ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

この手順の全体的な目標は、1ナノメートルの精度で蛍光イメージングを実行する方法、またはFiona実験を実行する方法を実証することです。これは、最初に必要な機器をセットアップし、全反射、蛍光、顕微鏡、または芝生用に光学系を調整することによって達成されます。次のステップは、CY 3D NAをサンプルチャンバーの内面に固定化し、CY 3D NA単一分子をナノメートルの精度で局在化することです。

その後、フィオナは、量子ドットでラベル付けされた単一の切断されたミオシン5モーターの動きを研究するために適用されます。最終的に、ミオシンが歩くときのステップサイズであるアクトンは、フィオナ分析によって36ナノメートルと測定されました。この方法は、分子モーターに関する洞察を提供するだけでなく、細胞の膜上の受容体の追跡など、他のシステムにも適用できます。

この方法は、実験の詳細を学ぶのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。セットアップ中は常にレーザー安全ゴーグルを着用することが重要です。全反射、蛍光、顕微鏡検査、または芝生用。

まず、すべての光学部品の高さを顕微鏡、バックポート、レーザー、レーザーシャッター、NDフィルターの中心の高さに設定します。NDフィルターを使用して、ビームを可視に保ちながら、レーザー出力を可能な限り低く減衰させます。適切な六角レンチでネジを締めます。

青い点線で示されているようにビーム パスを計画します。この回路図では、光学テーブル上にテープまたはマーカーでビームパスをマークします。ミラー M1 を最初の直角ターンに配置し、計画されたビーム パスの 2 番目の直線セクションに沿って 2 つのアイリスを配置します。

レーザーが虹彩配置ミラーM2を通過するように、M1の位置と傾きの両方を調整します。2 番目の直角ターンで、パスの 3 番目の直線セクションに沿って 10 x ビーム エキスパンダーを配置します。ビームエキスパンダーが光学テーブルと計画されたビームパスの両方に平行になるように、ビームエクスパンダーの傾きを調整します。

次のステップは、レーザーがビームエキスパンダーのL 1とL 2の両方のレンズの中心をまっすぐに通過するように、M1とM 2を繰り返し調整することです。白い紙を使用して、ビームエキスパンダーの後のビームをブロックし、ビームプロファイルを目視で確認します。拡張されたビームのビームプロファイルが非EDになるまで調整します。

ガウスは、ビームが照合シャッターになるように、L 1とL 2の間の距離を調整します。レーザーは顕微鏡の対物レンズを緩め、蛍光アライメントにねじ込みます。ターゲットプレースミラーM 3とM 4は、拡大ビームを顕微鏡ポートとダイクロイックミラーに向けます。

砲塔の内部。M 3 を調整してビームの最も明るい部分を蛍光ターゲットの中央に配置し、M 4 を調整してビームを垂直に傾け、レーザーをシャッターして対物レンズをねじ込みます。いい。M 3とM 4の傾きを調整して、対物レンズからのレーザー出力とビームプロファイルを最適化します。

E-M-C-C-Dカメラを顕微鏡に取り付け、カメラをコンピューターに接続します。カメラのソフトウェアを起動します。蛍光サンプルを顕微鏡にセットします。

カメラの明るい蛍光スポットを見てください。ピントが変わったために、画面上でスポットがずれていないことを確認してください。TIRレンズをXY、Z平行移動ステージに、焦点距離L3(約30センチメートル)に等しい対物レンズの後焦点面からの距離に配置します。

レーザーがレンズの中心を通過するようにL3の位置を調整します。ビームパスに沿ってL 3つを平行移動して、ビーム照合を調整します。ビームがまだモニターの中央にあり、形状が対称であることを確認してください。

L をビーム経路に対して垂直に 3 つ平行移動して、ビームを対物レンズから傾けます。フィオナを実行する前に、TIRが達成されるようにTIRレンズを平行移動し続けます。CY 3D NAのローカリゼーションと動員に関する実験。単一分子は、プロトコルのテキストに詳述されているようにサンプルチャンバーを構築します。

スライドの長辺に沿って両面テープを2枚貼り、中央に3〜5mmの隙間を空け、スライド上部に清掃したカバースリップを貼り、チャンバーの右側と正面からの図を示します。チャンバーの開放端は開いたままで、サンプルチャンバーの内面にSI 3D NAを固定するための入口と出口として機能します。10マイクロリットルのBSAビオチンをチャンバーにピペットで入れます。

5 分間待ちます。40マイクロリットルのT 50 BSAをチャンバーにピペットで移して、サンプルチャンバーを洗浄します。次に、10マイクロリットルの中性性骨折をチャンバーにピペットで入れ、5分間インキュベートします。

40マイクロリットルのT 50 BSAピペット、20マイクロリットルのSI 3D NAでチャンバーを再度洗浄し、サンプルチャンバーに5分間インキュベートします。最後に、チャンバーを80マイクロリットルのT50BSAで洗浄します。芝生の下のSI 3D NA単一分子をイメージングする手順を開始するには、Mピペット30マイクロリットルのイメージングバッファーをサンプルチャンバーに注入し、8〜10分間待ちます。

イメージング用のサンプルを、グリーンレーザー、100 X油浸対物レンズ、およびE-M-C-C-Dカメラを備えた芝生顕微鏡に取り付けます。露光時間とEMゲインを設定します。サンプルを1000フレーム分の動画で取得します。

Fiona Proをコンパイルして実行し、Fiona解析を行います。このIDLプログラムを使用して、取得した画像をインポートし、有効ピクセルサイズと強度から光子数への変換係数を入力し、フィオナ分析用のスポットを選択します。最後に、プログラムは2Dガウス関数によるフィッティング結果を出力し、総光子数とローカリゼーション精度のコンパイルとpH count proを実行します。

光子数を特徴付けるには、このDLプログラムを使用して、植物相から放出される光子の平均数を測定します。写真漂白の4つ前に、取得した画像をインポートし、強度から光子数への変換係数を入力します。このプログラムは、蛍光スポットを検出し、フレーム番号の関数としてフォトンカウントを自動的に計算し、フォトンカウントのトレースを出力します。

この実験用のサンプルを調製するには、20 μリットルのビオチン化BSAをDD H2Oで1ミリグラム/ミリグラムでサンプルチャンバーにピペットで移します。10分間インキュベートします。30マイクロリットルのD ddh、2つのOピペットで0.5ミリグラム/ミリリットルのneut travainですすぎ、2分間インキュベートします。

チャンバーを30マイクロリットルのM 5 PSAで洗浄します。この実験のアクトンは、プロトコルテキストに記載されているように、前日に準備する必要があります。調製したfアクチンを一般に25倍に希釈し、アクチン緩衝液を最終濃度約0.004ミリグラム/ミリリットルに

アクチン溶液をチャンバーにピペットで移し、10分間待ちます。30マイクロリットルのバッファーでチャンバーをすすぎ、フラグタグ付きのミオシン5Aを30で希釈します。M fiveバッファーを最終濃度250ナノモルまでフォールディングします。

希釈したミオシン1マイクロリットルと1マイクロリットルのアンチフラッグ Q.Do 7 0 5を混合します。M 5を8マイクロリットル加えて10マイクロリットルに充填し、ピペットで上下に動かして混合します。氷上で10分間よくインキュベートします。

ミオシンQドットを含むイメージングバッファー20マイクロリットルをサンプルチャンバーにピペットで挿入します。8〜10分間インキュベートします。芝生の顕微鏡でサンプルを30ミリ秒の露光で画像化します。

データ解析を開始するには、少なくとも 1000 フレームを集録します。画像Jでビデオファイルを開き、移動スポットの周りでビデオをトリミングします。ビデオ全体のスポットを追跡し、ビデオの各フレームにフィオナ分析を適用することにより、時間経過に伴うX座標とY座標をピクセル単位で生成します。

プロトコルのテキストで説明されているように、ピクセルをナノメートルに変換します。初期位置から変位を時間の関数として計算します。変位に対してT検定を実行して、ミオシン歩行の歩数を取得します。

ステップ サイズ列からすべてのゼロ値を削除します。origin または matlab を使用してステップ サイズの分布をプロットします。ガウス分布をヒストグラムにフィットさせます。

この典型的な表面イメージでは、SI 3D NA を固定化します。黄色の矢印は、点像分布関数(PSF)が示されている単一のSI 3D NA分子を指しています。PSFには2次元のガウス関数が装着されており、適合残差も示されています。このプロットは、フレーム数に対する光子数と指数関数的なフィッティングの平均光子数を約1.4倍10倍6倍にして、ミオシンステップサイズを測定するための1つのミオシンの良好な信号対雑音比のビデオファイルです。

それが歩くと、アクチンフィラメントが捕捉されます。3 つのフレームの例を示します。各フレームに Fiona を適用すると、距離と時間のトレースが赤でプロットされます。

T検定に基づくステップ検出アルゴリズムを使用して個々のステップを抽出し、出力は白でオーバーレイされますステップサイズとナノメートルは白でラベル付けされます。複数のトレースのステップをヒストグラムに組み合わせると、測定されたステップサイズは、約 35.8 ± 0.4 ナノメートルのガウス分布になります。このビデオを見た後、芝生顕微鏡のセットアップを含むフィオナ実験の実施方法をよく理解しているはずです 最良の結果を得るには これらの手順では、床力の使用と実験に対する写真の損傷を最小限に抑えることが重要です。

芝生顕微鏡とフィオナでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には安全ゴーグルなどの予防策を着用する必要があることを忘れないでください。