細胞-細胞間結合を通じて傍細胞移動ルートを行くか、経細胞移動ルート9として知られている内皮細胞体を介して交差することができます。カーマンらは詳細にこれらの経路を研究し、臍帯静脈内皮単層10を横断するときに白血球が優先的に経細胞経路（10％）以上の傍細胞移動ルート（90％）を選択することを結論した。しかし、他の起源からの内皮細胞を用いた場合、 例えば、脳または微小血管系、より白血球は経細胞経路（30％）の11を使用した。 Vestweberグループは、最近、内因性の交換、細胞-細胞間結合は、ノックイン動物モデルを使用して、互いから解離することができなかったときことを示したVE-カドヘリン、VE-カドヘリン、α-カテニンキメラのために、白血球のTEMは、完全に12を遮断した。驚くべきことに、著者は、TEMは、いくつかのすべてではなく、組織において、ブロックされたことに気づいた。全体的に、これらのエレガントな実験は、この決定をトリガー調節シグナルは依然として不明であるが、白血球は、経細胞経路での傍細胞経路を優先することを示した。 白血球の大部分が傍細胞移動ルートを好むにもかかわらず、それは両方の経路を区別することは困難である。それに加えて、いくつかの研究にもかかわらず、内皮細胞 - 細胞JUNCTの役割に焦点を当てイオンは、これらの接合部の力学は、特に接合部のタンパク質は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1、白血球の交差が論争中である時に。私たちは、これら接合分子は蛍光標識された抗体を用いて、生理的流れの条件下で、白血球の血管外遊出中にリアルタイムで監視することができる比較的簡単なアッセイを開発した。これらの抗体は、妨害または標的とするタンパク質の接合部の完全性や移動性を阻害しなかった。このアッセイは、私たちは、傍細胞TEMの過程接合部タンパク質の動態を追跡することができます。さらに、このアッセイはまた、パラ及び経細胞移動ルートとの間の識別を可能にする。

<table><tbody><tr><td>&mu;-スライドVI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>フロー</td></tr><tr><td>チャンバー0.45 &mu;mフィルター&nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>20 ml シリンジ&nbsp;</td><td>BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21G ニードル&nbsp;</td><td>BDマイクロランス</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 基礎培地 + EGM-2 SingleQuot キット サプライ &成長因子</td><td>ロンザ</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>メディア</td></tr><tr><td>EDTA(Titriplex III)</td><td>メルク</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ&nbsp;</td><td>コーニングライフサイエンス352096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>インラインルアー注入ポート&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4&bull;7H2O)</td><td>メルク</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>クローン WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>フレゼニウスカビ&nbsp;オランダ</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カリウム (KHCO3)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性三水和物 (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>シリコン タイゴン 3350 チューブ</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td>チューブ</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ&nbsp;</td><td>ハーバード装置</td><td>モデル番号55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>腫瘍壊死因子</td></tr>ク<tr><td>エン酸三ナトリウム&nbsp;</td><td>メルク</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Germany</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>BDファーミンゲン</td><td>560411</td><td>クローン55-7H1</td></tr><tr><td>ツァイスLSM510メタ&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, イェーナ, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, イエナ, ドイツ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

炎症時には、白血球が循環を離れ、下にある組織に侵入する病原体と戦うために内皮を横切る。このプロセスは、白血球の経内皮遊走として知られている。内皮単層を横切る白血球のための2つのルートが記載されている： すなわち 、細胞-細胞間結合および経細胞経路を介して傍細胞経路、 すなわち、内皮細胞体を介し。しかし、パラ - 及び経細胞経路を区別することは技術的に困難であった。私たちは、生理的な流れの条件の下で好中球経内皮移動中およびPECAM-1-カドヘリン、VE内因性の分布を調べるための簡単なin vitroアッセイを開発しました。好中球灌流の前に、内皮細胞は、短時間VE-カドヘリンおよびPECAM-1に対する蛍光標識抗体で処理した。電気細胞substraによって決定したように、これらの抗体は、両方のタンパク質の機能を妨害しなかったTEインピーダンス検出およびFRAP測定。このアッセイを用いて、流動条件下で経内皮移動中およびPECAM-1 VEカドヘリンと内皮を通過する白血球のパラ - 及び経細胞遊走のルートを区別し、内因性の分布に従うことができました。

抗体は、内皮のバリア機能を妨害しなかった場合には、まず試験した。私たちは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング（ECIS）を使用して、内皮単層の抵抗を測定した。詳細については、ヴァンBuul らを参照してください。抗VE-カドヘリン蛍光標識抗体は細胞（ 図2A）に添加した場合の抵抗13全く変化が見られなかった。 VE-カドヘリン機能をブロックすることが十分に認識されている抗VE-カドヘリン抗体は、抵抗を劇的（ 図2A）を減少させた。また、のダイナミクスを変化させないイメージングのために使用される抗体は、VE-カドヘリンの光退色（FRAP）後の蛍光回復を測定することによって評価したように（ 図2B）カドヘリン-GFPをVE。 1-2分後、好中球はDICチャンネル（ 図3A）で可視化することができるように活性化内皮単層に付着した。 5-30 SEのクロール後、C、好中球の大半はPECAM-1に対する抗体で標識し、VE-カドヘリンをした細胞間結合を介して内皮単層を通って遊出。漏出の過程の分布は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1は、リアルタイム（ 図3B）に従った。好中球の血管外遊出の部位に、VE-カドヘリンが局所的に破壊し、PECAM-1以上のリング状の構造を示した。漏出が完了した後、閉じて、接合部は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1は明らかに漏出部位（ 図3C）に移転しました。好中球は、内皮のBASO-側面に到達したら、抗PECAM-1抗体の部分が好中球の表面上で検出されたことに注意してください。しかし、これは内皮を横切るから好中球を防ぐことはできませんでした。の観察されたダイナミクスは、好中球経内皮移動中にリアルタイムでカドヘリンをVEショウらが仕事と一致した共焦点顕微鏡を用いて、示し、VE-カドヘリン-GFP-トランスフェクトVE-カドヘリン-GFPは、白血球が内皮細胞間結合14を横切った際に横方向拡散内皮細胞を、。また蘇によって動作し、共同研究者は、PECAM-1の私たちの観察を強調した。彼らは次の横方向への白血球の通過時に拡散カドヘリンVEは、ことを示した、PECAM-1はローカルに転生好中球15の周りにリングに再配布されました。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> 体外フローチャンバーで 、図1（A）の矢印は、媒体を更新する必要がある、そこからリザーバを示している。 （B）チューブ（矢印）を切断することなくPMNのを注入するために用いたインラインルアー注入ポートとフローチャンバーを接続するシリコンチューブ。 （C）コーン37°Cフローバッファー（矢頭）で満たされたリザーバフラスコに空のフローチャンバーのと接続。 （D）フローバッファーを含むチューブに、TNF-αで処理したHUVECを有するフロー· ​​チャンバーの接続および顕微鏡ステージ（矢頭）に入れた。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> 図2は、VE-カドヘリン接合ダイナミクスまたは機能を妨害しない抗体。（A）内皮細胞単層のインピーダンスは、ECISを用いて測定される。 Y軸は、オームにインピーダンスを表し、x軸は、時間単位の時間を表す。インクルード抗体CL75（黒線）をブロックカドヘリン、VEのに対し、Alexa647の（青線）またはアイソタイプのIgG-Alexa647の制御で標識された抗体クローン55-7H1、（赤線）は、内皮細胞単層インピーダンスを変化させないカドヘリンは、VEのインピーダンスを減少させた。 （B <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> 図3は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1の分布をリアルタイムで好中球のTEM中に（A）好中球が内皮に付着したとの分布に影響を与えることなく、細胞間の接合部を横切る（白線でマーク）VE-カドヘリンおよびPECAM -1。 （B）好中球は、細胞-細胞間結合を介して内皮単層を横切る。好中球は、細胞 - 細胞接合部を通って突出するとき、VE-カドヘリンおよびPECAM-1の局所分散を観察することができる。白線は内皮の上にまだ好中球の存在感を示している。黄色の線は、好中球膜THAを示していますtは内皮の下に既にある。 （C）好中球が完全に内皮単層を超えました。 VE-カドヘリンおよびPECAM-1は、漏出部位に再配置されます。黄色のラインが遊出し、好中球の境界を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

この手順の全体的な目標は、生理学的流動条件下での白血球トランス内皮移動中の内因性接合部、テリン、およびpcam1の分布を追跡することです。これは、まず、プロコ勾配を使用して健康なボランティアの全血から多形核白血球またはPMNを単離することによって達成されます。第2のステップは、フロー実験開始の30分前に、フロースライドで培養したA TNFアルファ刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞単層に蛍光標識抗体を添加することです。これにより、生理的流動条件下での好中球輸走中の内皮細胞の接合部ダイナミクスの可視化が可能になります。次に、蛍光標識されたTNFアルファ刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞を含むフロースライドをフローシステムに接続し、顕微鏡ステージに置きます。ポンプは、リザーバーからフローチャンバーを通ってシリンジにフローバッファーを引っ張ります。最後のステップは、注入ポートを介してPMNをフローシステムにゆっくりと注入することです。最終的に、PMNは共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して視覚化されます。数分後、白血球が出現し、付着して転生します。実験はいつでも停止できます。この手法が静的トランスマイグレーションアッセイなどの他の既存の方法よりも優れている点は、この手法を使用すると、生理学的フロー条件下での実際の接着とトランスマイグレーションを研究できることです。これは、白血球が一方の根を他方の根よりも選択する理由、つまりPGAと細胞内移動を理解するのに役立ちます。これは、蛍光標識された抗体で細胞細胞の結合を視覚化することによって行われます。この実験用のヒト臍帯静脈内皮細胞またはHU Xは、内皮増殖を添加した培地を使用して、フィブロネクチンコーティング皿で製造元の指示に従って培養します。中程度。細胞培養物は、細胞が80〜90%に達すると、pH 7.4の室温PBSで慎重にそれらを洗浄し、トリプシンはトリプシンと遠心分離後の細胞です。培地を使用して、ミリリットルあたり800, 000個の細胞で懸濁します。実験では、前日のプレートにフィブロネクチンをコーティングしたフローチャンバーを使用します。フィブロネクチンの各チャネルに80, 000個の細胞をコード化したフローチャンバーを投入し、細胞懸濁液をインキュベーターで一晩中ピペットで上下に動かし、翌日には摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。スライドを45度の角度でゆっくりと傾けて、フローチャンバースライド内のメディアをリフレッシュします。チャネル自体ではなく、リザーバー内のメディアのみを取り外すことをお勧めします。チャネル内の培地を除去すると、ピペッティングによる培地の引きずり力により、内皮細胞が失われ、死滅する可能性があります。位相差顕微鏡で確認する 内皮細胞が単層を形成しているかどうか。細胞が100%コフルエントでない場合は、100%コンフルエンスに達するまで1日2回培地を交換します。細胞が100%coの流暢さに達したら、炎症性メディエーターを含む培地で細胞を刺激します。TNFアルファで一晩中uixを刺激するTNFアルファは、ICAM ONEやVA M1などの細胞接着分子の内皮IEのアップレギュレーションの炎症表現型をもたらします。多形核白血球またはPMNを単離する前に、単離されたPMNを洗浄し、事前に調製したストック溶液の100ミリリットルまでのフローアッセイで使用するためのフローバッファーを準備します。100マイクロリットルの新鮮な1モル塩化カルシウム、2.5ミリリットルのヒトアルブミンで、200グラム/リットルのストック濃度と0.1グラムのグルコースから。0.45ミクロンのフィルターを使用してフローバッファーをろ過します。pH 7.4 の PBS 中の 10% クエン酸三ナトリウムまたは TNC 溶液も、PMN の分離前に調製されます。PMN は、健康なボランティアからヘパリン エットナトリウムに集められた 20 ミリリットルの全血から分離されます。まず、15ミリリットルのチューブで全血を10%PBST NNCで1対1に希釈します。次に、最も遅い設定のピペットボーイを使用して、希釈した血液20ミリリットルを、新しい50ミリリットルチューブ内の密度1.130グラム/ミリリットルの水中の12.5ミリリットルのコロイド溶液に慎重にピペットでピペットします。血液の添加中は、1 つのチューブを含むチューブを 45 度の角度で傾ける必要があります。チューブを遠心分離機に慎重に置き、低加速で800Gで室温で20分間回転し、遠心分離が完了したらブレーキを無効にします。すべての液体を取り除き、各チューブに氷冷した赤血球溶解バッファーを入れて赤血球を溶解します。チューブを氷の上に置いたまま、サスペンションがブレーキを有効にした状態で摂氏4度で500GSで5分間暗赤色の遠心分離機になるまで、チューブを逆転させます。得られたペレット画分には、赤血球と一緒にPMNが含まれており、上清を取り除き、ペレットを氷で2回洗浄します。500 Gで4°Cで5分間冷冷溶解バッファー。2回目の洗浄から上清を除去した後、ペレットをフローバッファーで室温で再懸濁し、自動セルカウンターを使用してPMN濃度を決定します。最後に、PMNをフローバッファーに10〜6細胞/mLの1回で懸濁し、室温で保持して内皮接合部VAカドヘリンとpcamを標識します。pcam LOR 6 47抗体を1〜100希釈で、カルシウム非依存性FEカドヘリンZI抗体を1〜50希釈でVE培養液に加え、フローチャンバー内で培地に添加し、摂氏37度で30分間インキュベートします。アッセイ用のPMNを調製するには、PMNを37°Cのウォーターバスに15分間入れてから、フローシステムに注入します。チューブを空のフローチャンバーに接続し、気泡の形成を防ぐために暖かいフローバッファーを充填します。フローシステムを設定するとき。シリコンチューブを使用して、空のフローチャンバーの片側を20ミリリットルのシリンジを含むシリンジポンプフローシステムに接続します。フローチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。アッセイは、63 x オイル対物レンズと摂氏 37 度、二酸化炭素 5% に設定された気候チャンバーを備えた共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して実行されます。空のフローチャンバーの反対側を摂氏37度のフローバッファーで満たされたリザーバーフラスコに接続し、シリンジポンプを始動しますすべてのチューブをフローバッファーで満たすために、ポンプはリザーバーからフローチャンバーを通ってシリンジにフローバッファーを引き出します。このチューブにはインラインルアー注入ポートも含まれており、流れを止めて気泡を発生させることなく、PMNを針で実行中の実験に注入できます。次に、空のフローチャンバーをTNFアルファ処理VEを含むフローチャンバーと交換します チューブをつまんでからチューブを取り外し、VE.To を含むチャンバーに再接続します システム内の気泡を避けるために、チューブをつまんでクランプすることが重要です。セルを含むスライドを接続するとき。顕微鏡の段階に流れの部屋を置き、ポスト毛細管ESの生理学的な流速に従って流れの速度を1 dime cminsの二乗に調節しなさい、それは1から5 dinesセンチメートルの二乗センチメートルの記録の差動干渉のコントラストまたはDIC fite LOR 6 47である。同時に 1 ミリリットルのシリンジを使用して、インライン ルアー注入ポートを介して PMN をフローシステムにゆっくりと注入します。数分後、白血球が現れ、付着して転生し、任意の瞬間に実験を停止します。チューブをフローチャンバーから切り離し、アフィクランプ剤をフローチャンバーにピペッティングすることにより、内皮単分子膜の抵抗を測定し、抗体が内皮のバリア機能を妨害するかどうかをテストしました。VEが抗体クローン55 7 H 1を聴くことができた場合、またはアイソタイプコントロールを細胞に加えた場合、耐性の変化は観察されなかった。対照的に、VEタラのヒアブロッキング抗体CL75は、抵抗を劇的に減少させました。RAP解析では、VE CADHERIN 55 7 H one抗体の存在下または非存在下で蛍光回復に変化は見られず、この抗体が好中球トランス内皮遊走またはTEM中にVEカドヘリン、VEカドヘリン、およびpcam one分布のダイナミクスを変化させなかったことが示されました。トップパネルは、白で縁取られた好中球が内皮に付着し、VEコヒーレントとpcamの分布を損なうことなく細胞間結合を横切っていることを示しています。ディアペデシス中、好中球が細胞を通って突出して、白で輪郭が描かれた細胞結合が内皮の上にある好中球である場合、VEコヒーレントとPケム1の局所分散が観察されます。黄色の輪郭は、すでに内皮の下にある好中球膜を示しています。ディアペデシスの完了後、接合部は閉じてベコヒーレントになり、pcam 1はディアペデスの部位に再配置されます。トランス回遊した好中球の境界は黄色で縁取られています。この手順に続いて、白血球がバガまたは経細胞根を使用して内皮を通過するかどうかなどの追加の質問に答えるために、白血球のトランス内皮移動を実行できます。

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで、我々は、マウスの足蹠にホーミング白血球を研究する非侵襲的二光子（2P）顕微鏡のアプローチを説明します。私たちは、組織イメージングの準備の技術的側面を議論し、実行してデータ収集するための初期設定から典型的な実験を通してリーダーを歩く。...

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

これは収穫加圧された血管の内皮への白血球の接着を可視化する方法です。テクニックは、このように高血圧の病態生理学的条件を模倣 - イング200...

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

我々は、in vivoでの好中球走化性因子のソースに対応して好中球動員中に動的な好中球 -...

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。...

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。...

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞との間に形成される動的な「免疫学的シナプス」によって制御されます。このプロトコルは、研究が進んでいない生理学的APCとして、また新しいタイプの「平面細胞APCモデル」として、内皮細胞を調査するための方法を説明しています。...

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro...

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

学ぶ 好中球の血管内皮細胞遊出メカニズムを生理的流動条件下でリアルタイムイメージングする手法。VE-cadherinとPECAM-1の動態可視化により、細胞間と細胞貫通経路を区別し、炎症性疾患の治療戦略に貢献する知見を得る。

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

さらに動画を探す