マウス精巣の生体内マイクロインジェクションやエレクトロポレーションで

この手順の目的は、マウスの精巣に遺伝子構築物のマイクロインジェクションを行い、続いてInVivoエレクトロポレーションを行うことです。これにより、精子形成と精巣機能に焦点を当てた包括的な遺伝子解析を行うことができます。これは、まずPrepU腺の真上にある腹部切開部から精巣にアクセスすることで達成されます。

2番目のステップは、血管を脂肪組織から解放することにより、精巣に取り付けられた遠心性管をマイクロインジェクション用に準備することです。次に、耳鼻咽喉科管を装填されたマイクロインジェクションピペットで穿刺し、染色遺伝子構築液を精巣細管に投与します。最後のステップは、精巣の多国性エレクトロポレーショントランスフェクションです。

最終的に、トランスフェクションされた精巣を3日後に抽出し、蛍光顕微鏡法または利用された報告された遺伝子コンストラクトに応じたルミノメーター測定によりトランスフェクションを評価します。この一過性トランスフェクション法としてのマウス精巣に対するマイクロインジェクション知能操作技術の組み合わせは、トランスジェニック動物やノックアウトマウスなどの既存のアプローチに比べて多くの利点を確実に提供します。これにより、高速なパフォーマンス、低コスト、および適度な技術スキルの必要性が保証されます。

この方法論的アプローチは、男性の不妊治療研究の分野で利用可能な技術に賢明であることを願っています。これは、実験的な遺伝子と生殖能力のプロセスに関する幅広い問題に対処するのに本質的に役立つかもしれません。これは、この方法をすべての機能喪失実験の利益の形で遺伝解析に使用する場合に特に可能になります。

おそらく、例えば精子形成特異的遺伝子の調節要素を調べるのにも非常に役立つでしょう。手順を開始するには、6〜8週齢の雄マウスに10%ケタミンと2%キシラジンの1対1の混合物を皮下麻酔します。次に、つま先をつまんでマウスが深い麻酔下にあることを確認します。

乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。次に、電気シェーバーで腹部の毛を取り除き、その後手術部位を消毒します。腹部の中央にあるPrepU腺の真上に腹側切開を行います。

そのためには、皮膚を引っ張って、小さな横方向の皮膚カットを行います。次に、腹部の筋肉層に沿って進みます。腹部の脂肪パッドを慎重に引き上げて、付着した精巣を露出させ、腹部の滅菌紙の上に置きます。

その後、実体顕微鏡を使用して、マイクロインジェクション用の耳鼻咽喉管を見つけます。これは、精巣と精巣上体との間の細い血管接合部であり、精巣動脈に隣接して位置しています。耳鼻咽喉科の管を覆っている脂肪組織を細い鉗子で取り除きます。

その後、剥離管を滅菌紙片の上に置き、周囲を損なうことなく管が簡単に見えるようにします。さらに、以前に着色プラスミド溶液をロードしたマイクロインジェクションピペットをマイクロマニピュレーターインジェクターユニットに接続します。その後、マイクロインジェクション針をEENTダクトと平行に配置し、先端をREIT精巣に向けてください。

次に、細いピンセットを使用して、マイクロインジェクションピペットの上のダクトを剥がします。ピペットを引っ張るときは、ピペットがダクトと平行に保たれていることを確認してください。針を慎重に精巣に向け、アルブギネア内膜の真下にあるREIT精巣を貫通するところで停止します。

次に、マイクロインジェクターのパラメータを設定します。続いて、遺伝子構築液の注入を開始する。精巣の充填状況を観察することにより、注入プロセス全体を監視します。

着色されたプラスミド溶液の助けを借りて、精巣をその体積の3分の2までしか構築しません。効果的なエレクトロポレーションを可能にするため。ピンセット電極をPBSの1倍に浸して、適切なコンダクタンスを確保します。

次に、湿った電極の間にテストをわずかに押し込み、エレクトロパラタで電気抵抗を測定します。次に、合計8つの方形パルスで精巣に電流を流せるように電気を適切に設定します。4つの異なる精巣部位で、精巣全体の周囲にエレクトロポレーションを包括的に行います。

エレクトロポレーションが終了したら、精巣を元の位置にできるだけ近い腹部に戻します。つまり、内側の筋肉層は吸収性の外科用縫合糸でした。次に、縫合糸クリップで皮膚を閉じます。

マウスが麻酔から回復するのを待ちます。37°Cのヒートパッドで温めた滅菌ボックスに入れ、ペーパータオルで準備します。パッドは、ケージの半分だけが温まるようにする必要があり、熱勾配を作成します。

さらに、マウスを別のペーパータオルで覆うと、ストレスをさらに軽減できます。動物が完全に目覚めたら、それを新しい清潔で完全に装備されたケージに移します。しかし、さらなる回復は、最終的にマウスを動物施設に戻すまで、回復プロセスを監視します。

この図は、蛍光検出によるin vivoエレクトロポレーションの3日後のマウント精巣全体を示しており、C57黒色6マウスのトランスフェクション精巣は、増強された緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質を示している。これが精巣の組織学的セクションです。PE eeg、FPC oneによる片側エレクトロポレーションの3日後、トランスフェクションされたSeminiferous尿細管細胞は、その典型的な球状に組織化された構造とともに、緑色の蛍光で示されています。

彼らの核は対比染色されており、2つのプロ3は青でした。この手順を実行している間、耳鼻咽喉科の管とその脂肪組織の放出を特定するプロセスは非常に洗練されていることを覚えておくことが重要です。したがって、実際の生体内体験を達成する前に、まず死んだ動物で練習することができます。

マイクロインジェクションエレクトロポレーションと最終テストハーベスティングのアンチ進行に続いて、Q-R-T-P-C-R船やウェスタンブロッティングなど、多くの技術を実行することが可能です。したがって、テスター遺伝子のxiningは、タンパク質の発現パターンであり、翻訳後修飾は当然のことです。したがって、これらのツールによって、例えば精子形成のように、その根底にある複雑なメカニズムや規制など、多種多様なトピックが攻撃される可能性があります。