Name: マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶマウス膵臓からの高品質RNA単離法。リボヌクレアーゼ豊富な組織からRNAインテグリティ数7以上のRNAを迅速に抽出し、遺伝子発現解析に利用可能な実験手法を解説します。

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我々は彼らの有益なコ​​メント、提案やそのプロトコルの共有のため建華玲、レイモンド·マクドナルド、ガルビンスウィフト、ミシェル·グリフィン、ポールGrippoとSatyanarayana Rachaganiに感謝します。この作品は、付与U01CA111294、オハイオ州立大学学内研究プログラムからのアイデア開発賞によってサポートされていました。

1。準備次のプラクティスは機関の動物実験委員会（IACUC）によって設定されたポリシーに準拠しています。 <ol><li>これは、任意の日にはもう6よりもマウスの膵臓を分離することをお勧めします。清潔でオートクレーブし、すべての手術器具、動物あたり1セットがあります。 </li><li>すべてのマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。動物あたり4つの2 mlチューブ。 </li><li>氷上の50ml遠心管中で溶解試薬の8ミリリットルを配置します。注：精製キットは、膵臓の分離に適していますグアニジンチオシアネートフェノール試薬が付属していますが、溶解試薬があるため、分離ごとに必要な大量の使用されています。 </li><li>ホモジナイザーのブレードを洗浄するための15ml遠心チューブに以下の溶液約10mlを分注する。エタノール、70％（2本）、HPLCグレードの水（1管）とアウェイのRNaseの約200μLを含むHPLCグレードの水または同等のリボヌクレアーゼ不活性化。 </li></oL&gt; 2。手術、膵臓の解剖及び均質化<ol><li>コットンガーゼやペーパータオルを含むJARにイソフルラン1〜2mlのを配置します。マウスはイソフルランのソースに到達するのを防止するプラットフォーム上に配置されている。前各マウスを麻酔にジャーに新鮮イソフルランを追加します。 </li><li>優しくイソフルランを含むJARにマウスを置きます。 jarファイルに蓋をし、ゆっくりと前後​​に瓶を回転させることによって、麻酔の効果をモニターする。それはそれ自身で立つことができないになると動物に麻酔をかけている。 </li><li>麻酔の確認のために、ジャーから動物を削除して、しっかりと足指のピンチを適用します。マウスはつま先のピンチに反応しない場合は、2.5に進みます。 </li><li>マウスはつま先のピンチに反応する場合は、ステップ2.3に2.2を繰り返します。 </li><li>腹臥位で作業台の上に、麻酔した動物を配置します。しっかりと、マウスの子宮頸部に左手を置くことで、マウスの子宮頸部を脱臼。私達右手はマウスの尾をつかみ、素早く子宮頸部を脱臼に対して約上向きに45°の角度を引くING。 </li><li> 25ゲージの皮下注射針を使用して、平らな面に動物の四肢のそれぞれを貫通して表面（ペーパータオルで覆われた発泡スチロールのレベルピース）に死体を固定します。 </li><li>無菌手術器具を使用して、開いてすぐにマウスから膵臓を削除マウスの中央部をカット。膵臓を保持し、春のはさみを使用して、脾臓、小腸からそれをカットする鉗子を使用してください。マウスからの除去の間に膵臓を伸ばすないように注意してください。組織の破壊は、リボヌクレアーゼをリリースできた。注：マウスの​​膵臓を削除するのにかかる時間が非常に重要です。当業者は、約1分以下で膵臓を解剖することができるはずです。 </li><li>氷冷溶解試薬の8ミリリットルを含む50ミリリットルチューブに膵臓全体を置きます。チューブに蓋をし、簡単にTIを浸漬振る試薬にssue遅滞なく次のステップに進みます。組織への溶解試薬の比率が非常に重要です。溶解試薬の異なるボリュームを使用して単離されたRNAの完全性の比較の結果の項を参照してください。 </li><li> 5秒間均質化する。これは、組織が効率的な均質化のためにブレードに引き込まれることを可能にする遠心分離管の底部にホモジナイザーブレードを押圧することが重要である。 </li></ol>未消化の組織の3。取り外し注意：均質化に続いて、組織の小さなビットは溶解試薬に残ります。それはすぐに均質化し、RNAのリスク低下を介してではなく、未消化いくつかの組織を残して組織を溶解することがより重要である。 <ol><li>転送2ミリリットルの微量遠心チューブに溶解した膵臓を含む溶解試薬の2ミリリットル。アイソレーションごとホモジネートの2マイクロチューブを収集します。今後の研究のために-80℃で、残りのホモジネートまたはストアを破棄します。 </li><li>セント4℃で、未消化の組織をペレット化する5分間12,000×gでrifuge。これはおそらく、リボヌクレアーゼ（ステップ5.13）で試料を汚染するRNAのその後のソリューションに未消化の組織のキャリーオーバーな​​どの重要なステップです。 </li><li> 2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す上清の1ミリリットル。すぐに分離を進め、将来の使用のために-80℃で複製チューブを格納します。次のステップに進むながら濡れた氷の上にホモジネートを含むすべてのチューブを配置します。 </li><li>適切な化学廃棄物容器に残った溶解試薬を処分。 </li></ol>ホモジナイザーブレードの4。クリーニング<ol><li>次の単離に進む前に、70％エタノール10ml中に置くことにより、ホモジナイザーをクリーニングブレード。刃に巻き込まれることがあり、組織の任意の塊を除去するために20秒程度のためのホモジナイザーをアクティブにします。 </li><li>ホモジナイザーブレードに残っている部分を除去するために200μlのピペットチップを使用してください。 </lI&gt; <li>水、一般的なRNA分解酵素を不活性化し、70％エタノールでの手順を繰り返し4.1。キムワイプクリーンでホモジナイザーシャフトを乾燥させます。 </li><li>残りの動物の膵臓の分離について、手順2.1、むしろRNAをプールとは別の各動物から単離されたRNAを保つ。 </li></ol> 5。RNAの単離次のセクションでは、精製キットプロトコルと同じです。精製キットの利点は、低分子RNAを含む全RNAを単離することである。 <ol><li>凍結したホモジネート溶液を使用した場合、5分間RTでスタンドを濡れた氷の上で解凍してみましょう。 </li><li> 200μlのクロロホルムを加え、チューブにキャップをし、15秒間、手でよく振る。チューブは2〜3分間室温で放置。 </li><li> 12,000 XG、4℃で15分間遠心</li><li>マイクロ遠心チューブに上層の水層を転送します。イソプロパノール1.5ボリュームを追加し、上下に数回ピペッティングしてよく混ぜ。 </li><li> 70まで転送する2 mlのコレクションチューブに配置されているスピンカラムへの試料液の0。室温で15秒間8000×gで蓋をし、遠心分離機を閉じます。 </li><li>フロースルーを捨てる。 </li><li>繰り返してサンプルの残りを使って、5.5から5.6を繰り返します。 </li><li>スピンカラムに700μlのBuffer RWTを追加します。 8,000 X gで15秒間遠心します。フロースルーを捨てる。 </li><li>スピンカラムにピペットで500μlのBuffer RPE。カラムを洗浄するために8000×gで15秒間遠心分離する。フロースルーを捨てる。 </li><li>スピンカラムに500μlのBuffer RPEを追加します。カラムを乾燥するために8000×gで2分間遠心分離する。 </li><li> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムを移す。直接スピンカラム·メンブレンにピペットで80μlのリボヌクレアーゼを含まない水。 RNAを溶出するために8000×gで1分間遠心分離する。 </li><li> RNA溶液に1μlのRNase阻害剤を追加します。 -80℃で保存するか、5.13に進みます。 </li><li> RNAの完全性を検証するために、最初のRNA conceを計算分光光度計を用いてntrationと吸光度比260/280。 </li><li>分子生物学グレードの水で約500 ngの/μlにRNA溶液の一部を希釈する。 </li><li>キャピラリー電気泳動分析を用いてRNA完全性（ すなわち 、RIN）を決定します。 RNA溶液約5μlを分析のために十分である。 </li><li> -80℃でRNA溶液（ 図2を参照）、店舗を分取</li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

リボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを単離することは分子生物学的実験のための大きな課題を表しています。様々な試薬およびキットは、主にRNA抽出のフェノールグアニジンチオシアネート法に基づいているが市販されている。グアニジンチオシアネートは、タンパク質を変性し、このようにリボヌクレアーゼ活性を低下させる。しかし、膵臓リボヌクレアーゼの膨大な大きさは、RNA単離の標準プロトコルへの追加の変更が必要になります。プロトコルは標準のグアニジンチオシアネート法に基づいていること、ここで報告されていな膵臓リボヌクレアーゼ豊富な組織からのRNAの成功を単離するためのいくつかの重要な修正だけでなく、ヒントが含まれています。 RNAを単離するための標準的なガイドラインは、留意されるべきである。これらの技術は、さらに少ないリボヌクレアーゼが豊富な膵臓よりも標本から、RNAの成功の単離に重要である。いくつかの例は、分子生物学グレードのWAを使用することを含むTER、リボヌクレアーゼフリーの消耗品や使い捨てのプラスチック製食器ではなく、ガラス。それは、それぞれの分離の間に手袋を変更することをお勧めします...

高い整合性を持つRNAの単離は、ノーザンブロット法9、定量RT-PCRの1または5の遺伝子発現プロファイリングなどの日常的な分子生物学の実験のために必要とされている。 RNA単離の最も現代的な方法は、グアニジンチオシアネートプロトコル2、3の修正に基づいている。グアニジンチオシアネートは、強力なタンパク質変性剤であり、効果的に、最も条件の下でリボヌクレアーゼの活性を破壊します。をChomczynskiおよびSacchi 3の一般的な方法は、約4時間までの単離時間を短縮する、チオシアン酸グアニジン溶解溶液にフェノールを組み合わせる。多くの市販のRNA抽出試薬をChomczynskiおよびSacchi法3に基づいている。 例えば、ヒトやマウスの膵臓リボヌクレアーゼ多い組織は、RNAを分離するための新たな課題が発生します。マウスの膵臓は、そのうちのいくつかは、ドゥリンリリースされるリボヌクレアーゼ6の75ミリグラムを含有することができるg組織の自己消化、その結果膵臓組織の破壊。グアニジンチオシアプロトコルの改変に成功し、高い完全性2、4、7、10の膵臓からRNAを単離するために使用されてきた。RNA安定化試薬の注入マウスの膵臓中へ、高い整合性4、7、10の一方注入をRNAの単離を容易に膵臓へのソリューションは素晴らしいスキルを必要とし、このような解剖顕微鏡などの特殊な機器を必要とし、処置の間に組織構造を崩壊させることは、細胞溶解の原因となります。 RNA安定化試薬を用いて組織を灌流すると、タンパク質の単離と組織染色など、他のアプリケーションに干渉することがあります。さらに、この技術は、ヒト膵臓からRNAを単離するには適していない。他のプロトコルは、研究者2による特定の溶液の調製を必要とする。 我々は、マウスの膵臓からの高い整合性RNAを単離するためのプロトコルを報告する。目Eプロトコルは、以前に発表された方法の要素を使用しており、大部分は、標準的なフェノール/グアニジンチオシアネート·ベースの溶解試薬プロトコルに基づいています。これは、専門の溶液の調製を必要とせず、また膵臓に試薬の注入を必要としません。成功したRNAの単離のための重要なステップは、未消化組織の除去は、得られたRNA溶液にリボヌクレアーゼ阻害剤の分離および包含を位相の前に、組織比に高いフェノール/グアニジン系、溶解試薬を含む。これらおよび他の変更を使用して、我々は、典型的には、7より大きいルーチン遺伝子発現解析に用いるRINでRNAを単離する。

<table><tbody><tr><td>パワージェネレーション500&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>ホモジナイザー</td></tr><tr><td>5424R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td>冷蔵<td>マイクロセンティフゲ</td></tr><tr><td>トリゾール試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>溶解試薬</td></tr><tr><td>学生バンナス 春はさみ</td><td>フィッシャー</td><td>91500-09&nbsp;</td><td>付着した組織から膵臓を切除するために使用します</td></tr><tr><td>外科用ハサミ、6インチ</td><td>フィッシャー</td><td>08-951-20</td> マウスの鈍い<td></td></tr><tr><td>端の鉗子</td>を切るために使用 <td>フィッシャー</td><td>1381239</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン USP</td><td>アボット ラボ</td><td>4/8/5210</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>薬 Rnase アウト (40 U/&micro;l)</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>一般Rnase不活性化剤</td></tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td>フィ</td><td>ッシャーW5-4</td><td>ホモジナイザーブレードの洗浄用</td></tr><tr><td>分子生物学グレードの水</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>RNAの溶出</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Purification Kit</td></tr><tr><td>2 mlの微量遠心チューブ、認定されたRnase Dnase</td><td>フリーUSA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>15 ml遠心分離管ファ</td><td>ルコン</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>フィッシャー100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%エタノール</td>フィ<td>ッシャー200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;l ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GPL200F</td><td>ホモジナイザーブレードのクリーニング用</td></tr><tr><td>クロロホル</td><td>ムフィッシャー</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ</td><td>サーモ</td><td>ND-1000</td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>バイオアナライザー</td><td>アジレント</td><td></td><td>キャピラリー電気泳動アナライザー RNAインテグリティ</td></tr><tr><td>を測定する RNAlater</td><td>Ambion</td><td></td><td>RNA 安定化試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasyの&nbsp;スピンカラム&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Spinカラム&nbsp;miRNeasy Miniキットの一部として</td></tr>、<tr><td>マウス</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL/6</td><td>彼らの年齢は4ヶ月から12ヶ月の範囲でした。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス&nbsp;</td><td>ジャクソンラボ</td><td>129株</td><td>彼らの年齢は4ヶ月から12ヶ月の範囲でした。&nbsp;</td></tr></tbody></table>

マウス膵臓からのrnaの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

マウスの膵臓のようなリボヌクレアーゼに富んだ組織からの高品質なRNAの単離は課題を提示します。 膵臓の主な機能は消化を助けることであるため、マウスの膵臓には75mgのリボヌクレアーゼが含まれている可能性があります。 マウス膵臓からRNAを単離するための標準的なフェノール/グアニジンチオシアン酸溶解試薬プロトコルの改変を報告します。 グアニジンチオシアン酸塩は強力なタンパク質変性剤であり、ほとんどの条件下でリボヌクレアーゼの活性を効果的に妨害します。 しかし、リボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを成功裏に単離するためには、標準的なプロトコルに重要な変更を加える必要があります。 主なステップには、溶解試薬と組織比が高いこと、相分離前の未消化組織の除去、RNA溶液へのリボヌクレアーゼ阻害剤の包含などがあります。 これらの修飾やその他の修飾を使用して、RNA Integrity Number(RIN)が7を超えるRNAを日常的に単離します。 単離されたRNAは、日常的な遺伝子発現解析に適した品質です。 膵臓以外のリボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを単離するためのこのプロトコルの適応は、容易に達成可能であるべきです。

溶解ホモジネートの1ミリリットルからの全RNAの収量は20〜40μgのです。 OD 280分の260の比率は、典型的には約2.0であり、RINは7.0よりも一貫して大きい。 RINは6≤されている場合は、アイソレーションが繰り返される必要があります。時々、8.0より高いRINが達成される。 前膵臓の除去にマウスを安楽死させる2つの最も一般的に使用されている方法は、CO 2窒息またはイソフルランの吸入である。両方の技術は、頸椎脱臼に続いている。それは、化学剤及び/又は処置時間は、RNAの完全性に影響を与える可能性があることが可能であるので、マウス膵臓RNAのRINは、両方の技術を用いて単離し比較した。マウスをCO 2窒息またはイソフルラン吸入を用いて麻酔した。両方の技術は、頸椎脱臼により追跡した。動物を麻酔の際には、事前の頸椎脱臼にisoflに比べて、CO 2窒息のために、約1から2分長かったurane。イソフルランの吸入後単離したRNAは、CO 2窒息のための2.2±0.3のRIN（P &lt;...

リボヌクレアーゼに富むマウスの膵臓から高い完全性でRNAを単離する手順を報告します。

マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

この手順の全体的な目標は、リボヌクレアーゼリッジマウスの膵臓から高い完全性でRNAを単離することです。これは、安楽死させたマウスの死骸から膵臓を迅速に除去することによって達成されます。次に、膵臓を溶解試薬に沈め、組織を均質化します。遠心分離後、標準プロトコルを使用して上清からRNAを単離し、RNA阻害剤溶液を最終RNA溶液に添加します。最後のステップは、ホモジナイザーブレードに引っかかった組織の塊を取り除き、一連のエタノールと水洗浄を実行して、ホモジナイザーブレードを慎重に洗浄することです。最終的に、この手順により、RNA完全性数が7を超えるマウス膵臓のRNAを単離し、ルーチンの遺伝子発現解析に使用できるようになります。私の名前はトム・シュミットで、20年以上にわたってRNAに取り組んできましたが、これまでマウスの膵臓に対して高い完全性でRNAを単離することほど難しいことは経験したことがありません。私たちがお見せする技術は、マウスの膵臓のために開発されましたが、実際には、ヒト細胞の組織、細胞株、または脾臓などの肋骨ヌクレアーゼが豊富な組織を含むマウスの他の組織を含む、他のさまざまな組織に使用できない理由はありません。このプロトコルの提案を使用すると、マウスの膵臓から高い完全性でRNAを単離することができます。これは、QPCR、遺伝子発現アレイ、RNA-Seqなど、多くのダウンストリームアプリケーションに使用できます。オラ・エルガマル。私の研究室の上級大学院生は、テキストプロトコルで説明されているようにマウスを安楽死させた後、この技術を実演します。無菌の手術器具を使用して、25ゲージの皮下注射針を使用して、動物の4つの足のそれぞれを平らな面に突き刺して、死体を固定します。マウスの中央部を切り開き、マウスから膵臓をすばやく取り除きます。鉗子を使って膵臓を保持し、スプリングハサミを使用して脾臓と小腸から膵臓を切り取ります。マウスから取り外すときに膵臓を伸ばさないように注意してください。組織の破壊はリボヌクレアーゼを放出する可能性があります。8ミリリットルの氷冷溶解試薬を保持した50立方センチメートルのチューブに膵臓全体を入れます。チューブにキャップをして短時間振とうし、組織を試薬に浸し、すぐに遅滞なく次のステップに進みます。次に、膵臓を5秒間均質化します。ホモジナイザーのブレードを遠心分離管の底に押し付けて、組織をブレードに引き込むことで効率的な均質化を実現することが重要です。未消化の組織を除去するには、溶解した膵臓を含む2ミリリットルの溶解試薬を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。4°C、12、000倍Gで5分間の分離遠心分離機ごとにホモジネートの2つのマイクロ遠心分離チューブを収集し、未消化組織をペレット化します。未消化の組織が後続のRNA溶液にキャリーオーバーすると、サンプルがリボヌクレアーゼで汚染される可能性があるため、これは重要なステップです。ホモジナイザーブレードを10ミリリットルの70%エタノールに入れて洗浄します。ホモジナイザーを約20秒間作動させて、ブレードに引っ掛かっている可能性のある組織の塊を取り除きます。次に、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、ホモジナイザーブレードに残っている破片をすべて取り除きます。ホモジナイザーブレードを水、一般RNA syn活性化剤、および70%エタノールで再度洗浄します。最後に、ホモジナイザーシャフトをきれいなキムワイプで乾かします。SNAの1ミリリットルを2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。ホモジネートを含むすべてのチューブを湿った氷の上に置いて、次のステップに進みます。すぐにRNA単離を進め、レプリケートチューブをマイナス80°Cで保存しておいて、後で使用できるようにしてください。残りの溶解試薬は、適切な化学廃棄物容器に廃棄します。次のセクションでは、RNA精製キットを使用します。精製キットの利点は、低分子RNAを含む全RNAを単離できることです。ホモジネート溶液に200マイクロリットルのクロロホルムを添加して単離を開始します。チューブにキャップをし、手で15秒間激しく振ってください。次に、チューブを室温で2〜3分間、遠心分離後15分間、Gと摂氏4度で放置します。上部水層をマイクロ遠心チューブに移します。1.5容量のイソプロパノールを加え、数回ピペッティングして完全に混合します。最大700マイクロリットルのサンプルをスピンカラムに移し、2ミリリットルのコレクションチューブに入れます。ふたを閉め、室温で 8, 000 倍の G で 15 秒間遠心分離し、流れを捨てます。次に、700マイクロリットルのバッファーRWTをスピンカラムに加え、遠心分離機にかけます。前回と同様に、ピペット500マイクロリットルのバッファーRPEをスピンカラムに流し込み、再度遠心分離してカラムを洗浄します。流れを捨てた後、8,000回で2分間スピンカラム遠心分離機に別の500マイクロリットルの緩衝RPEを加え G.To カラムを乾燥させ、スピンカラムを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブピペット100マイクロリットルの肋骨核フリー水に直接スピンカラム膜遠心分離機に1分間8で移します。 Gを000倍溶出させると、RNA。次に、RNA溶液に1マイクロリットルのRNA阻害剤を添加し、テキストプロトコルに記載されているように、キャピラリー電気泳動分析を使用してRNAの完全性を決定するに進みます。マウス膵臓から単離されたRNAのRNA完全性数またはRINを比較すると、均質化に使用される溶解試薬の量とRNAの完全性との間に直接的な相関関係が明らかになります。結果は、このプロトコルでは、リボヌクレアーゼ阻害剤をRNAの水溶液に添加し、凍結融解時にRNAの完全性を比較した。阻害剤を含有するRNA溶液のRINは、阻害剤を含まない溶液の2.9±0.65に対し、7.3±0.15であったため、凍結融解を繰り返すことでリボヌクレアーゼ阻害剤が変性して効果がなくなる可能性を検討しました。リボヌクレアーゼ阻害剤を含むRNAの溶液を試験した。5回まで凍結融解したRNA溶液は、それでも7以上のRINを生成しました。これらの溶液を6回以上凍結融解した溶液は、ランダムプライム7未満でRINを生成しましたが、RNAからCDNAを合成し、3つのハウスキーピング遺伝子の発現をQPCRで測定しました。標準的な技術を使用して、データは標準的な分子生物学的手法におけるマウス膵臓RNAの成功した使用を検証します。適切なトレーニングを受ければ、大学院生やポスドクは、このテクニックを約30分で完了できるはずです。そして、私たちがそれをどのように使用しているかについて少しお話ししたいと思います。私たちは膵臓がんのトランスジェニックマウスモデルを研究しており、この技術を使用してRNAを単離しています。そして、RNAを入手したら、これらの動物におけるマイクロRNAの遺伝子発現を研究することになります。

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JoVE Journal

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生物学

マウス膵島単離

マウス膵島分離の詳細な説明はコラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製組み合わせのin...

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

ここでは、2型糖尿病のマウスモデルから膵島を分離するためのプロトコル、Leprdb、および2光子顕微鏡を利用した無傷の膵島からのインスリン分泌を測定するための生細胞アッセイの詳細を紹介します。...

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。...

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

我々は、新生児マウスから無傷の膵島を単離するために、本明細書のプロトコルを記述します。膵臓は、部分的に洗浄し、ハンドピッキング続いて、コラゲナーゼで消化しました。 20から80膵島クラスタは、いくつかの島の研究に適しており、新たに生まれたマウスから膵臓ごとに取得することができます。...

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

この島分離プロトコルは、外分泌組織を消化するコラゲナーゼ注射の新しい経路と、マウスから島を精製するための簡略化された勾配手順を説明した。これは、酵素消化、勾配分離/精製、およびアイレット手摘みを含みます。分離に成功すると、マウスあたり250~350の高品質で完全に機能する島が生じます。...

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。...

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

単離されたRNAの純度と完全性は、RNA依存アッセイにおいて重要なステップです。ここでは、少量の損傷を受けていない膵臓組織からRNAを抽出する実用的で迅速かつ安価な方法を提示する。...

ラット膵臓組織の迅速かつ費用対効果の高いRNA抽出

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。...

マウス膵臓内皮細胞の単離

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

学ぶマウス膵臓からの高品質RNA単離法。リボヌクレアーゼ豊富な組織からRNAインテグリティ数7以上のRNAを迅速に抽出し、遺伝子発現解析に利用可能な実験手法を解説します。

マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織

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