Name: 培養線虫（Caenorhabditis elegans）微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ Caenorhabditis elegansの無菌液体培地（CeHR）での培養と同期化手法。細菌由来物質を排除し、栄養学的研究や発生生物学における正確な実験結果を得るための技術を習得できます。

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1。ワーム株<ol><li> Cを得E.を接種線虫遺伝学センター（CGC）（http://www.cbs.umn.edu/cgc）から野生ブリストル N2株エレガンスとNGMプレート上でそれらを維持する大腸菌菌株OP50 7。注意：トランスジェニックワームは、以前に11を説明したようにIQ6011（PHRG-1 :: GFP）を利用が生成された株。 IQ6011は、対応する著者から要求することができます。 </li></ol>変更されたCの 2。準備虫居住再生中（mCeHR） 12下記のようmCeHR液体培地を用意します。この無菌液体培地は、ワームが追加の食料源なしで成長することができます。このような層流フードとして、厳密に無菌状態を使用して無菌液体培地および無菌ワームの全ての操作を行う。 <ol><li>食料品店から超低温殺菌無脂肪牛乳を入手します。冷蔵プロを使うダクトとしない常温製品。 mCeHR媒体、連勝で寒天プレートブレインハートインフュージョン（BHI）に牛乳を使用し、無菌性を確認するために30℃〜37℃で3日間インキュベートする前に。 -80℃で50ミリリットル滅菌チューブおよび格納するために牛乳を転送</li><li>下記の各成分を調製し、順序およびmCeHRの1 Lを調製するために所定量（ 表1A）に結合する：2mMのコリン二酸、クエン酸10mlの、ビタミン及び成長因子の混合物を10ml（ 表1Bのレシピを参照されたい）、 2.4 mMのミオイノシトール、2mMの塩化ヘミン10mlの脱イオン水250mlを10ml。 0.22μmのフィルターユニットを介して吸引し、フィルタを適用します。 </li><li>核酸混合物を20ml（ 表1Cにおいてレシピ）、ミネラル混合物を100ml（ 表1Dでレシピ）、170 mg / mlのラクトアルブミン加水分解物20mlを、必須アミノ酸、20mlの非必須アミノ酸、10 mlを加え酸、450mMのKH 2 PO 4、20mlの1.45 M D-グルコース、1 M HEPES 10mlのナトリウム塩を250mlの脱イオン水50ml。 </li><li>コンポーネントを殺菌フィルタに吸引を適用します。フィルタを削除し、5 mg / mlのコレステロールの1ミリリットルを加える。培地のpHは約6〜6.5であることを確認してください。注：この溶液を最大1年間-80℃で保存することができる。 </li><li>使用前にmCeHR培地に20％（v / v）の超低温殺菌された有機スキムミルクを加える。牛乳を開いて小分けするとき（層流フード内など）綿密に無菌技術を使用してください。 4℃で、メディアを格納</li></ol> 3℃に準備無菌mCeHR液体培地中で培養するための虫 <ol><li>多くの妊娠ワームやOP50 Eの最少量があるまで、10 60ミリメートルNGMプレート上でワームを育てるプレート上の大腸菌 。 </li><li> M9バッファー（ 表1Fにあるレシピ）5mlでリンスすることにより、各プレートからワームを削除し、50ミリリットルコニカルチューブに結合します。 </li><li> sにワームを許可する慎重にEを含む上清を除去し、5から10分間放置し、チューブを残すことによってettle 大腸菌 。 </li><li>繰り返して手順を続行する前に、可能な限り残留細菌をできるだけ多く除去するために3.2と3.3倍を繰り返します。 </li><li>実施例1.5 mlの個々のワームがチューブから見ることができる3 mlまたは6ミリリットルのために、3の倍数である体積の0.1 N NaCl中ワームを再懸濁する。 </li><li> 5 N NaOHおよび5％次亜塩素酸ナトリウムウォーム懸濁液に午前1時02分06秒の割合で（漂白剤）の溶液を添加することによってワームを漂白する。例えば、1mlの5NのNaOH 2mlの5％次亜塩素酸ナトリウム：ウォーム懸濁液を6ml。ワームの懸濁液に添加する前に、NaOH及び漂白剤を混ぜる。 </li><li>渦は、溶液を激しく妊娠ワームが溶解するまでしか卵は懸濁液（約5から10分）内に表示されます。 10倍の対物レンズとの位相差顕微鏡を使用してプロセスを監視します。 </li><li>ワームが完全に溶解した後、すぐにペレット4℃で45秒、800×gで卵上清を除去し、4℃で45秒間、800×gでペレットを遠心分離し、滅菌水10mlで二回、ペレットをすすぐ</li><li>漂白した後、100μg/ mlのテトラサイクリンを補充したmCeHR培地10ミリリットルを含む25cm 2の組織培養フラスコに卵ペレットを転送します。無菌技術を使用してこの手順を実行します。所望であれば、無菌の液体培養における細菌の増殖を防ぐために、250μg/ mlのナリジクス酸を含む追加の抗生物質を、追加する。 </li><li>約70 rpmで振とう培養器で20℃で液体培養をインキュベートする。 </li><li>発展段階や成長率に注目することは日々のワームを確認してください。 注意：ワームは、最初はゆっくりと成長し、産卵期になるために7〜10日必要となります。ワームは、液体培地に順応しかし、世代時間は、野生型（N2）ワームは約4日間に減少します。 </li><li>ワームはDEVEを取得した後コニカルチューブにワームの文化を転送し、スイングバケットローターを使用して、4℃で5分間800×gでワームをペレット、液体培地中の妊娠の段階にloped。 </li><li>上清を除去し、穏やかに0.1MのNaClを等量のウォームペレットを再懸濁。例えば、mCeHRの10ミリリットルで培養されたワームのために0.1MのNaClの10ミリリットルを使用しています。ワームは、氷上で5分間沈降することができます。 </li><li>ステップ3.5から3.8に、上記のような漂白手順を実施し、ワームは無菌液体培地中で第二世代のために成長することができます。必要に応じて、細菌増殖を阻害するために、再度、抗生物質を加える。 </li><li>再びワームは、ステップ3.12と3.13で説明したように、ステップ3.5から3.8で説明したように同期化された集団を生成するために、再び漂白して、0.1MのNaCl中のワームをペレット化し、再懸濁し、妊娠になることを許可。今から、抗生物質を含まない液体培地中でのL1幼虫ワームを育てる。 </li></ol>液体から4。同期ワーム文化<ol><li>ペレットとステップ3.12と3.13で、上記のよう0.1MのNaCl中のワームを懸濁します。ステップ3.5から3.8で説明したように漂白剤。 </li><li> M9緩衝液10ml中に卵のペレットを再懸濁し、幼虫が回転プラットフォームシェーカー上で20℃でO / Nを孵化することができます。注：卵は、L1幼虫に孵化しますが、L1の段階でワームを同期、さらに発展しません。 </li><li>維持·サブカルチャーワームは、5分間800×gでペレットのL1幼虫は、10 mCeHR mlの25cm 2のフラスコへの転送中に幼虫を再懸濁する。ワームは、回転プラットフォーム上で20℃で成長させる。ワーム十分な栄養を確保するために、3000ワーム/ミリリットル/ cm 2の最大密度を維持する。 注：この段階では、抗生物質の手順は、層流フード内で無菌技術を用いて実施される無菌状態を維持するために必要とされない。ワームは、成長を監視するために、毎日チェックする必要があります。 </li></ol> 5。無料無菌ミディアム培養にシュッと解凍ワーム<ol><li>無菌非同期ワーム培養または液体窒素中で同期されたL1幼虫を凍結する。 5分間800×gでペレットワームはその後、各バイアル用の0.5ミリリットルを使用して、S緩衝液（6.45 mMのKHPO 4、43.55ミリモルKHPO 4、146.25のNaCl）を懸濁します。各バイアルは30％v / vのグリセロールでS緩衝液を等量の液体を追加し、N 2中で長期保存の前に-80℃にワームを転送する。各バイアル内のミリリットル当たり約1×10 6ワームを凍結する。 </li><li>ほとんど全ての氷が融解するまで約2分間、37℃でバイアルをインキュベートすることにより、ワームを解凍する。層流フードにおいて、mCeHRを含む滅菌フラスコにワームを転送し、20℃でそれらを配置</li></ol> 6。mCeHR成長と生殖に対するヘミン濃度の効果を決定する<ol><li> Cの栄養素依存性増殖をアッセイする無菌mCeHRメディアを使用虫 。エフェクトOを測定するために、ワームの成長と発展にFヘミン濃度、同期された無菌のN2ワームや関心のある他の菌株を使用しています。 4章で前述したように、L1幼虫を同期します。 </li><li>翌日、ペレット、同期のL1幼虫をカウントし、無菌の媒体のμLあたり1ワームに希釈する。 0.3MのNH 4 OH中の10mM塩化ヘミンを作成し、濃HClを用いてpHを8に調整してください。 </li><li> 24ウェルプレートにmCeHRメディアの800を添加する。メディア100μlの各ウェルに100ワームを追加します。 0μM、1.5μMから三重に1,000μMの範囲の濃度で各ウェルに塩化ヘミンを追加します。全てのウェルは、0.3MのNH 4 OHを同じ濃度が含まれていることを確認してください。穏やか100 L1幼虫を各ウェルに添加されることを保証するためにピペッティングする前に、ワームを再懸濁した。 </li><li>日々のワームを調査し、各ウェル中の各濃度の増加に注意してください。 9日間のインキュベーション後のワームの数をカウントし、各ヘムに対応するワーム/ mlの数をプロット濃度（ 図1）。 </li></ol>ヘムセンサーワームに対するヘミン濃度の7。効果<ol><li> 4μM、8、10μMおよび20μMのヘミンを含むmCeHRにおける同期化のL1ヘムセンサーワーム（PHRG-1 :: GFP）をインキュベートする。 </li><li>蛍光共焦点顕微鏡、48時間後のインキュベーション（ 図2）を使用して画像のワーム。 </li></ol> 8。トランスジェニックC.を生成するための mCeHRを活用微粒子砲撃を使用して、 虫 注：生成およびmCeHRで栽培UNC-119（ED3）ワームを使って微粒子衝撃を実施するための手順を図3 13に概説されている。 <ol><li>ワームの準備<ol><li>砲撃の前に175cm 2のフラスコ1週間でmCeHR培地90ミリリットル中に約1×10 6非同期UNC-119（ED3）ワームを転送します。ワームは20℃、Oで成長することができます〜70回転（ 図3-1）で振盪プラットフォームNA。 注：一週間後、ワームの密度は、多くの大人の妊娠ワームと大幅に大きくする必要があります。約3×10 7のワームは、微粒子衝撃のために必要となります。 </li><li>寒JM109 E.大腸菌は、氷の上10cmのNGMプレートを播種した。 </li><li> 2 50ミリリットルコニカルチューブに無菌ワームを移し、2分間800×gでワームを遠心する。上清を吸引し、M9バッファー（ 図3-2）の50ミリリットルで、各チューブ内のワームを懸濁します。 </li><li>成虫は、氷の上で10から15分間、重力によってペレット化することができます。 注：2ミリリットルペレットは今&gt; 90％の成虫が含まれている必要があります。この2ミリリットルペレットは約5×10 6のワームを持っており、1微粒子衝撃のために十分である必要があります。 </li><li>コー​​トチルドJM109の表面全体がワームの2ミリリットルペレットとNGMプレートを播種した。完全に吸収される液体は、その後、プレートを残してできるように（ 図3-3）を進める前に、氷上で30分間。 </li></ol></li><li>金粒子の調製<ol><li>シリコン処理微量遠心チューブに金粒子30mgを秤量する。 1ミリリットルの70％エタノールを加え、5分間チューブをボルテックスする。 </li><li>チューブは金粒子をペレット化し10秒間6000×gで遠心分離し、その後、15分間座ってすることができます。慎重に金粒子にチューブの反対側に先端に触れることにより、ピペットチップを用いて上清を除去する。 </li><li> 1分間の滅菌水1ml、ボルテックスで金粒子を洗浄し、簡単に10秒間6000×gでチューブを遠心する。無菌50％グリセロール0.5mlに金粒子を再懸濁して、二回の洗浄ステップを繰り返します。 注：金粒子の最終濃度は60 mg / mlであろう、それは、4℃で1〜2ヶ月間保存することができる</li></ol></li><li> DNA-金粒子ミックスを調製する<ol><li> 10で所望のプラスミドDNAの10μgのを組み合わせ＆＃956;シリコン処理した1.5mlマイクロチューブ内のUNC-119レスキュープラスミドのG。その後、1分間渦を脱イオン水50μl、よく再懸濁した金粒子溶液100μlを加える。 </li><li> 2.5Mの塩化カルシウムを150μlを加え、1分間再びソリューションをボルテックスする。この溶液に、3から5分間、0.1Mスペルミジンと渦の60を添加する。 </li><li>パルスは10秒6000×gで解決策を遠心、上清を除去し、70％エタノールを300μlを加える。 1分間よくボルテックス、6000×gでのパルス遠心、100％エタノール170μlの上清と再懸濁を削除します。積極的に5から10分後、遠心分離器をパルスし、上清を除去するためのソリューションをボルテックスする。 </li></ol></li><li>衝撃（ 図3-3） 注：このプロトコルは材料/機器の表で指定された粒子デリバリーシステムを用いて行われる。利用可能な粒子送達器具のための指示に従ってください。 <ol> &lt;李&gt; 15cmのプレートにティッシュペーパーのシートを配置します。ピンセットを使用して、100％エタノール中に個々に7 macrocarriersを浸し、乾燥さ組織上に横たわっていた。 </li><li>徹底的に70％エタノールでバイオリスティック室、マクロキャリアーホルダー、ターゲットプレートを清掃してください。清潔で、各衝撃手順の前に停止画面をオートクレーブ。 </li><li>座席のツールを使用してホルダーにピンセットやプレスを用いてホルダーにmacrocarrriersをロードします。 </li><li>均等に各マクロキャリアーの中心にあるのDNAコーティングされた金粒子の20μLを広め、次いで、溶液を完全に乾燥させます。 </li><li>エタノールで圧力分配器の2つの部分をきれいにし、エタノール洗浄破裂板と集合。衝撃室に組み立てられた圧力分周器と破裂板をネジ止めします。 </li><li>マクロキャリアホルダーをオートクレーブ停止画面を組み立て、必要な金属の棚上に装置を配置し、所定の位置にロックします。 </li><li>組み立てMACRを挿入ocarrier圧力分配器下の割り当てられたスロット内の遺伝子銃室への装置と圧力分割器を使って合わせます。 </li><li>ターゲットプレート棚の上にワームとのオープンNGMプレートをテープと室のドアを閉じます。 </li><li>ワームに衝突、破裂板を破壊するのに必要な圧力を調整します。ディスクが破裂するまで、発射ボタンを押して、水銀の圧力の28インチの真空をオンにします。 </li><li>真空を解除し、装置からNGMプレートを取り外します。プレートからワームを洗って20 10cmのNGMプレートに再配布JM109 E.を接種大腸菌 （ 図3-4）。 </li><li>ワームは25℃で10〜14日間成長し、プレートを飢えすることができます。 のunc-119欠陥から救出ワームは、通常の動きを有するであろうし、この時点で同定することができる。これらは独立したトランスジェニック系統（Figurを表すように、さらなる分析のために別々のプレートから少なくとも10「野生型」ワームを選ぶE 3-5）。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益や利益相反がないことを宣言します。

このプロトコルでは、急激な温度が可能に変更された無菌の液体メディアmCeHRを提示ワームは、多数の生産を生成エレガンス 。ワームは、Eを汚染することなく成長しているように、このメディアは、いくつかの利点を示しています大腸菌や細菌の副生成物及び栄養と毒性試験に利用することができます。 Eの使用このような研究において、大腸菌または他の細菌にはいくつかの欠点がある。例えば、細菌の増殖は、様々な条件下で変更することができますし、細菌は、結果の解釈を交絡、アッセイされている分子を代謝することができる。したがって、これらの研究を行うために定義された培地の開発は非常に有利である。 C.ものの虫はこれまでの研究15、Cで成長し、ワームの液体培地中で増殖させてきたエレガンス維持培地（CEMM）我々はOBSE何とは異なり、世代時間16内の個別の遅延を示しているmCeHR培地でRV...

土壌線虫、 線虫（Caenorhabditis elegans）は 、遺伝学からの毒物学の多くの研究に使用される強力なモデル生物である。その1mmの大きさは、4日間の迅速な世代時間、培養の容易さ、および大子孫数の結果として、これらの線虫は、遺伝的および薬理学画面1、2の数で利用されている。研究者は、脊椎動物系において保存分子や経路を同定するために、このワームを利用しています。これらの経路は、細胞死シグナル、加齢や代謝経路、および神経系3-6が含まれています。また、Cの透明性エレガンス直接遺伝子発現パターンおよびタンパク質局在を分析するために可視化することができる蛍光タンパク質レポーターを用いて、トランスジェニック系統の生成を可能にする。 多くの研究では、この線虫線虫成長培地（NGM）プレートを用いて、固体寒天ベースの表面上またはlで培養されるiquid培養は、食料源7,8として大腸菌を播種。これらの細菌の食料源は副産物結果の解釈に影響を与える細菌からの干渉との生化学的および毒物学的研究を混乱することができます。これらの複合効果を回避するために、C.エレガンスは、食物源として細菌を欠いている無菌液体培地で培養することができる。このメディアを使用して、我々は成功し、多くの標準的なCには、高度に同期化されたワームの何百万人を培養しCの差別的に調節された遺伝子のマイクロアレイ解析などの虫プロトコル虫は異なるヘム濃度に暴露し、遺伝子衝撃を使用してトランスジェニックワームの生産。このメディアは、化学的に定義されており、博士エリッククレッグ9によって配合オリジナルレシピから変更されている。 10は 、ここであろう（HRG複数）のようなヘム応答性遺伝子と呼ばれるこのmCeHRメディアを使用して、我々は正常ヘム恒常性に関与する遺伝子を同定したE.を接種NGM寒天プレートを用いる標準的な増殖条件下で可能ではなかった大腸菌 。 このプロトコルでは、Cを導入し、維持するための手順を説明しますE.上に成長した虫無菌mCeHRに大腸菌およびトランスジェニックC.を製造するためのワームを大量に取得するには、この方法を利用して微粒子衝撃を使って虫ライン 。 Cの栄養所要量を決定するための無菌の媒体を使用することの有用性を示す、我々もまた、本研究でエレガンス例としてヘムを用いて。これらの研究は、mCeHR媒体を使用してC.多数の急速な成長を可能にすることを示してワームの研究者によって利用され、多くのダウンストリームアプリケーションのためのエレガンス 。

<table><tbody><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ>&#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸カリウム一水和物</td><td>Σ</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&#8226;2H2O</td><td>フィッシャー</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&#8226;4H2O</td><td>フィッシャー</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Σ</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)2(SO4)2&#8226;6H2</>O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226;2H2O</td><td>フィッシャー</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5 -一リン酸、ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>シチジン 5 -リン酸</td><td>シグマ</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 2' および 3' -一リン酸</td><td>シグマ</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>ウリジン 5 -リン酸、二ナトリウム塩</td> シ<td>グマ</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>チミン</td><td>シグマ</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルグルコサミン</td>シ<td>グマ</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-アラニン</td><td>フィ</td><td>ッシャーS25648&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-アミノ安息香酸</td><td>シグマ</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>シグマ</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>シアノコバラミン (B-12)</td><td>シグマ</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>フォリネート (Ca)</td><td>シグマ</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>ナイアシン</td><td>シグマ</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>ナイアシンアミド</td><td>シグマ</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>パンテテイン</td><td>Σ</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>パントテン酸 (Ca)</td><td>Σ</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>プテロイルグルタミン酸 (葉酸)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>ピリドキサール 5'-リン酸</td><td>Σ</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>ピリドキサミン 2HCl</td><td>Σ</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>ピリドキシン HCl</td><td>Σ</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>リボフラビン 5-PO<サブ>4</サブ>(NA)</td><td>シグマ</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>チアミンHCl</td><td>シグマ</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-チオクト酸</td><td>シグマ</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ></td><td>シグマ</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>コリン二酸クエン酸</td><td>シグマ</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>myo-イノシトール</td><td>シグマ</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Σ</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>ラクトアルブミン 酵素加水分解物</td><td>シグマ</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>脳 心臓注入</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>ヘミンクロリド</td><td>フロンティアサイエンティフィック</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>ナリジクス酸ナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>金粒子(金粉)&nbsp;</td><td>&nbsp;フェロ電子材料システム</td><td>6420 2504、JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>または</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金粒子1.0 &mu;m</td><td>BioRad</td><td>&nbsp;〒165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

培養線虫（caenorhabditis elegans）微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

このプロトコルでは、必要な材料を提示し、修正Cを製造するための手順。電子のlegans馴化培地および再生（mCeHR）。また、Cを露出し、順化のためのステップE.上に成長した虫液体培地を無菌にする大腸菌が記載されている。無菌Cを利用し、最終的に、下流の実験虫は、この手順の利点を示す。 Cを分析し、決定する能力虫の栄養要件は、ヘム濃度を変化させて無菌液体培地中の窒素野生型線虫を成長させることによって示された。この手順では、ワームの増殖および発達のための最適濃度を決定するために、または、薬剤治療の毒性効果を決定するために、他の栄養素を複製することができる。野生型線虫の成長に様々なヘム濃度の効果は、定性的な顕微鏡観察を経てTを定量することによって決定した各ヘム濃度に生えワームの彼は数。また、多様な栄養素の濃度の効果は、関心対象の栄養素の変化に応答する蛍光センサーを発現するワームを利用することによってアッセイすることができる。さらに、ワーム多数の容易に微粒子衝撃を用いて、トランスジェニックC.エレガンスの生成のために作製した。

C.を培養Eで発生した二次代謝産物からの干渉なしに、ワームが必要とする栄養素の決定における無菌液体培地エイズ虫大腸菌 。野生型N2ワームは、3世代以内にmCeHRメディアに順応し、NGM細菌プレート上で培養したワームに匹敵する成長を示す。実際、これらのワームは、OP50細菌上に成長したワームのための3.5日に比べて、4日以内に妊娠になる。 mCeHRを使用することの一つの利点は、これらのワーム14の正確な栄養要求を調べた研究で見られた。 図1においては、ワームmCeHRにおいて1mMの最大、ヘムの量の増加を補った増殖させた。これらのワームの観察は、ワームがL4幼虫期に開発したがmCeHR中の9日後に妊娠の段階に進行することができないと、4μM以下のヘム濃度で成長の明らかな遅延を示した。 10μMおよび20の濃度で56、M個のヘムは、ワームは、4日間で妊娠の段階に開発し、子孫を大量に生産する。ワームは、20μMのヘムを含有mCeHRで増殖させたときに子孫の最大数が見られた...

線虫は通常、固形寒天プレート上で増殖させ、または液体培養で大腸菌を接種されている大腸菌 。毒物および栄養研究交絡からの細菌の副生成物を防ぐために、我々はダウンストリームのアプリケーションの範囲のためのワームを大量に成長し、同期させるために、無菌液体培地、CeHRを利用した。

培養線虫（Caenorhabditis elegans）微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

この手順の全体的な目標は、多数の下流用途向けにCENIC液体媒体に海の優雅さを導入し、成長させることです。これは、最初に飢えた寒天プレートから墓虫を漂白することによって達成されます。手順の2番目のステップは、放出された卵子を抗生物質を使用してM-C-E-H-Rに移し、7〜10日かかる可能性のある墓の段階まで成長させることです。3番目のステップは、墓を漂白し、追加の抗生物質なしで墓の段階に2回目に成長させることです。最後のステップは、Axeワームを同期させ、ワームの成長と発達を調べる栄養研究に利用することです。最終的に、結果は、野生のタイプCの優雅さがAxe Liquid培地でよく成長し、M-C-E-H-R培地を利用して、細菌の副産物を含まないワームの栄養ニーズを調べることができることを示しています。この手法の主な利点は、寒天プレート上やバクテリアを含む液体培地でワームを成長させるなどの既存の方法と比較して、細菌の副産物を交絡させることなく栄養成分や毒素の影響をテストできることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、培地の調製とEMIC液体培地への線虫の初期適応のために苦労します。この手順では、バクテリアの食料源なしでC eleganceを成長させるためのM-C-E-H-R-A液体培地の調製について説明します。ボンネットの下で厳格な滅菌技術を使用して、M-C-E-H-Rの成分を次の順序で混合します。コリン、クエン酸二大腸菌から始めて、ビタミンと成長因子に続きます。myoアセトール、ヒト塩化物を混合し、最後にDI水を加えます M-C-E-H-R混合物を吸引付き0.22ミクロンフィルターでろ過します。次に、核酸を加え、ミネラルミックス、ラクト、アルブミン、加水分解物、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、リン酸カリウム、deg、グルコースヒープ、ナトリウム塩、および脱イオン水を混合します。次に、混合物を吸引で再度ろ過します。ろ過後、培地にコレステロールを加え、次に培地のアリコートのpHを確認します。pHは6〜6.5である必要があります。溶液が正しく作られた場合は、綿密な滅菌技術を使用して、低温殺菌した牛乳の20%容量をM-C-E-H-R培地に加えます。メディアは摂氏4度で保管してください。利用可能なOP 50 E大腸菌のほとんどを消費したGRワームでいっぱいの10枚の60ミリメートルNGMプレートを準備してください。これらのワームを50ミリリットルの円錐形チューブにすすぎます。プレートあたり5ミリリットルのMナインバッファーを使用して、ワームが落ち着くのを待ってから、上清を慎重に取り除きます。これを繰り返し、さらに2回すすぎますM 9緩衝液を追加し、ワームを沈降させて上清を除去し、次にワームの凝集体に0.1の正常な塩化ナトリウムの6つの容量を追加しますワーム懸濁液と比較して、5つの正常な水酸化ナトリウムの1つの容量と2つの容量の新鮮な漂白剤の混合物を準備します。溶液 この混合物を懸濁液に加えることにより、ワームを漂白します。次に渦巻き、墓虫が溶解し、卵だけが懸濁液に残るまで混合します。これには5分から10分かかります。10 x 対物レンズを備えた位相差顕微鏡を使用して、チューブ内のこの反応をモニターします。卵が分離されたら、800 Gで45秒間、摂氏4度でペレット化し、上清を吸引し、フード内の滅菌水10ミリリットルでペレットを2回すすぎ、遠心分離と吸引を繰り返しますこれらのすすぎ。次に、卵ペレットをM-C-E-H-R培地で再懸濁し、放出された卵を組織培養フラスコに移します。フラスコの卵にテトラサイクリン1ミリリットルあたり100マイクログラムを加えます。このステップは、層流フードで実行する必要があります。厳格な滅菌技術を使用して、液体培養物を摂氏20度のインキュベーターに移し、軌道プラットフォーム上で培養します。70 RPMのシェーカーは、ワームの発達を毎日監視します。7〜10日後、ワームはラビステージまで成長し、ワームを円錐形のチューブに移し、スイングバケットローターで摂氏4度で800Gで5分間ペレット化します。上清を吸引した後、ワームペレットを1容量の0.1モル塩化ナトリウムに再懸濁し、ワームを氷上に5分間沈殿させます。次に、前述の漂白手順を繰り返し、卵をセニック液体培地で培養します。以前と同様に、ワームを養殖する際には無菌技術を利用することが不可欠です。抗生物質の使用を避けることで、シーエレガンスカルチャーに汚染されたバクテリアが実際に存在しないことが保証されます。培養プロセスが過去に繰り返されると、第2世代は培地からテトラサイクリンを放出します。この時点で、同期カルチャを同期用に準備できます。GRワームの漂白後に放出された卵に10ミリリットルのMナインバッファーを追加し、軌道プラットフォーム上で摂氏20度で一晩孵化させます。翌日シェーカーで、幼虫を800Gで5分間ペレット化し、Lワンの幼虫を再懸濁します。10ミリリットルのM-C-E-H-Rで、懸濁液を25平方センチメートルのフラスコに移し、最大密度まで成長させます。ワームが混雑しすぎて培地で利用可能な栄養素を枯渇させないようにするには、数日ごとにワームの成長をチェックする必要があります。アキセンワーム培養物を保存するには、保存バイアル中の0.5ミリリットルのSバッファーにワームのペレットを懸濁し、30%グリセロールを含むSバッファーの1容量を追加します。次に、バイアルをマイナス80°Cに移し、続いて液体窒素で長期保存してワームを解凍し、バイアルを摂氏37度でインキュベートし、ほぼすべての氷が溶けるまで約2分かかります。その後、滅菌条件下で、それらをM-C-E-H-R培地に戻します。M-C-E-H-Rを使用する利点の1つは、線虫の発生に必要な栄養素を正確に調べる研究で見られました。寄生虫をM-C-E-H-Rで増殖させ、ヘムの量を増やして補充し、ヘムの最適レベルと毒性レベルを低く決定しました。さらに、逆ヘム応答性レポーター株を利用して、より狭い範囲の濃度で線虫のヘム状態を間接的に評価しました。4マイクロモルヘムで増殖したこれらの線虫は、高い蛍光を示し、線虫が低ヘム環境にあったことを示しています。ヘム濃度を8マイクロモルに増加させると、GFPの発現は低下した。ヘムの濃度を10マイクロモルに増加させると、線虫はGFPの発現をほとんど示さず、ヘムの20マイクロモルではGFPの発現を示さなかった。この手順を試みる際には、培養物がエミックであることを確認し、細菌汚染を防ぐために、綿密に滅菌された技術を使用することを忘れないでください。このビデオを見た後、M-C-E-H-Rは、多数の海の優雅さを必要とする幅広い用途に利用できるxenex海の優雅な文化を確立し、維持することができるはずです。

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

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C.エレガンスゲノムへの高透過率の染色体外アレイを組み込むための迅速なプロトコール

このプロトコルでは、線虫の体内の細胞運命変換中に細胞プロセスを研究する方法について説明します。観察することができます熱ショック プロモーターに駆動されるニューロン運命誘導転写因子チェ 1 過剰発現と神経細胞のリプログラミング クロマチン制御因子林 53 生殖細胞の RNAi による枯渇のトランスジェニック動物を使用して生体内で。<br...

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

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ケノハブディティス・エレガンスを用いたEGFRおよびRAS阻害剤の同定

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昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

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単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

ここでは、生涯にわたる生理学的パラメータの追跡と蛍光定量のために、単離された個々の線虫を固体培地上で培養するためのプロトコルを紹介します。この培養システムには、動物が逃げるのを防ぐために、シングルワームウェルの周りにパルミチン酸バリアが含まれており、病原菌や化学的ストレッサーなどの嫌悪的介入を使用できます。...

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養

学ぶ Caenorhabditis elegansの無菌液体培地（CeHR）での培養と同期化手法。細菌由来物質を排除し、栄養学的研究や発生生物学における正確な実験結果を得るための技術を習得できます。

培養線虫（Caenorhabditis elegans）微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

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