Name: ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶFIONA法によるナノメートル精度の蛍光イメージング。ミオシンモーターの36nmステップサイズ測定や分子モーター動態の可視化に応用でき、単一分子の局在化技術を習得できます。

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この作品は、NIHの助成金068625、NSF助成1063188と0822613.感謝はウサギの眼の贈り物のために先端科学技術のためのベックマン研究所で博士マリーナMarjanovicに行く生きている細胞の物理学センターによってサポートされていました。

<ol><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li>
<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+%28continued%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li>
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<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand%3A+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li>
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<li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy%3A+Application+to+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li>
<li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+kinesin+is+so+processive%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li>
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<li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li>
<li>Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+international%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li>
<li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

フィオナは1ミリ秒4〜8までナノメートルの精度と時間分解能を有する蛍光発光体（有機フルオロフォアまたは量子ドット）の位置を局所化する技術である。十分な光子が収集されると、この技術はより正確に回折限界（〜200 nm）を超える蛍光発光体の位置を決定することができ、したがって、この技術は、従来の/従来の光学顕微鏡4で見られなかったものを観察する道を開く- 8。その発明以来、FIONAは正常にそのようなミオシンやキネシンなどの多くの分子モーターの歩行を観察するに適用されている。さらに最近では、それは、一緒に他の仕事3,19と、そのようなSTORMやPALM 13〜16などの特定の新興の超解像技術のローカリゼーションプロセスに貢献した。 FIONAを達成するための重要なステップは、さまざまなFの影響を受けて収集された光子の数である俳優。例えば、FIONA実験に用いTIRFMのセットアップがよく、良好なPSF（ すなわち等 、ではない、不名誉、延伸しない）が達成さ...

1882年頃、エルンスト·アッベは、可視光顕微鏡の分解能は〜λ/ 2NA、または〜200nmの（λは波長であり、NAは開口数である）1,2であることがわかった。したがって、この寸法よりも小さい任意のオブジェクトは、光学顕微鏡の回折限界スポットとして現れる。しかし、非常に高い精度3であるスポットの中心、物体の位置を決定することが可能である。 1ナノメートルの精度（FIONA）と蛍光イメージングは、xy平面4ナノメートルの精度で単一の蛍光団をローカライズするためのシンプルでありながら有用な技術である。局在化の精度σμ（ すなわち 、平均の標準誤差）は、収集された光子の総数に依存する<img alt="式（1）" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100"> Nは、光子計数であり、sは蛍光スポットの標準偏差であり、aはピクセルイメージング検出器の大きさ、bはバックグラウンド3,4の標準偏差である。 〜万光子を放出する蛍光団のために、フィオナは〜1nmの精度4を達成することができます。 FIONA正確静止エミッタの位置、または（十分に速く取り出すことができる画像を仮定して）移動するかを決定するために用いることができる。 FIONAムービーのフレームに順次適用されるため、単一分子4〜8の動きを追跡することができます。光防護試薬は、試料が光分解しないことを保証する必要があるかもしれない。さらに、蛍光物体自体は任意のサイズであってもよい、リミット-側、例えば回折よりも小さいまたは大きいと、その膜上に分散多くの蛍光タンパク質と細胞小器官（〜1ミクロン）で構成することができる。 FIONAを使用すると、まだその平均重心の非常に正確な（ナノメートル）の平均を得ることができる。 FIONAによるローカリゼーション精度の大幅な向上はnanomeを解決することができます時間をかけてタースケールの動き。これは、分子長さスケール4〜8に顕微鏡をプッシュしています。 その発明以来、FIONAの変異体が開発されてきた。例えば1ナノメートルの精度（bFIONA）9と、明視野イメージング、FIONAのわずかな変種、画像や透過光などのメラノソームのin vivo（メラニン色素を含む暗いオブジェクト）などの高密度のオブジェクトを局在する。また、FIONAは、複数の色素を解決するために採用されている。例えば、光退色（エビ）を有する単一分子の高分解能イメージング10,11または単一分子の高解像度の共局在（SHREC）は12が約10nm内の2つの色素を解決するために開発されてきた。さらに最近では、FIONA分析はそのような確率論的光学recoのようなある種の超解像顕微鏡のローカリゼーションプロセスに貢献してきました（ つまり 1が離れて、同一の染料を伝えることができますどのように正確に。、これは解像度であることに注意してください）nstruction顕微鏡（STORM）13〜15と光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）16、一時的な暗い蛍光団が励起され、その後、蛍光がローカライズされている。繰り返しエキサイティングかなり低い染料の密度（未満あたりの回折限界スポット）した後、FIONAによってそれらのそれぞれを分析し、蛍光を収集することによって、人は、高解像度のマップを構築することができます。解像度は、ちょうど光子の数によって制限され、各染料が出す、ならびに取得中に（ 例えば 、顕微鏡ステージを含む）試料を静止状態に保つようなもの。 本論文では、FIONA技術の概要と簡単にFIONAが報告されている使用して行われている研究の例を記載している。まず、 すなわち 、FIONA実験のために全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を、必要な機器の設定方法を、光学部品を位置合わせする方法の詳細に記載されている。次に、どのように適切なプロトコルを使用して固定化されたCy3-DNAの単一分子を局在化する上で単純なFIONA実験を行って、図示されている。その後、FIONAの使用は量子ドットで標識された単一の切断型ミオシンVaモータ36 nmのステップサイズを測定することが提示されている。ミオシンVaは、アクチンフィラメントに沿って転位しながら携帯の貨物を運ぶ不可欠プロセッシブモータータンパク質である。ここで、Vaはトランケート構築ミオシンステップサイズとは無関係なドメインを除去するために使用され、およびFLAGタグがC末端に付加して、抗FLAG抗体で官能化量子ドットで標識の容易さを可能にする。この実験は、ミオシンを遅くし、フレーム毎に優れた光子数を得るために十分に長い露光時間の使用を可能にするために、低ATP下で行われる。でも十分に明るい蛍光標識は、以下のプロトコルに置き換えることができる。最後に、厚いサンプルにFIONAの適用を拡張する最近の努力が報告されている。原理証明として、量子ドットは、浸漬したゾル - ゲルおよびウサギの眼の角膜における、その後FIONAを使用して画像化し、ローカライズされた。この目的は、以前に使用100X油浸対物レンズよりも長い作動距離を有するため、撮像のためにNAと、60X浸水対物= 1.2を用いた。客観的に倍率の損失を補償するために、余分な倍率のレンズ（3.3倍または4.0X）が放出路に挿入した。また、落射蛍光（ないTIR）顕微鏡は、厚い試料の深い領域にアクセスするために使用される必要がある。これは、量子ドットは、ゾル - ゲル中の深い浸したことが示されていると、ウサギの眼の角膜（Z&gt; 200ミクロン）に2-3 nmの精度で定位させることができる。

<table><tbody><tr><td>両面テープ</td><td>3M</td><td></td><td>~75 &#181;m厚い</td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr> 超音波<tr><td>洗浄機ブラン</td><td>ソン</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルターセット</td><td>Chroma49016</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクチン重合バッファー&nbsp;</td><td>細胞骨格&nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>ビオチンG-アクチン</td><td>細胞骨格&nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>Gアクチン&nbsp;</td><td>細胞骨格&nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>一般アクチンバッファー&nbsp;</td><td>細胞骨格&nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>レーザーシャッター(ドライバー付)</td><td>エレクトロオプティカルプロダクツ(株)&nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>エクセリス ビジュアルインフォメーションソリューション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ ニュートラアビジン&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td>フィ<td>ッシャーブランド&nbsp;</td><td>22X30-1.5</td><td>0.16-0.19 mm厚</td></tr><tr><td>の顕微鏡スライド</td><td>ゴールドシールマイクロスライド&nbsp;</td><td>30103X1</td><td>0.93-1.05 mm厚</td></tr><tr><td>プラズマ</td><td>クリーナーHarrickプラズマ</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿&nbsp;</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio</td></tr><tr><td>蛍光ビーズ&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 抗体標識キット</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学テーブル</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>RS4000 Series</td></tr><tr><td>60X 対物</td><td>レンズ Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X 対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 Oil &infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X 対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UPlanApo 60X / 1.20W</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>IX71 / IX70 / IX81</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-ビオチン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C3755</td><td>ウサギの筋肉由来クレアチンホスホキナーゼ</td></tr><tr><td>CP</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P1937</td><td>ホスホクレアチンジ(トリス)塩</td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>43815</td><td>DL-ジチオスレイトール</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-<>N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>03930590</td><td>プロトカテク酸&nbsp;</td></tr><tr><td>PCD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>プロトカテクエート-3,4-ジオキシゲナーゼ&nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>テトラメチル オルトケイ酸</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸</td></tr><tr><td>1" 直径広帯域誘電体ミラー マウント付き</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BB1-E02、KM100</td>数量<td>:2</td></tr><tr><td>&frac12;&rdquo;直径ポスト</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR4</td><td>個 &ge; 6</td></tr><tr><td>10Xビームエキスパンダー</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>2"φ f = 300 mmレンズ Thorlabsマウント付</td><td>&nbsp;</td><td>LA1256-A, LMR2</td><td>TIRレンズ</td></tr><tr><td>蛍光配向体&nbsp;</td><td>ソーラブス&nbsp;</td><td></td><td></td>VRC2SM1</tr><tr><td>レーザー安全ゴーグル</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>ND</td><td>フィルターThorlabs&nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>オプティカルビームプロファイラー</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>ポストマウント虹彩絞り</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ID25</td>数量<td>:2</td></tr>せん断<tr><td>干渉計</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ翻訳ステージ、&frac12;&rdquo;旅行&nbsp;</td><td>ソーラブス&nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>レーザー</td><td>ワールドスターテクノロジーズ&nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm、30 mW</td></tr></tbody></table>

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（fiona）

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

1ナノメートルの精度（FIONA）と蛍光イメージングは​​、xy平面上にナノメートルの精度で単一の蛍光団をローカライズするためのシンプルでありながら有用な技術である。ここでFIONA技術の概要が報告され、FIONAを使用して行われている研究の例が簡潔に記載されている。まず、 すなわち 、FIONA実験のために全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を、必要な機器の設定方法を、光学部品を位置合わせする方法の詳細に記載されている。次に、どのように量子ドットで標識された単一の切り捨てミオシンVaモータの36 nmのステップサイズを測定するためFIONAの使用に続いて、適切なプロトコルを使用して固定化したCy3でDNA一分子のローカライズで簡単なFIONA実験を実施するために、例示されている。最後に、厚いサンプルにFIONAのアプリケーションを拡張するための最近の取り組みが報告されている。 &gt;（これは、水浸対物レンズを使用して、それを示され、量子ドットは、ゾル - ゲルおよびウサギの眼の角膜における深い浸し200μm）は、2〜3程度の局在化精度を達成することができる。

典型的な目的型TIRFMの設定は、 図3に示されている。まず、表面に固定化されたCy3-DNA試料を画像化した。代表的な画像が図4aに示されている。画像は、EMゲイン= 50、CCD感度=カメラの12.13と、露光時間を0.5秒とした。単一のCy3-DNA分子の点広がり関数（PSF）は、 図4bに示されるカラーバーは、ピクセル強度のスケールを示す（ 図4aの矢印で示すスポットから）。実際の光子数は、変換係数、α= CCD感度/ EMゲインを画素強度を掛けることによって計算することができる。このスポットは、約14,000の光子（背景補正後）が含まれています。 （X-μx）から2 /（2S×2） - - （y -で＆＃PSFは次に、二次元のガウス関数f（x、y）は= zは0 + A·expの（取り付けられている181; y）が 2<...

シングルフルオロフォアはFIONAを使用して、ナノメートルの精度で定位させることができる。ここでFIONA技術の概要が報告され、そしてどのようにFIONA実験を実施する方法について説明する。

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

この手順の全体的な目標は、1ナノメートルの精度で蛍光イメージングを実行する方法、またはFiona実験を実行する方法を実証することです。これは、最初に必要な機器をセットアップし、全反射、蛍光、顕微鏡、または芝生用に光学系を調整することによって達成されます。次のステップは、CY 3D NAをサンプルチャンバーの内面に固定化し、CY 3D NA単一分子をナノメートルの精度で局在化することです。その後、フィオナは、量子ドットでラベル付けされた単一の切断されたミオシン5モーターの動きを研究するために適用されます。最終的に、ミオシンが歩くときのステップサイズであるアクトンは、フィオナ分析によって36ナノメートルと測定されました。この方法は、分子モーターに関する洞察を提供するだけでなく、細胞の膜上の受容体の追跡など、他のシステムにも適用できます。この方法は、実験の詳細を学ぶのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。セットアップ中は常にレーザー安全ゴーグルを着用することが重要です。全反射、蛍光、顕微鏡検査、または芝生用。まず、すべての光学部品の高さを顕微鏡、バックポート、レーザー、レーザーシャッター、NDフィルターの中心の高さに設定します。NDフィルターを使用して、ビームを可視に保ちながら、レーザー出力を可能な限り低く減衰させます。適切な六角レンチでネジを締めます。青い点線で示されているようにビーム パスを計画します。この回路図では、光学テーブル上にテープまたはマーカーでビームパスをマークします。ミラー M1 を最初の直角ターンに配置し、計画されたビーム パスの 2 番目の直線セクションに沿って 2 つのアイリスを配置します。レーザーが虹彩配置ミラーM2を通過するように、M1の位置と傾きの両方を調整します。2 番目の直角ターンで、パスの 3 番目の直線セクションに沿って 10 x ビーム エキスパンダーを配置します。ビームエキスパンダーが光学テーブルと計画されたビームパスの両方に平行になるように、ビームエクスパンダーの傾きを調整します。次のステップは、レーザーがビームエキスパンダーのL 1とL 2の両方のレンズの中心をまっすぐに通過するように、M1とM 2を繰り返し調整することです。白い紙を使用して、ビームエキスパンダーの後のビームをブロックし、ビームプロファイルを目視で確認します。拡張されたビームのビームプロファイルが非EDになるまで調整します。ガウスは、ビームが照合シャッターになるように、L 1とL 2の間の距離を調整します。レーザーは顕微鏡の対物レンズを緩め、蛍光アライメントにねじ込みます。ターゲットプレースミラーM 3とM 4は、拡大ビームを顕微鏡ポートとダイクロイックミラーに向けます。砲塔の内部。M 3 を調整してビームの最も明るい部分を蛍光ターゲットの中央に配置し、M 4 を調整してビームを垂直に傾け、レーザーをシャッターして対物レンズをねじ込みます。いい。M 3とM 4の傾きを調整して、対物レンズからのレーザー出力とビームプロファイルを最適化します。E-M-C-C-Dカメラを顕微鏡に取り付け、カメラをコンピューターに接続します。カメラのソフトウェアを起動します。蛍光サンプルを顕微鏡にセットします。カメラの明るい蛍光スポットを見てください。ピントが変わったために、画面上でスポットがずれていないことを確認してください。TIRレンズをXY、Z平行移動ステージに、焦点距離L3(約30センチメートル)に等しい対物レンズの後焦点面からの距離に配置します。レーザーがレンズの中心を通過するようにL3の位置を調整します。ビームパスに沿ってL 3つを平行移動して、ビーム照合を調整します。ビームがまだモニターの中央にあり、形状が対称であることを確認してください。L をビーム経路に対して垂直に 3 つ平行移動して、ビームを対物レンズから傾けます。フィオナを実行する前に、TIRが達成されるようにTIRレンズを平行移動し続けます。CY 3D NAのローカリゼーションと動員に関する実験。単一分子は、プロトコルのテキストに詳述されているようにサンプルチャンバーを構築します。スライドの長辺に沿って両面テープを2枚貼り、中央に3〜5mmの隙間を空け、スライド上部に清掃したカバースリップを貼り、チャンバーの右側と正面からの図を示します。チャンバーの開放端は開いたままで、サンプルチャンバーの内面にSI 3D NAを固定するための入口と出口として機能します。10マイクロリットルのBSAビオチンをチャンバーにピペットで入れます。5 分間待ちます。40マイクロリットルのT 50 BSAをチャンバーにピペットで移して、サンプルチャンバーを洗浄します。次に、10マイクロリットルの中性性骨折をチャンバーにピペットで入れ、5分間インキュベートします。40マイクロリットルのT 50 BSAピペット、20マイクロリットルのSI 3D NAでチャンバーを再度洗浄し、サンプルチャンバーに5分間インキュベートします。最後に、チャンバーを80マイクロリットルのT50BSAで洗浄します。芝生の下のSI 3D NA単一分子をイメージングする手順を開始するには、Mピペット30マイクロリットルのイメージングバッファーをサンプルチャンバーに注入し、8〜10分間待ちます。イメージング用のサンプルを、グリーンレーザー、100 X油浸対物レンズ、およびE-M-C-C-Dカメラを備えた芝生顕微鏡に取り付けます。露光時間とEMゲインを設定します。サンプルを1000フレーム分の動画で取得します。Fiona Proをコンパイルして実行し、Fiona解析を行います。このIDLプログラムを使用して、取得した画像をインポートし、有効ピクセルサイズと強度から光子数への変換係数を入力し、フィオナ分析用のスポットを選択します。最後に、プログラムは2Dガウス関数によるフィッティング結果を出力し、総光子数とローカリゼーション精度のコンパイルとpH count proを実行します。光子数を特徴付けるには、このDLプログラムを使用して、植物相から放出される光子の平均数を測定します。写真漂白の4つ前に、取得した画像をインポートし、強度から光子数への変換係数を入力します。このプログラムは、蛍光スポットを検出し、フレーム番号の関数としてフォトンカウントを自動的に計算し、フォトンカウントのトレースを出力します。この実験用のサンプルを調製するには、20 μリットルのビオチン化BSAをDD H2Oで1ミリグラム/ミリグラムでサンプルチャンバーにピペットで移します。10分間インキュベートします。30マイクロリットルのD ddh、2つのOピペットで0.5ミリグラム/ミリリットルのneut travainですすぎ、2分間インキュベートします。チャンバーを30マイクロリットルのM 5 PSAで洗浄します。この実験のアクトンは、プロトコルテキストに記載されているように、前日に準備する必要があります。調製したfアクチンを一般に25倍に希釈し、アクチン緩衝液を最終濃度約0.004ミリグラム/ミリリットルに希釈する。アクチン溶液をチャンバーにピペットで移し、10分間待ちます。30マイクロリットルのバッファーでチャンバーをすすぎ、フラグタグ付きのミオシン5Aを30で希釈します。M fiveバッファーを最終濃度250ナノモルまでフォールディングします。希釈したミオシン1マイクロリットルと1マイクロリットルのアンチフラッグ Q.Do 7 0 5を混合します。M 5を8マイクロリットル加えて10マイクロリットルに充填し、ピペットで上下に動かして混合します。氷上で10分間よくインキュベートします。ミオシンQドットを含むイメージングバッファー20マイクロリットルをサンプルチャンバーにピペットで挿入します。8〜10分間インキュベートします。芝生の顕微鏡でサンプルを30ミリ秒の露光で画像化します。データ解析を開始するには、少なくとも 1000 フレームを集録します。画像Jでビデオファイルを開き、移動スポットの周りでビデオをトリミングします。ビデオ全体のスポットを追跡し、ビデオの各フレームにフィオナ分析を適用することにより、時間経過に伴うX座標とY座標をピクセル単位で生成します。プロトコルのテキストで説明されているように、ピクセルをナノメートルに変換します。初期位置から変位を時間の関数として計算します。変位に対してT検定を実行して、ミオシン歩行の歩数を取得します。ステップ サイズ列からすべてのゼロ値を削除します。origin または matlab を使用してステップ サイズの分布をプロットします。ガウス分布をヒストグラムにフィットさせます。この典型的な表面イメージでは、SI 3D NA を固定化します。黄色の矢印は、点像分布関数(PSF)が示されている単一のSI 3D NA分子を指しています。PSFには2次元のガウス関数が装着されており、適合残差も示されています。このプロットは、フレーム数に対する光子数と指数関数的なフィッティングの平均光子数を約1.4倍10倍6倍にして、ミオシンステップサイズを測定するための1つのミオシンの良好な信号対雑音比のビデオファイルです。それが歩くと、アクチンフィラメントが捕捉されます。3 つのフレームの例を示します。各フレームに Fiona を適用すると、距離と時間のトレースが赤でプロットされます。T検定に基づくステップ検出アルゴリズムを使用して個々のステップを抽出し、出力は白でオーバーレイされますステップサイズとナノメートルは白でラベル付けされます。複数のトレースのステップをヒストグラムに組み合わせると、測定されたステップサイズは、約 35.8 ± 0.4 ナノメートルのガウス分布になります。このビデオを見た後、芝生顕微鏡のセットアップを含むフィオナ実験の実施方法をよく理解しているはずです 最良の結果を得るには これらの手順では、床力の使用と実験に対する写真の損傷を最小限に抑えることが重要です。芝生顕微鏡とフィオナでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には安全ゴーグルなどの予防策を着用する必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、電子顕微鏡写真で蛍光標識タンパク質をローカライズする方法について説明します。蛍光は、第一超薄切片に光活性化ローカライゼーション顕微鏡を使ってローカライズされます。これらの画像は、同じ断面の電子顕微鏡写真に整列されます。...

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

我々は、単一分子蛍光イメージングのための最小限に流体力学的サイズを有するコロイド量子ドットの調製を記載している。従来の量子ドットに比べ、これらのナノ粒子はサイズが球状タンパク質と類似しており、単一分子の明るさ、光分解に対する安定性、タンパク質や細胞への非特異的な結合への抵抗のために最適化されています。...

1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。...

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

TIRF顕微鏡を用いて大規模なドナー・アクセプターネットワークからsmFRETデータを取得するためのセットアップと実験手順を提示します。ベイズ推論ソフトウェアFast-NPSを使用したこれらの測定値の段階的な解析では、適応色素モデルの適用により、高解像度の構造情報が得られます。...

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM...

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1...

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

このワークフローは、極低温トライコンシブイメージングプラットフォームを使用して、小さく(軸方向&lt;1μm)希少な(細胞あたり1コピー)蛍光標識された生物学的構造を標的としたラメラ生成を可能にします。このプラットフォームは、蛍光顕微鏡、集束イオンビームミリング、走査型電子顕微鏡を単一の焦点位置に統合し、ミリング中の同時蛍光顕微鏡を可能にします。...

極低温同時蛍光、電子、イオンビーム顕微鏡を用いた細胞のターゲットミリングのためのワークフロー

学ぶFIONA法によるナノメートル精度の蛍光イメージング。ミオシンモーターの36nmステップサイズ測定や分子モーター動態の可視化に応用でき、単一分子の局在化技術を習得できます。

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

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