ネズミリンパ節間質細胞の単離

この手順の全体的な目標は、リンパ節間質細胞を分離することです。これは、最初にリンパ節嚢を破壊することによって達成されます。第2ステップでは、リンパ節断片をコラゲナーゼ4とDナーゼ1で消化します。

その後、酵素をコラゲナーゼDおよびDナーゼ1に置換し、自動マルチチャンネルピペットでフラグメントを機械的に分解します。最終的に、単離されたリンパ節細胞の細胞表面分子発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けることができる。この技術が既存の方法よりも優れている点は、この方法により、リンパ節のSHR細胞が標準化された酵素手順を用いて消化され、細胞の生存率と表面分子発現を維持する機械的脱凝集によって補完

解剖したリンパ節を、2ミリリットルの氷冷培地を含む滅菌ペトリ皿に入れることから始めます。次に、25ゲージの針を備えた2つの1ミリリットル注射器を使用して、リンパ節嚢を破壊します。次に、破壊された組織を、コラゲナーゼ4とDNA1を補充した750マイクロリットルの培地を含む5ミリリットルの円錐管に移し、磁気攪拌を行う。

次に、マグネチックスターラー上の摂氏37度の水を含むビーカーにチューブを置き、セルスラリーを1秒に1ラウンドで30分間攪拌します。攪拌後、リンパ節の断片を沈殿させてから、上清を慎重に取り除きます。現在、非間質細胞がリンパ節断片に移す750マイクロリットルの新鮮な培地に移し、コラゲナーゼDおよびDナーゼ1を補充し、その後、摂氏37度でさらに5分間組織を攪拌する。

次に、自動マルチチャンネルピペットを使用して、700マイクロリットルの容量でリンパ節組織断片を最大速度で10サイクル分解し、10分後に組織断片を再度攪拌します。さらに、自動マルチチャンネルピペットで組織凝集体を最大速度で99サイクル分解します。次に、7.5マイクロリットルの0.5モルEDTAをチューブに加え、自動ピペットで組織懸濁液をさらに99サイクル混合します。

最後の脱凝集サイクルの後、750マイクロリットルの培地を細胞溶液に加え、70マイクロメートルのナイロンメッシュで細胞をろ過します。次に、細胞を1500Gおよび摂氏4度で5分間ペレット化します。フローサイトメトリーでリンパ節間質細胞集団を可視化するには、適切な細胞サンプルを生死トラッカーと目的の抗体で、2%FCSを含むHBSSの100マイクロリットルで、暗所で摂氏4度で少なくとも20分間染色します。

その後、500マイクロリットルのHBSSで細胞をFCSで洗浄し、再懸濁します。100マイクロリットルのHBSSおよびFCSのペレットは、フローサイトメーターで細胞を流し、CD 45陽性細胞をゲートアウトして造血細胞を排除し、次に生きた一重項集団上を歩行します。最後に、GP 38 と CD 31 をプロットして、T ゾーン網様体細胞、リンパ管内皮細胞、血液内皮細胞、およびダブルネガティブ細胞を視覚化します。

細胞集団。リンパ節間質細胞サブセットの消化後に回収された総細胞数は、リンクおよびフレッチャープロトコルと比較して、ちょうど実証されたプロトコルでわずかに高かったこのプロトコルによる単離後のリンパ節間質細胞の生存能力が、公開されたプロトコルを使用して回収されたものと同様であることを実証した。これおよびリンクおよびフレッチャープロトコールを介して単離されたTゾーン網状細胞およびリンパ管内皮細胞を、IAB CD one 40 a CD 80、PD L one、およびCD 40の発現について比較した。

5つの表面分子すべての発現は、前述のプロトコルと両方の間質細胞サブセットのリンクプロトコルによる消化時に高かったことから、コラゲナーゼ4およびDによる一部の表面分子の分解は、コラゲナーゼpおよびDYS空間による分解よりも堅牢ではないことが示唆されています。このビデオを見れば、リンパ節間質細胞の4つの主要な亜集団を成功裏に分離しながら、それらのさらなる特性評価と分析に役立ついくつかの表面分子の発現を保持する方法について十分に理解できるはずです。