細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

この手順の全体的な目標は、生細胞内で 3D で移動するリソソームなどの動きの速い細胞小器官を追跡する方法を説明することです。これは、まず、培養生細胞内で特定の市販の色素を使用してリソソームと微小管を染色することによって達成されます。2番目のステップは、レーザー走査型顕微鏡を使用し、軌道追跡法を使用して高速でリソソームの動きを追跡し、軌道のサイズとシステムの周波数応答などの他のパラメータを選択して追跡実験を行うことです。

最終的に、結果は、高速で移動するリソソームを3次元で追跡し、追跡中にレーザー軌道に沿って遭遇する他の蛍光染色オルガネラとの相互作用を検出することが可能であることを示しています。3Dトラッキング法が他の既存の方法(例えば乱視に基づく方法)と比較した場合の主な利点は、3Dのウィザルトラッキング法により、非常に広い範囲の認知症を追跡できることです。この方法は、小胞がマイクロチューブに沿ってどのように移動するかなど、小胞輸送分野で重要な質問をするのに役立ちます。

ただし、この方法はエンドソームダイナミクスの研究に使用できます。それはまた、テキストプロトコルに記載されているように、goナノ粒子膜受容体、凝集体核ポート複合体または遺伝的遺伝子座維持チャイニーズハムスター卵巣細胞またはCH K 1細胞のような単離された粒子を蛍光標識することが可能である他のシステムで採用することができる。細胞を採取した後、直径14ミリメートルに置きます。

表面厚さ0.16ミリメートルの種子細胞をイメージングに最適な密度で約60〜70%Coの密度でマイクロウェル 流暢にインキュベート細胞を摂氏37度で一晩インキュベート 5%CO2 翌日、ハンクの緩衝生理食塩水またはH-B-S-S-H-B-S-Sで細胞を3回洗浄し、培養プレートから死んだ細胞や破片を除去し、染色ステップのために細胞を準備します。次に、最終濃度50 ano mol lyo tracker と 150 ano mol の tubulin tracker green を含む HBSS 溶液で、インキュベーション後 37 °C で 1 時間インキュベートします。HBSSで細胞を3回洗浄し、結合していない色素をすべて取り除きます。

細胞をイメージングする前に、新鮮なDMEM増殖培地を添加してください。ビデオプロトコルに記載されている粒子追跡用の顕微鏡は、市販の倒立顕微鏡のフレームに組み立てられます。コヒーレントカメレオンウルトラ2チタンサファイアフェムト秒レーザー励起光源は、690ナノメートルから1040ナノメートルの間の調整可能な出力波長範囲で使用されています。

レーザービームが顕微鏡の背面ポートに位置合わせされていることを確認してください。赤外線コーティングされたミラーを使用して、方解石偏光子の前に配置された回転半波長板を使用してレーザービームを減衰させ、サンプルの平均出力が0.5〜2ミリワットになるようにビームを減衰させます。高開口数水対物レンズを光路に配置して、サンプルから蛍光光を収集します。

次に、サンプルを電動ステージに置き、顕微鏡対物レンズの細かい動きを調整します。対物レンズのピゾコントローラーを使用する。蛍光フィルターキューブは、1チャンネルまたは2チャンネル構成で目的の発光波長に応じて選択してください。

発光帯通過フィルターを採用。放出される蛍光のスペクトル範囲をさらに選択するには、フィルターキューブからの光を光増倍管に向け、信号が増幅および識別され、デジタル入力出力データ収集カードに送られて細胞をイメージングし、ステージ上に配置して透過光照明を使用して焦点を合わせます。ラスタースキャンイメージングに切り替えて、色素を取り込んだ細胞を特定し、その下にある微小管を視覚化して、小胞の動きが存在する最初の領域を特定します。

孤立した小胞が特定されたら、軌道追跡のパラメータを設定します。まず、軌道の半径を選択して、追跡される粒子のサイズに応じて円形スキャンのサイズを定義します。ポイントエミッターの場合、軌道の半径を点像分布関数のウエストまたは励起ビームのPSFと等しくなるように設定します。

感度と応答性を最大限に高めます。軸方向に沿って粒子の位置を特定するために実行される 2 つの軌道間の距離を定義するには、軸距離を設定します。軸方向の距離をPSF廃棄物の1.5倍から3倍に設定します。

粒子の明るさに応じて滞留時間を定義し、軌道の各点で費やされる時間を設定します。これにより、写真の退色率も決定されます。10 〜 100 マイクロ秒の滞留時間を使用します。各軌道のポイント数を 64 または 128 に設定すると、軌道周期が 4 ミリ秒から 32 ミリ秒のオーダーになり、粒子の位置を決定するための高い時間分解能が得られます。

ミラーに送信されるDCオフセット信号を変更して、ラスタースキャン画像内のカーソル選択を介してグラフィカルユーザーインターフェースを介してビームをパーティクルの中心に配置。追跡を開始するには、顕微鏡モードをラスターイメージングから軌道スキャンに切り替えます。軌道解析のためのフィードバックとデータ収集をアクティブにします。

このソフトウェアを使用して、軌道上の各点および各点で収集された蛍光を強度カーペットの形で表示します。カーペットに沿って収集された強度は、粒子と他の明るい物体との相互作用に関する情報を提供します。軌跡情報と、光電子増倍管から経時的に収集された蛍光強度の両方を時系列形式で表示します。

時系列表現と強度カーペット情報を使用して、軌跡内の関心領域のみを選択します。次に、粒子の軌跡の選択した部分の 2D 投影を表示します。適切なコントロールを選択して、粒子の蛍光強度に応じて軌道を色分けします。

粒子の軌跡を3Dで表示し、蛍光強度に応じて色分けするオプションを選択します。コントロールを使用して軌道を3Dで回転させ、微小管に沿ったリソソームの動きの特徴を視覚化します。リソソームと微小管の蛍光緑色色素染色を使用して、2光子レーザー走査型顕微鏡で微小管に沿った小胞の高速運動をイメージングすることができます。

ただし、ラスタースキャンイメージングには、軌道追跡を使用する場合、高速エンドソームの動きを正確に追跡するために必要な時間分解能がありません。それどころか、データは、32ミリ秒の時間分解能でx、y、Z変位軌跡を取得できることを示しています。これらの変位対時間軌跡では、カーペット解析では、各軌道に沿って記録された強度が表示されます。

時間の経過とともに、強度の軌跡は粒子の蛍光周囲に関する情報を提供します。ボックス化された領域は、2 つのジャンプの間の軌道の部分に対応します。ボックス化された領域の外側の明るいスポットは、粒子と他の明るい物体との相互作用に対応し、軌道が最も明るい蛍光源に再中心するときの軌道のジャンプに関連しています。

追跡中に、放出された蛍光の積分強度を記録できます。再構築された3D軌道は、微小管ネットワーク上を移動する小胞から予想されるように、指向性運動を示します。さらに、3D軌道をRAや周辺領域のスキャン画像に関連付けることができます。

これにより、微小管束の方向に沿った粒子の移動が確認されます。一度習得すると、このテクニックは、試みながら適切に実行すれば、数時間で実行できます。この手順は、このプロトコルで示されているようにフォトニックサイテーションを使用しながら、サンプルに害のないレーザー出力レベルを使用することを覚えておくことが重要です。ただし、対物レンズの後の約2ミリボルトの電力レベルを維持する必要があります。

このビデオを見れば、非常に大きなZ範囲の物体を追跡できる3D軌道追跡法を使用して実験を設定する方法について、非常によく理解できるはずです。