Name: 解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶキイロショウジョウバエの成虫原基解剖と免疫染色法。蛍光顕微鏡を用いて遺伝子・タンパク質の発現パターンを可視化し、発生生物学における組織決定と細胞運命の理解を深める実験手法です。

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私たちは、JPK、元原基の解剖手順を教えるためのドナルドレディとケビンモーセに感謝したいと思います。また、 図1（b）の性器ディスクと抗体については図2（a）、図3のためにブランドンWeasner、フライの汚れのためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターと発達研究ハイブリドーマバンクの目のディスクのボニーWeasnerに感謝します。 CMSは、国立衛生研究所（NIH）GCMSトレーニンググラント（T32-GM007757）、フランク·W·パトナム研究フェローシップ、そしてロバート·ブリッグス研究員からの奨学金によってサポートされています。 JPKは国立眼研究所からの助成金によってサポートされている（R01 EY014863）

幼虫の調製<ol><li>解剖バッファーで35ミリメートルペトリ皿を埋める。 </li><li>ペトリ皿に幼虫を置き、それらを数分間（セルフクリーニング工程）の周りに泳ぐことができます。 </li><li>シリコーン系解剖板に解剖バッファーのプールに幼虫を転送します。このプールは、プレートの一方の端にあるべきである。解剖板はガラスシャーレ内注入し、硬化したシリコーン溶液で構成されています。 </li><li>パスツール·ピペットを用いて、解剖プレートの中央に解剖バッファの大きなプールを配置します。 </li><li> ＃5鉗子を使用して、解剖バッファの大きなプールに小さなプールから単一の清掃幼虫を移す。 </li></ol>幼虫の2。粗い解剖<ol><li>幼虫は解剖バッファーの大きなプールの中にある間にピンセットで幼虫を握る。鉗子の他のペアがアニムを保持するために使用される鉗子の一組は、口フックをつかむために使用されるべきであるまだら（1月3日体長穏やかに幼虫をつかむ）。 </li><li>すぐに鉗子の第二の対を廃止本体の残りの部分を引っ張りながら、口のフックの近くでキューティクルを含む一対の鉗子を安定保持します。 </li><li>幼虫は引き裂くし始めると、あなたは緊張のわずかな解放を感じるだろう。鉗子から幼虫を放し、こぼれにする幼虫の &quot;根性&quot;を可能にします。これは成虫が通常の立体配座に留まることを可能にし、変形することを防ぎます。 </li><li>鉗子の1対の場所で幼虫の先端部を保持するために、再び口のフックを持ってください。鉗子の他のペアを使用すると、内側の内臓を含めた幼虫の下部3分の2を削除します。注：口のフック、アイ触角ディスク、脳半球、腹側神経節、唾液腺、いくつかの脚ディスク、およびその上のキューティクルを含む複合体が残ります。 </li><li>ピンセットでそっとキューティクル、唾液腺、脚ディスクを覆う取り外し、他の組織。注：残るべき唯一の組織は、口のフック、アイ触角ディスク、脳半球、および腹側神経節（ 図3）である。 </li><li>繰り返します15〜20分間の追加の幼虫を2.1から2.5を繰り返します。注：より長期間解剖バッファーに残って成虫が低下する傾向があり、最終的に撮影するのに理想的な試験体よりも小さいとして表示されます。このように、20分の最大後に全ての解剖した組織は、（下記参照）のPLP固定液に転送する必要があります。 </li></ol>抗体を用いた3。固定および組織の染色<ol><li> P-200ピペットマンを使用して、冷たいパラ - リジン - 素酸（PLP）固定液を含む時計皿に解剖した組織を移す。 50μlのに移し解剖バッファの限界容積がPLPの希釈を最小限にする。先端開口が解剖した組織を収容するのに十分な大きさであるように、カミソリの刃で先端をカットしてください。ピンセットを使用したか、タングステン針を切開した組織が完全に適切な固定が起こるようにするために沈めていることを確認します。 45分間冷たいPLP固定液中で解剖した組織をインキュベートする。このインキュベーションは撹拌せずに室温で行うことができる。 </li><li> P-200ピペットマンを使用して、45分間の別のカット黄色のチップを使用してバッファ（RT）を洗浄するために解剖した組織を移す。 50μlのに移しPLPの限界容積が洗浄緩衝液の希釈を最小限にする。注：すべての解剖した組織を完全に沈めなければならない。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブに解剖した組織の20〜30セットを転送します。注：アイ触角複合体のより大きな数がチューブ内で結合している場合、チューブの底の組織を抗体に適切に曝露されない可能性がある。最適な結果を得るためにはせいぜい20〜30人目触角複合体は、単一の管内に存在してはならない。解剖した組織は、マイクロチューブの底に沈殿します。そのため、後工程でのuの削除し、洗浄緩衝液、ブロッキング溶液、および抗体を交換するピペットマンをSE。 </li><li>洗浄バッファーを削除し、ブロッキング溶液100μlで置き換えます：洗浄緩衝液中10％正常ヤギ血清。 10分間、卓上回転装置上で穏やかに回転しながら室温でインキュベートする。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、適切に10％正常ヤギ血清中で希釈された一次抗体を100μlと交換してください。 16時間穏やかに回転しながら室温でインキュベートする。 </li><li>一次抗体を取り出し、洗浄バッファー750μlのと交換してください。場所チューブニューテーター上で10分間室温で章動させることを可能にする。注：一次抗体（4℃で保存）保存し、後で再利用することができます。複数回の抗体を再利用する非特異的結合を減らすのに役立つ。 </li><li>ヘッドはその後、チューブの底に沈殿の洗浄緩衝液を除去し、適切に10％正常血清中で希釈された二次抗体を100μlを追加することができます。 2̵穏やかに回転させながら、室温でインキュベートする1; 4時間。 </li><li>組織から二次抗体溶液を取り出し、洗浄緩衝液500μlと交換してください。組織がチューブの底に沈殿することを許可する。 </li><li> P-200およびカット黄色のチップを用いて、解剖皿に置かれた洗浄緩衝液のプールにすべての解剖組織を移す。細かい解剖の次のステップに進む一方で、組織は、洗浄緩衝液中でインキュベートします。これは、過剰な二次抗体を除去するのに役立ちます。 </li></ol> 4。アイ触角複合体の微細解剖及びスライド上にマウントする<ol><li>下向きの複合体の腹側で口フックによりキューティクルを握るために鉗子の一組を使用してください。鉗子の第二の対では、脳と目のディスクの間の空間にします（ 図3、赤矢印）を第二の鉗子を閉じて速やかに口のフックから離れて脳を引いて2脳ローブを削除します。 </li><li>口のフックに押したまま、ピンチオフアイ触角の触角部分と口のフック（ 図3、青色の矢印）との間の接続にできるだけ近い組織。注：アイ触角錯体は、すべての組織（ 図1A）があってはならない。スライド上に配置することができたいすべての所望の組織を解剖されるまで続けます。このプロトコルは、翼、平均棍、脚および性器成虫（ 図1B-E）を単離するために適合させることができる。 </li><li>ティッシュペーパー（カバーガラスのサイズ）の2つの小片を約3インを追加します。離れて解剖皿に。皿の上にガラススライドを置きます - ティッシュペーパー2枚のスライドの端の下でなければなりません。これは解剖皿のシリコーンベースに付着するスライドを防ぐことができます。 </li><li>ノーカットチップでP-20を使用して、顕微鏡用スライドガラスの中央に抗漂白剤の9μlを添加する。蛍光で見たときにこれは、組織の漂白を防ぐ軽い。 </li><li>同じノーカットチップを使用して、すべての目を触角ディスクを収集し、抗漂白試薬の滴に追加します。引き継がれ、洗浄緩衝液の量を最小限に抑えます。 10μlの以下の洗浄緩衝液の量を制限してみてください。 </li><li>抗漂白試薬の滴内に目を触角ディスクを分離し、広げるためにピンセットを使用してください。ディスクが数分間抗漂白試薬にインキュベートすることを許可する。注：組織は抗漂白試薬を吸収するようにディスクが明確になります。 </li><li>細かい絵筆を使って静かに試料上にカバースリップを下げる。これは、気泡の形成を防止する。 </li><li> Storeは光や蛍光顕微鏡を使用して人目を触角や他の成虫を表示する直前まで、-20℃でスライドする。 </li></ol>

<ol><li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria%5BTitle%5D)+AND+%22Zeit.+Wiss.+Zool%22%5BJournal%5D)">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.</li>
<li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22Imaginal+disc+development%22">Imaginal disc development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).</li>
<li>Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+LI+%22Developmental+and+Cell+Biology+Series%22">Developmental and Cell Biology Series</a>. 39, Cambridge Press. 460(2002).</li>
<li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Linn.+Soc.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.</li>
<li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li>
<li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Entomol.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li>
<li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage%2C+growth%2C+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).</li>
<li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster%3A+morphogenesis%2C+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).</li>
<li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+polyclones+in+insect+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li>
<li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li>
<li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Archive%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My+what+big+eyes+you+have%3A+how+the+Drosophila+retina+grows%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li>
<li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li>
<li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li>
<li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3%27+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li>
<li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li>
<li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li>
<li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li>
<li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless%2FPax6+to+control+eye+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この手順は、主に目を触角ディスクの単離およびその後の治療に焦点を当ててきたが、それは翼、平均棍、足や性器ディスク（ 図4）を単離および分析するために使用されることに適している。 （目を触角ではなく）これらのディスクを分離するためのプロトコルの唯一の必須修正は、粗い解剖（プロトコルのセクション2）の方法である。第一胸椎の脚（T1）のペアは、幼虫の前で見られると目を触角の分離のためのプロトコルに従うことによって回収することができる。しかし第二胸椎の脚（T2）ディスクはクチクラに取り付けられている。鉗子の別のペアは、動物の腹側キューティクルを握るために使用する必要がありながら、（上述のように）一対の鉗子口のフックを保持するために使用されるべきで、これらのディスクを単離するために（から幼虫約3分の1を握るようにしてください口のフック。幼虫は、単純にLARの残りの部分から離れて腹キューティクルを引き裂くことによってフィレットすることができますVA。 T2は脚がキューティクルに付着したままになります。第三の胸部（T3）の脚も、キューティクルに装着され、それ自体複合体の一部として翼と平均棍のディスクに取り付けられてい...

一世紀以上ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエの場合は、開発、行動や生理機能を研究するための最高のシステムとなっている。成虫1-3と呼ばれる単層の上皮内後者の撮影場所の多くで胚および後胚：ハエにおける開発は、二つの大きな段階に分けることができる。 成虫の図面は最初の昆虫開発1の彼の広範な研究論文の一部として8月ワイスマンによって1864年に出版された。これらのディスクは、1〜14のフライ 、大人内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせ、最終的には初期の蛹の段階の大規模な組織分解を生き残る、と、幼虫の段階でパターニングして、胚形成の間彼らの開発を開始。幼虫の開発中に各ディスクには運命、形状やサイズに関するいくつかの重要な決定を行う。第一及び第二の幼虫齢の中では、ディスクはestablisは、原発運命を採用する使命を帯びている正確な形状を採用し、セル15〜16の必要な数を生成し、コンパートメントの境界を興。第三の幼虫齢と初期のプレ蛹段階では、成虫は分裂を続け、細胞がそれらの端末の運命16を採用するようにパターニングする。 ショウジョウバエ発生生物学の初期の歴史の中で、成虫は正常な発達との関連で、損失または機能獲得変異体が生存された限られたケースではほぼ独占的に研究した。幼虫および成体組織内の細胞クローン中で分析される致死突然変異のために許可された有糸分裂組換えを誘導するX線の使用。この方法は、幼虫および成体の両方の組織における損失と機能獲得型突然変異を分析するためにトランスジェニック法の導入により改善されている。野生型および変異型の組織の分子景観を説明するための抗体の転写レポーターおよびタンパク質トラップの数も定数であるantly成長。損失を分析し、機能獲得型変異細胞クローンするために、これらの分子マーカーを使用すると、突然変異細胞は、発達中にその野生型いとこから逸脱方法のリアルタイムの理解を得ることがますます可能になった。適切にこれらのツールおよび試薬を利用するためには、閲覧撮影し分析することができる成虫の高品質の製剤を有することが重要である。この原稿の目標は、目を触角複合体（ 図1A）の単離および調製のための最適化されたプロトコルを提供することです。また、正常翼、平均棍、T1-T3脚および性器（ 図1B-E）を生じるものを含む追加のディスクの多種多様な単離することができる。この手順は、わずかな変更で、ほぼ80年間、 ショウジョウバエ成虫を単離するために使用されている。 ほとんどの遺伝子は、ミュー中に発現されているので、上記のように発達段階ltipleおよび組織の多数では、動物が三齢幼虫期前によく死ぬようにヌル変異体が眼全体に与える影響を研究するために、多くの場合不可能です。 4つの方法は、網膜などの先進の組織の研究は著しくより扱いやすくなりました。最初は、そうでなければ、野生型組織17-19内の変異体細胞クローンを生成するフリッパーゼ（FLP）/フリッパーゼ換えターゲット（FRT）メソッドです。この場合、変異体組織は、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような視覚的なマーカーの非存在により識別され、GFPの存在する周囲の野生型組織（ 図2D）と比較することができる。二つ目は、導入遺伝子が細胞20の集団において発現している「FLPアウト」方式である。この場合、細胞クローンは、GFPレポーターを欠いている周囲の野生型組織（ 図にGFPの存在によって同定され、比較される2E）。第三は、FLP / FRT突然変異体クローンとFLPアウト発現システム21の要素を組み合わせた抑制性細胞マーカー（MARCM）技術とモザイクの分析である。この方法では、導入遺伝子を同時に個体の遺伝子座のための突然変異体である細胞の集団内で表現することができる。 FLPアウトクローンと同様に、MARCMクローンは、GFPの存在によって同定およびGFPマーカー（ 図2F）を欠いている周囲の野生型組織と比較している。最後に、遺伝子及びRNAi構築物は、特異的プロモーター-GAL4構築物の制御下成虫組織内で発現させることができる。変異または過剰発現クローンまたはパターンが直接隣接野生型組織と比較することができるので、これらの4つの方法は、成虫の研究に関心が高まっている。この手順に記載された方法が開発されているように、ショウジョウバエでは、成体組織の後胚発生を研究、研究者、特に目を触角から誘導されるものが、分析のために高品質の組織を得ることができるであろう。個別の研究者は、わずかな変更を行ってきたが、（私たちはここで説明する）この手順のコアは、大部分が変更されていないままである。高品質の組織を得ることが私たちは、この書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは貴重な教育資源として役立つことを願ってい成虫の研究に重要であることから。

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>184 SIL ELASTキット0.5 KG</td><td>解剖プレートのベースを作成するために使用されます</td></tr><tr><td>Pryexガラスペトリ皿 150 x 20 mm</td><td>ダウコーニング</td><td>3160-152CO</td><td>解剖プレート</td></tr><tr><td>#5 解剖鉗子</td><td>テッドペラ</td><td>525</td><td>鉗子は非常に鋭利に保つ必要があります</td></tr><tr><td>9ウェルウォッチガラス</td><td>Vairousベンダー</td><td></td><td>想像上のディスク複合体の固定に使用</td></tr><tr><td>50ml 三角フラスコ</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小さな攪拌棒</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>三角フラスコに収まるほど小さい</td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mlのマイクロフュージチューブ</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>アプリケーションに応じてクリアまたはダーク</td></tr><tr><td>マイクロフュージラック</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップローテーター</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td>100 &#956;l容積は低い設定で飛び散るべきではない</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>マクロンの化学薬品</td><td>2-26555-1</td><td>固定剤として役立つ</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>解剖および洗浄緩衝液を作るために使用される</td></tr><tr><td>Nadium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>解剖および洗浄緩衝液を作るために使用される</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics 125221000</td><td></td><td>固定液に使用</td></tr><tr><td>過ヨウ素酸ナトリウム</td><td>シグマケミカル社</td><td>S-1878</td><td>固定液に使用</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>EMDケミカル</td><td>ズMTX1568-1</td><td>虚円板の穿孔に使用</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>EMサイエンス</td><td>SX0593-3</td><td>パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>100%正常ヤギ血清</td>を溶解 <td>ジャクソン研究所</td><td>005-000-121</td><td>ブロッキングソリューションとして機能します</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td>メーカーの指示に従って10%ヤギ血清で希釈します</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td>メーカーの指示に従って10%ヤギ血清で希釈します</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>分子プローブ</td><td>H-1000</td><td>サンプルの漂白を防ぎます</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ 18 x 18 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプティッシュ</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>ガラススライドがシリコンベースに付着するのを防ぎます</td></tr><tr><td>パニットブラシ 000</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>サンプルにカバースリップを優しく下げるために使用します</td></tr></tbody></table>

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

ショウジョウバエにおけるポスト胚発生のかなりの部分、 キイロショウジョウバエは 、成虫と呼ばれる袋状構造のセット内で行われます。これらのディスクは、大人のハエ内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせる。ここでは、これらのディスクを回復し、抗体、転写レポーターとタンパク質トラップを用いた分析のためにそれらを準備するために最適化されたプロトコルを記述します。この手順では、成虫のような薄い組織に最も適しているが、簡単にそのような幼虫の脳と大人の卵巣厚い組織に使用するために修正することができます。書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは3齢幼虫、組織の固定、および抗体と成虫の治療の切開を介してリーダ/ビューアをご案内いたします。プロトコルは、同様に若い第一及び第二齢幼虫から成虫を分析するために使用することができます。このプロトコルの利点は、比較的短く、それがいることである解剖した組織の高品質保持のために最適化が備わっています。別の利点は、使用される固定手順ショウジョウバエタンパク質を認識する抗体の圧倒的な数でうまく動作することである。われわれの経験では、この手順ではうまく機能しない敏感な抗体の非常に小さな数があります。このような状況では、救済策は、私たちが解剖工程および抗体インキュベーションのために記載されているガイドラインに従うことを継続しながら、代替の固定カクテルを使用することであるように思われる。

確実に上述した方法は、その場プローブ 、転写レポーター、タンパク質トラップおよび抗体中での分析のための高品質の素材を生成します。 図1では、私たちが日常的にこの方法で回収されたアイ·アンテナ、性器、翼、平均棍と脚のディスクを表示します。これらのディスクは、F-アクチンに結合し、従って、各セルの概要を説明ファロイジン結合体化フルオロフォアで処理した。組織はその後、適切に目のディスクの形態形成溝を固定されている場合は、生殖器における同心の組織襞の縁、触角、脚ディスク、翼と平均棍ディスクの背腹軸はすべてシャープなエッジを表示されます。組織が ​​適切に固定されている場合は、抗体、蛍光タンパク質およびin situプローブにおいても、シャープなパターンを明らかにする。いくつかの例が図2に示されている。ながら異なる抗体で染色された上部つのパネルディスプレイディスク下位3のパネルは、GFPは、細胞の集団をマークするために使用されるディスクを示す。 <p class="jove_cont...

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫から想像上の椎間板を解剖することです 免疫組織化学の場合、これは最初に口、フック、目、眼椎間板、および脳からなる頭部複合体を幼虫から除去することによって達成されます。2番目のステップは、ヘッドコンプレックスを固定し、一次抗体と二次抗体とインキュベートすることです。次に、眼椎間板と腱椎間板を頭部複合体から分離します。最後のステップは、スライドガラス上に漂白防止剤で架空のディスクを取り付けることです。最終的には、蛍光またはLAC Zレポーターと抗体染色により、蛍光顕微鏡を用いて、想像上の組織内の遺伝子やタンパク質の空間的および時間的発現を明らかにすることができます。ただし、この手法を使用して、仮想ディスク内の遺伝子とタンパク質の局在に関する洞察を得ることができます。また、翼の脚などの他の想像上の組織に適用したり、停止させたりすることもできます。ここは。実験を開始するには、35ミリメートルのペトリ皿に解剖バッファーを満たします。10〜20匹の幼虫をペトリ皿に入れ、5分間泳ぎ回らせます。害虫を駆除するために、ピペットはシリコンベースの解剖プレートの中央に解剖バッファーの大きなプールを1つ作成します。大きなプールを囲むように3つの小さなプールを配置し、鉗子を使用して幼虫を底のプールに移します。次に、5番の鉗子を使用して、洗浄された単一の幼虫を小さなプールから大きな解剖バッファーのプールに移します。粗い解剖を開始するには、一方の鉗子を使用して口のフックをつかみ、もう一方の鉗子のペアを使用して幼虫を優しくつかみます。3分の1で、体長が口のフックをしっかりと保持しています。2組目の鉗子で体の残りの部分をすばやく引き離します。幼虫を鉗子から離し、腸がこぼれるのを待つことで、想像上の椎間板が正常な状態に保たれるようにします。次に、マウスフックをつかみ、もう一方の鉗子を使用して、内側の腸を含む幼虫の下部3分の2を取り除きます。次に、唾液腺、脚椎間板、その他の組織をやさしく取り除きます。残るべき組織は、上に横たわっている少量のキューティクルだけです。口のフック、目と腱の椎間板、脳半球、腹側神経節。最大20分後、解剖したすべての組織をパラフォームアルデヒドリジンパリアに移します。日付固定剤またはPLP。想像上の椎間板を解剖バッファーに20分以上放置しないと、解剖後に劣化します。解剖した組織を100マイクロリットル刻みで冷たいPLPが入った時計ガラスに移します。一対の鉗子を使用して、解剖された組織が完全に水没していることを確認します。解剖した組織を冷PLP固定液で室温で45分間攪拌せずにインキュベートします。次に、PLPから100マイクロリットルの解剖組織を洗浄バッファーに移します。組織が完全に沈んでいることを確認し、攪拌せずに室温で45分間インキュベートします。次に、解剖した組織を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。洗浄バッファーを取り外し、100マイクロリットルのブロッキング溶液と交換します。組織を室温で、卓上回転子上で穏やかに回転させながら10分間インキュベートします。ブロッキング後、溶液を取り出し、10%正常ヤギ血清中の100マイクロリットルの一次抗体溶液と交換します。抗体の強度に応じて、組織を室温で穏やかに回転させながら16時間インキュベートします。次に、一次抗体を取り出し、750マイクロリットルの洗浄バッファーと交換します。チューブを室温でミューテーターに10分間置きます。ミューテーターからチューブを取り外し、ヘッドがチューブの底に落ち着くまで待ちます。次に、洗浄バッファーを取り出し、10%正常血清に100マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。チューブを室温で静かに回転させながら、抗体の強度に応じて少なくとも2時間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を組織から取り出します。500マイクロリットルの洗浄バッファーと交換し、組織をチューブの底に沈殿させます。シリコン解剖プレート上に3つの洗浄バッファープールを置きます。解剖したすべての組織を、解剖皿に置かれた洗浄バッファーの大きなプールに移します。これにより、余分な二次抗体を除去して細かい解剖を開始し、頭部複合体の腹側を下にして置き、キューティクルを口のフックで留めることができます。脳と目の椎間板の間のスペースに2番目の鉗子のペアを置き、脳を口のフックからすばやく引き離して、口のフックを保持し続けながら2つの脳葉を取り除きます。アイアンテナディスクのアンテナ部分とマウスフックの間の接続部にできるだけ近づけて、ティッシュをつまんでください。必要な組織がすべて解剖されるまで続けます。次に、カバースリップのサイズのティッシュペーパーを2枚、3インチ離して解剖皿に追加します。これらの紙の上にスライドガラスを置き、スライドが解剖皿のシリコンベースにくっつかないようにします。P 20ピペットの男性を使用して、ガラス顕微鏡スライドの中央に9マイクロリットルの漂白防止剤を追加して、同じカットされていない先端で組織の蛍光光漂白を防ぎ、すべてのIディスクとtenalディスクを集めて、漂白防止試薬のドロップに追加します。次に、鉗子を使用して、想像上の椎間板が触れなくなるまで、漂白防止試薬の滴内で目と腱の椎間板を分離して広げます。細いペイントブラシを使用して、漂白防止剤の滴にカバースリップをそっと下げ、気泡の形成を防ぎます。最後に、スライドをマイナス20°Cで保存し、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用してイオンテナールディスクを観察し、イメージングする準備が整います。この方法は、これらの仮想ディスクの共焦点画像によって伝えられる分析用の高品質の材料を確実に生成します。椎間板は、fアクチンに結合して各細胞の輪郭を描くフォイドおよび結合型フルオロ4で処理されました。内膜椎間板の最も顕著な特徴の1つは、背側腹軸に沿って走る組織内のくぼみとして見ることができる形態形成溝です。溝が眼球を横切って進行するにつれて、無秩序な細胞の海は、周期的に間隔を空けたユニットアイまたはオマテディアの秩序ある配列に変換されます。クローン発現の検証とI想像円板の解析は、この方法の下流への応用が可能です。上の3つのパネルには、ilis、A DPP、LAC Z転写レポーターなどのさまざまな抗体と、汎ニューロンのRNA結合タンパク質をコードする胚性、致死性、異常性視力、vyなどの細胞特異的マーカーで染色されたディスクが表示されます。下の3つのパネルは、GFPを使用して細胞の集団をマークするディスクを示しています。コースをマスターすると、10〜20匹の幼虫からの頭部複合体の単離には約10分かかり、さらに、これらの複合体からのイオンテナールディスクの微細な単離にも約10分かかります。

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、3齢段階でのショウジョウバエの幼虫から成虫のディスクを切り離すために使用される解剖手法を示しています。言って後に組織を固定し、翼、足、そして目のディスクを削除するメソッドは、直接、その後の可視化のための顕微鏡スライド上に示されている。...

3齢幼虫ショウジョウバエの幼虫から成虫ディスクの解剖

我々は、特異的に発現される新規の赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターの説明...

のアイ成虫原基の可視化を支援するために新しいRFPレポーターショウジョウバエ</em

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

ショウジョウバエの想像上の椎間板を染色するとき、椎間板が露出しているが体に付着したままの状態で大まかな解剖が行われることがよくあります。染色されたディスクは、目的のディスクを分離してマウントします。このプロトコル例は、翼の想像上の椎間板の解剖と取り付けの手順を示しています。...

ショウジョウバエ幼虫の想像上板解剖:発達中の上皮を観察する方法

この技術の目標は、研究者があらゆる年齢のショウジョウバエの眼板の解剖、免疫染色、および装着を行うことを可能にすることです。...

解剖と実装<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイディスク

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。...

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

ここでは、ショウ ジョウバエ...

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

GFP再構成ベースのアプローチを使用して、生きたショウジョウバエの翼の想像上の円盤の隣接する上皮層の細胞間の接触を測定するためのプロトコルについて説明します。...

生きた ショウジョウバエ の翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのGFP相補性ベースの二重発現システム

本記事では、試薬を節約し、少数の想像椎間板を取り扱いやすくする効率的な幻想椎間板解剖および抗体染色プロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエ・メラノガスターからの眼触角および翼の想像円板の小規模解剖および抗体染色

学ぶキイロショウジョウバエの成虫原基解剖と免疫染色法。蛍光顕微鏡を用いて遺伝子・タンパク質の発現パターンを可視化し、発生生物学における組織決定と細胞運命の理解を深める実験手法です。

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

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