ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

次の実験の全体的な目標は、マイクロ流体電気化学デバイスを使用して、DNAハイブリダイゼーションイベントがインピーダンススペクトルに及ぼす影響を観察することです。これを行うために、電極センサーの配列を可能にするために電気化学チップを製造し、マイクロ流体PDMSチップを製造します。微量サンプルの導入を容易にするために、2つのチップは結合され、一本鎖DNAプローブで機能化されています。

次に、DNAハイブリダイゼーション時に標的の一本鎖DNAが追加され、負に帯電した二本鎖DNAと負に帯電したシアン化物フェリスシアン化物分子との間のより強い反発力により、より高い電荷移動抵抗がもたらされます。最終的には、電気化学的インピーダンススペクトルの変化を測定することで、DNAハイブリダイゼーションイベントを検出することができます。プレートリーダーやJシフトアッセイなどの既存の方法と比較した場合のこの手法の主な利点は、感度や特異性を犠牲にすることなく、同じ手法を少量のサンプルでわずかなコストで実行できることです。

この方法は、特定のDNA配列の迅速なスクリーニングと一本鎖DNA配列のバイナリ動態の研究を可能にすることにより、がん研究、インフルエンザ検出、遺伝子工学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この迅速なハイスループットDNAハイブリダイゼーション分析法は、少量のサンプルで複雑なサンプル調製ステップなしで実行できるため、この手法の意味は、遺伝性疾患、さまざまな形態のがん、またはインフルエンザなどの特定のDNAマーカーを持つ疾患の診断にまで及びます。一般に、マイクロデバイスの開発には制御処理パラメータと、溶液漏れなどの問題を解決するための反復的なアプローチが必要なため、この方法に不慣れな個人は苦労するでしょう。

デバイスの組み立て後 電気化学チップ上に金電極をパターン化するには、ブランクのプライムグレードの4インチシリコンウェーハをピンセットで保持し、ウォッシュボトルを使用してウェーハの両面の表面をアセトン、メタノール、次にイソプロパノールですすいでください。このプロセスは、以下、脱イオン水の流れの下でのA MIクリーンと呼びます。ウェーハからイソプロパノールを洗い流し、窒素ガンを使用してウェーハを乾燥させます。

ウェーハをプラズマ化学蒸着またはP-E-C-V-D装置にロードします。パラメータを入力して厚さ1マイクロメートルの二酸化ケイ素イオン層を生成し、次に自動化プロセスを開始し、DCスパッタリングツールを使用してウェーハ上に厚さ200オングストロームのクロムの層を堆積させ、次に厚さ2000ストロームの金の層を堆積させます。スピナーにウェーハをセットし、窒素ガンで表面をダストし、パスターピペットを使用してスピンPRを1つのポジフォトレジストスピンに適用して、厚さ約1.6マイクロメートルの均一なフィルムを作成します。

次に、ホットプレート上でウェーハを摂氏100度で1分間プリベークします。フォトレジストを塗布したウェーハをマスクアライナー装置にセットします。次に、405ナノメートルで190ミリジュール/センチメートルの二乗の露光を開始し、マスクアライナーがシャッターを開き、設計された機能を備えたマスクを介してフォトレジストを光に露光します。

露光後、ウェーハを3 5 2現像液が入ったガラス皿に浸し、穏やかに振とうしながら30秒間インキュベートします。次に、ウェーハをdi水の流れですすぎ、以前と同様に窒素ガンで乾かします。次に、金エッチング液を入れたガラス皿にウェーハを沈め、穏やかに振とうしながら1.5分間インキュベー

次に、ウェーハを前述のクロムを含むガラス皿に移し、ウェーハ上のクロムマークが消えるまで穏やかに振とうしてインキュベートします。これには約 30 秒かかります。ウェーハをdi水ですすぎ、ピンセットでウェーハを保持している窒素ガンで乾かします。

MIクリーン手順を使用してフォトレジストを剥がします。その後、DI水ですすぎ、手袋を2枚重ねた窒素ガンで乾かします。ウェーハをピラニアクリーン溶液を入れたテフロン皿に1分間浸します。

次に、ウェーハをdi水ですすぎ、窒素ガンで乾かします。次に、白金電極をパターン化し、ウェーハをスピナーにロードします。窒素ガンを使用し、パスターピペットディスペンスを使用して表面にPR 2つのポジフォトレジストを塗布し、表面を回転させて、厚さ約1.4マイクロメートルの均一な膜を作成します。

ウェーハを摂氏100度のホットプレートに置き、1分間プリベークします。プリベーク後、フォトマスクを通してウェーハを30ミリジュール/センチメートル四方、405ナノメートルの二乗で露光します。次に、ウェーハを摂氏125度のホットプレートに置き、45秒間焼きます。

マスク、アライナー、フラッドからマスクを取り外します。フォトマスクなしで、波長405ナノメートルで1000ミリジュール/センチメートルの二乗でウェーハを露光します。露光後、Z 400 K現像液を6対1で入ったガラス皿にウェーハを浸して現像します。

穏やかに振とうしながら2分間インキュベートします。次に、ウェーハをdi水ですすぎ、窒素ガンで乾かします。電子ビーム蒸着システムを使用して、ウェーハ上に厚さ400オングストロームのチタン層と続いて1600オングストロームの厚さのプラチナ層を堆積させます。

アセトンを充填したガラス皿にウェーハを置き、皿を超音波浴に5分間置いて写真を持ち上げます。その後、ピンセットでウェーハを保持するのを防ぎます。ウォッシュボトルを使用して、ウェーハの両面をアセトンですすぎ、次にイソプロパノールですすいでください。

ウェーハをdi水ですすぎ、窒素ガンで乾かします。アッセイチャネル用の金型を準備するには、ブランクの4インチテストグレード品質のシリコンウェーハをMIクリーン手順ですすいでください。前と同様に、ウェーハからイソプロパノールをdi水ですすぎ、続いて窒素ガンで乾燥させます。

スピナーにウェーハをセットし、窒素ガンでウェーハの表面をダストし、パスティピペットを使用して表面にPR3枚のネガフォトレジストを塗布して、厚さ約100マイクロメートルの均一なフィルムを作成します。ウェーハをホットプレートに置き、2段階のベーキング手順を使用して事前にベークします。まず、室温から摂氏65度まで、毎時300°Cで温度を上げます。

その後、摂氏65度で10分間保持します。1時間あたり300°Cで95°Cまで上昇し、その後30分間保持します。フォトマスクを通して、405ナノメートルの波長で2, 500ミリジュール/センチメートルの二乗でウェーハを露光します。

次に、ウェーハをホットプレートに置き、室温から摂氏95度まで毎時300°Cでウェーハをポストベークします。摂氏95度で10分間保持します。プロピレングリコール、モノメチルエーテルアセテート、またはPGMEA現像液を含むガラス皿にウェーハを浸し、10分間現像します。

ウェーハをイソプロパノールですすぎ、窒素ガンで乾燥させてアッセイチャネルを作製し、アルミホイルで金型ウェーハの周りの囲いを見つけ、未硬化のポリジメチルスボキサンまたはPDMSを金型にゆっくりと注ぎます。PDMSを搭載したボックス炉で、室温から80°Cまで5分間かけて温度が上昇し、80°Cで17分間維持する2段階のベーキング手順を使用して、金型を焼きます。金型が冷えたら、PDMSを金型から剥がし、アルミホイルの上に置きます。

ここに示すように、サージカルナイフでアッセイチップを切断し、生検パンチングツールで穴を開けます。PDMSアッセイチャンネルを電気化学チップ上の作用電極に手動で位置合わせします。PDMSは電気化学チップにしっかりと付着し、チャネルを密閉し、漏れを防ぎます。

短いフレキシブルチューブをアダプターとして使用して、フレキシブルチューブをプラスチック製のエルボまたはストレートコネクタに接続し、垂直マイクロチャネルを機能させます。一本鎖DNAプローブが入ったシリンジをチューブに接続し、シリンジポンプに入れます。コネクタをデバイスのパンチインレット全体に取り付けます。

この手順の最も難しい側面は、気泡を発生させずにマイクロチャネル内で溶液を流すことです。成功を確実にするには、溶液を非常にゆっくりと流します チャネルの均質な充填を達成するためには、毎時200マイクロリットルの流速でポンプを開始し、3つの別々のマイクロチャネルのそれぞれに異なる一本鎖DNAプローブインキュベーション溶液をゆっくりと充填します。1時間インキュベートした後、シリンジチューブとコネクターを交換してPBSでマイクロチャネルをすすぎます次に、シリンジチューブとコネクターを交換して、10ミリモルのPBS100ミリモル塩化ナトリウム、および1.395ミリモルのTCEPで10ミリモルの6量性CAPTO1HエタノールMCHからなる溶液でマイクロチャネルを満たします1時間インキュベートします。

次に、ピンセットを使用する前と同様にPBSですすいでください。PDMSを持ち上げて、水平方向に90度回転させ、下に置きます。これにより、反応チャンバーの別々の列が露出し、各列にはDNAハイブリダイゼーション分析用の固有のカウンター電極と参照電極が含まれています。

交換、シリンジチューブとコネクタは、Forex濃縮生理食塩水クエン酸ナトリウムSSCバッファーの制御測定溶液でマイクロチャネルを充填するためのコネクタは、インキュベーション後20分間インキュベートし、シリンジを交換して、マイクロチャネルを5ミリモルのフェリスシアン化物で満たしますPBS溶液中の5ミリモルのシアン化物フェリス。次に、電気化学インピーダンス分光法またはEISによって、さまざまな周波数の電気化学システムのバックグラウンドインピーダンス値を記録するには、プローブチップを使用してポテンシャル統計をワーキングカウンターと参照電極に接続します。EIS測定のパラメータをコンピュータソフトウェアに入力し、測定を開始します。

マイクロチャネル内の各作用電極についてこの測定を繰り返して、非相補的および相補的な一本鎖DNAターゲット交換のDNAハイブリダイゼーションを測定します。シリンジチューブとコネクタ。標的一本鎖DNAの1マイクロモルを含む4×濃縮SSCバッファーでマイクロチャネルを充填し、20分間インキュベートします。

バイオチップのサイクリックボリュームの電気化学的活性を検証するために、各ターゲットの一本鎖DNA溶液のコンピュータ上のソフトウェアでEIS測定を開始して測定を行いますテレメトリ測定は、電気活性酸化還元で満たされたマイクロチャネルで行われました カップルシアン化シアン化物 ここに示されているのは、9つの作動電極のサイクリックボリュームテレグラムです。すべての電極で形状、ピーク高さ、ピーク分離が類似していることから、高い再現性が示され、バイオチップがDNAハイブリダイゼーションイベントを検出する能力が実証されています。

3つの一本鎖DNAプローブとそれらの相補的および非相補的一本鎖DNAターゲットとの間のハイブリダイゼーションイベントについて電気化学的インピーダンス変動を測定しました。相補型一本鎖DNAターゲットを導入し、プローブとハイブリダイズした場合、バイオセンサーの感度を実証するために、非相補型一本鎖DNAターゲットの導入と比較して、より高い電荷移動抵抗の変化が観察されました。異なる濃度の相補的一本鎖DNAターゲットをセンシングプローブに導入したのは、グラフ上の矢印で示されている増加ターゲット一本鎖DNA濃度の導入後の電気化学インピーダンス分光測定のナイキストプロットです。二本鎖DNAとシアン化フェリスフェリスシアン化物分子との間の強い反発力により、標的の一本鎖DNA濃度が高いほど、約15ヘルツの低周波数でインピーダンス値の増加が見られました。

全体として、BIOCHIPSはDNAハイブリダイゼーションイベントの存在を迅速に感知する能力を示しています。このビデオを見れば、マイクロ流体電気化学デバイスを開発・製造し、それを使用してDNAハイブリダイゼーションイベントを検出する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試行する際は、この手順に従って、信号対看護師の比率、安定性、感度など、さまざまなBIOSパラメーターを最適化することを忘れないでください。

DNAの突然変異、組み合わせ、競合などの追加の疑問に答えるために、わずかに異なる核酸配列を持つ一本鎖DNAターゲットの導入などの他の方法を実行することができます。マイクロファブリケーションプロセスソリューションでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、体の目と手の保護に常に警告する必要があることを忘れないでください。