解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫から想像上の椎間板を解剖することです 免疫組織化学の場合、これは最初に口、フック、目、眼椎間板、および脳からなる頭部複合体を幼虫から除去することによって達成されます。2番目のステップは、ヘッドコンプレックスを固定し、一次抗体と二次抗体とインキュベートすることです。次に、眼椎間板と腱椎間板を頭部複合体から分離します。

最後のステップは、スライドガラス上に漂白防止剤で架空のディスクを取り付けることです。最終的には、蛍光またはLAC Zレポーターと抗体染色により、蛍光顕微鏡を用いて、想像上の組織内の遺伝子やタンパク質の空間的および時間的発現を明らかにすることができます。ただし、この手法を使用して、仮想ディスク内の遺伝子とタンパク質の局在に関する洞察を得ることができます。

また、翼の脚などの他の想像上の組織に適用したり、停止させたりすることもできます。ここは。実験を開始するには、35ミリメートルのペトリ皿に解剖バッファーを満たします。10〜20匹の幼虫をペトリ皿に入れ、5分間泳ぎ回

害虫を駆除するために、ピペットはシリコンベースの解剖プレートの中央に解剖バッファーの大きなプールを1つ作成します。大きなプールを囲むように3つの小さなプールを配置し、鉗子を使用して幼虫を底のプールに移します。次に、5番の鉗子を使用して、洗浄された単一の幼虫を小さなプールから大きな解剖バッファーのプールに移します。

粗い解剖を開始するには、一方の鉗子を使用して口のフックをつかみ、もう一方の鉗子のペアを使用して幼虫を優しくつかみます。3分の1で、体長が口のフックをしっかりと保持しています。2組目の鉗子で体の残りの部分をすばやく引き離します。

幼虫を鉗子から離し、腸がこぼれるのを待つことで、想像上の椎間板が正常な状態に保たれるようにします。次に、マウスフックをつかみ、もう一方の鉗子を使用して、内側の腸を含む幼虫の下部3分の2を取り除きます。次に、唾液腺、脚椎間板、その他の組織をやさしく取り除きます。

残るべき組織は、上に横たわっている少量のキューティクルだけです。口のフック、目と腱の椎間板、脳半球、腹側神経節。最大20分後、解剖したすべての組織をパラフォームアルデヒドリジンパリアに移します。

日付固定剤またはPLP。想像上の椎間板を解剖バッファーに20分以上放置しないと、解剖後に劣化します。解剖した組織を100マイクロリットル刻みで冷たいPLPが入った時計ガラスに移します。

一対の鉗子を使用して、解剖された組織が完全に水没していることを確認します。解剖した組織を冷PLP固定液で室温で45分間攪拌せずにインキュベートします。次に、PLPから100マイクロリットルの解剖組織を洗浄バッファーに移します。

組織が完全に沈んでいることを確認し、攪拌せずに室温で45分間インキュベートします。次に、解剖した組織を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。洗浄バッファーを取り外し、100マイクロリットルのブロッキング溶液と交換します。

組織を室温で、卓上回転子上で穏やかに回転させながら10分間インキュベートします。ブロッキング後、溶液を取り出し、10%正常ヤギ血清中の100マイクロリットルの一次抗体溶液と交換します。抗体の強度に応じて、組織を室温で穏やかに回転させながら16時間インキュベートします。

次に、一次抗体を取り出し、750マイクロリットルの洗浄バッファーと交換します。チューブを室温でミューテーターに10分間置きます。ミューテーターからチューブを取り外し、ヘッドがチューブの底に落ち着くまで待ちます。

次に、洗浄バッファーを取り出し、10%正常血清に100マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。チューブを室温で静かに回転させながら、抗体の強度に応じて少なくとも2時間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を組織から取り出します。

500マイクロリットルの洗浄バッファーと交換し、組織をチューブの底に沈殿させます。シリコン解剖プレート上に3つの洗浄バッファープールを置きます。解剖したすべての組織を、解剖皿に置かれた洗浄バッファーの大きなプールに移します。

これにより、余分な二次抗体を除去して細かい解剖を開始し、頭部複合体の腹側を下にして置き、キューティクルを口のフックで留めることができます。脳と目の椎間板の間のスペースに2番目の鉗子のペアを置き、脳を口のフックからすばやく引き離して、口のフックを保持し続けながら2つの脳葉を取り除きます。アイアンテナディスクのアンテナ部分とマウスフックの間の接続部にできるだけ近づけて、ティッシュをつまんでください。

必要な組織がすべて解剖されるまで続けます。次に、カバースリップのサイズのティッシュペーパーを2枚、3インチ離して解剖皿に追加します。これらの紙の上にスライドガラスを置き、スライドが解剖皿のシリコンベースにくっつかないようにします。

P 20ピペットの男性を使用して、ガラス顕微鏡スライドの中央に9マイクロリットルの漂白防止剤を追加して、同じカットされていない先端で組織の蛍光光漂白を防ぎ、すべてのIディスクとtenalディスクを集めて、漂白防止試薬のドロップに追加します。次に、鉗子を使用して、想像上の椎間板が触れなくなるまで、漂白防止試薬の滴内で目と腱の椎間板を分離して広げます。細いペイントブラシを使用して、漂白防止剤の滴にカバースリップをそっと下げ、気泡の形成を防ぎます。

最後に、スライドをマイナス20°Cで保存し、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用してイオンテナールディスクを観察し、イメージングする準備が整います。この方法は、これらの仮想ディスクの共焦点画像によって伝えられる分析用の高品質の材料を確実に生成します。椎間板は、fアクチンに結合して各細胞の輪郭を描くフォイドおよび結合型フルオロ4で処理されました。

内膜椎間板の最も顕著な特徴の1つは、背側腹軸に沿って走る組織内のくぼみとして見ることができる形態形成溝です。溝が眼球を横切って進行するにつれて、無秩序な細胞の海は、周期的に間隔を空けたユニットアイまたはオマテディアの秩序ある配列に変換されます。クローン発現の検証とI想像円板の解析は、この方法の下流への応用が可能です。

上の3つのパネルには、ilis、A DPP、LAC Z転写レポーターなどのさまざまな抗体と、汎ニューロンのRNA結合タンパク質をコードする胚性、致死性、異常性視力、vyなどの細胞特異的マーカーで染色されたディスクが表示されます。下の3つのパネルは、GFPを使用して細胞の集団をマークするディスクを示しています。コースをマスターすると、10〜20匹の幼虫からの頭部複合体の単離には約10分かかり、さらに、これらの複合体からのイオンテナールディスクの微細な単離にも約10分かかります。