培養線虫（Caenorhabditis elegans）微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

この手順の全体的な目標は、多数の下流用途向けにCENIC液体媒体に海の優雅さを導入し、成長させることです。これは、最初に飢えた寒天プレートから墓虫を漂白することによって達成されます。手順の2番目のステップは、放出された卵子を抗生物質を使用してM-C-E-H-Rに移し、7〜10日かかる可能性のある墓の段階まで成長させることです。

3番目のステップは、墓を漂白し、追加の抗生物質なしで墓の段階に2回目に成長させることです。最後のステップは、Axeワームを同期させ、ワームの成長と発達を調べる栄養研究に利用することです。最終的に、結果は、野生のタイプCの優雅さがAxe Liquid培地でよく成長し、M-C-E-H-R培地を利用して、細菌の副産物を含まないワームの栄養ニーズを調べることができることを示しています。

この手法の主な利点は、寒天プレート上やバクテリアを含む液体培地でワームを成長させるなどの既存の方法と比較して、細菌の副産物を交絡させることなく栄養成分や毒素の影響をテストできることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、培地の調製とEMIC液体培地への線虫の初期適応のために苦労します。この手順では、バクテリアの食料源なしでC eleganceを成長させるためのM-C-E-H-R-A液体培地の調製について説明します。

ボンネットの下で厳格な滅菌技術を使用して、M-C-E-H-Rの成分を次の順序で混合します。コリン、クエン酸二大腸菌から始めて、ビタミンと成長因子に続きます。myoアセトール、ヒト塩化物を混合し、最後にDI水を加えます M-C-E-H-R混合物を吸引付き0.22ミクロンフィルターでろ過します。

次に、核酸を加え、ミネラルミックス、ラクト、アルブミン、加水分解物、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、リン酸カリウム、deg、グルコースヒープ、ナトリウム塩、および脱イオン水を混合します。次に、混合物を吸引で再度ろ過します。ろ過後、培地にコレステロールを加え、次に培地のアリコートのpHを確認します。

pHは6〜6.5である必要があります。溶液が正しく作られた場合は、綿密な滅菌技術を使用して、低温殺菌した牛乳の20%容量をM-C-E-H-R培地に加えます。メディアは摂氏4度で保管してください。

利用可能なOP 50 E大腸菌のほとんどを消費したGRワームでいっぱいの10枚の60ミリメートルNGMプレートを準備してください。これらのワームを50ミリリットルの円錐形チューブにすすぎます。プレートあたり5ミリリットルのMナインバッファーを使用して、ワームが落ち着くのを待ってから、上清を慎重に取り除きます。

これを繰り返し、さらに2回すすぎますM 9緩衝液を追加し、ワームを沈降させて上清を除去し、次にワームの凝集体に0.1の正常な塩化ナトリウムの6つの容量を追加しますワーム懸濁液と比較して、5つの正常な水酸化ナトリウムの1つの容量と2つの容量の新鮮な漂白剤の混合物を準備します。溶液 この混合物を懸濁液に加えることにより、ワームを漂白します。次に渦巻き、墓虫が溶解し、卵だけが懸濁液に残るまで混合します。

これには5分から10分かかります。10 x 対物レンズを備えた位相差顕微鏡を使用して、チューブ内のこの反応をモニターします。卵が分離されたら、800 Gで45秒間、摂氏4度でペレット化し、上清を吸引し、フード内の滅菌水10ミリリットルでペレットを2回すすぎ、遠心分離と吸引を繰り返しますこれらのすすぎ。

次に、卵ペレットをM-C-E-H-R培地で再懸濁し、放出された卵を組織培養フラスコに移します。フラスコの卵にテトラサイクリン1ミリリットルあたり100マイクログラムを加えます。このステップは、層流フードで実行する必要があります。

厳格な滅菌技術を使用して、液体培養物を摂氏20度のインキュベーターに移し、軌道プラットフォーム上で培養します。70 RPMのシェーカーは、ワームの発達を毎日監視します。7〜10日後、ワームはラビステージまで成長し、ワームを円錐形のチューブに移し、スイングバケットローターで摂氏4度で800Gで5分間ペレット

上清を吸引した後、ワームペレットを1容量の0.1モル塩化ナトリウムに再懸濁し、ワームを氷上に5分間沈殿させます。次に、前述の漂白手順を繰り返し、卵をセニック液体培地で培養します。以前と同様に、ワームを養殖する際には無菌技術を利用することが不可欠です。

抗生物質の使用を避けることで、シーエレガンスカルチャーに汚染されたバクテリアが実際に存在しないことが保証されます。培養プロセスが過去に繰り返されると、第2世代は培地からテトラサイクリンを放出します。この時点で、同期カルチャを同期用に準備できます。

GRワームの漂白後に放出された卵に10ミリリットルのMナインバッファーを追加し、軌道プラットフォーム上で摂氏20度で一晩孵化させます。翌日シェーカーで、幼虫を800Gで5分間ペレット化し、Lワンの幼虫を再懸濁します。10ミリリットルのM-C-E-H-Rで、懸濁液を25平方センチメートルのフラスコに移し、最大密度まで成長させます。

ワームが混雑しすぎて培地で利用可能な栄養素を枯渇させないようにするには、数日ごとにワームの成長をチェックする必要があります。アキセンワーム培養物を保存するには、保存バイアル中の0.5ミリリットルのSバッファーにワームのペレットを懸濁し、30%グリセロールを含むSバッファーの1容量を追加します。次に、バイアルをマイナス80°Cに移し、続いて液体窒素で長期保存してワームを解凍し、バイアルを摂氏37度でインキュベートし、ほぼすべての氷が溶けるまで約2分かかります。

その後、滅菌条件下で、それらをM-C-E-H-R培地に戻します。M-C-E-H-Rを使用する利点の1つは、線虫の発生に必要な栄養素を正確に調べる研究で見られました。寄生虫をM-C-E-H-Rで増殖させ、ヘムの量を増やして補充し、ヘムの最適レベルと毒性レベルを低く決定しました。

さらに、逆ヘム応答性レポーター株を利用して、より狭い範囲の濃度で線虫のヘム状態を間接的に評価しました。4マイクロモルヘムで増殖したこれらの線虫は、高い蛍光を示し、線虫が低ヘム環境にあったことを示しています。ヘム濃度を8マイクロモルに増加させると、GFPの発現は低下した。

ヘムの濃度を10マイクロモルに増加させると、線虫はGFPの発現をほとんど示さず、ヘムの20マイクロモルではGFPの発現を示さなかった。この手順を試みる際には、培養物がエミックであることを確認し、細菌汚染を防ぐために、綿密に滅菌された技術を使用することを忘れないでください。このビデオを見た後、M-C-E-H-Rは、多数の海の優雅さを必要とする幅広い用途に利用できるxenex海の優雅な文化を確立し、維持することができるはずです。