TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

この手順の全体的な目標は、生細胞内の個々のクラスリンコーティングピットのダイナミクスを視覚化し、定量化することです。これは、最初に蛍光タグ付きエンドサイトーシスタンパク質およびカーゴタンパク質を接着細胞株にトランスセクトすることによって達成されます。次のステップは、全反射、蛍光、または芝生顕微鏡で細胞をイメージングすることです。

クラスリンコーティングされたピットの小さなセットの寿命は、画像処理および分析プログラムを使用して手動で定量化されます。最後のステップは、客観的な自動検出と分析により、クラスリンコーティングされたピットの寿命を定量化することです。最終的に、芝顕微鏡法を使用して、個々のクラスリン被覆ピットのダイナミクスを単一イベント分解能で定量化し、クラスリンを介したGタンパク質共役受容体のエンドサイトーシスを調査します。

この方法は、エンドサイトーシスのアセンブリとダイナミクスが、存在するさまざまなエンドサイトーシスタンパク質とカーゴタンパク質に基づいてどのように変化するかなど、メンブレン輸送分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。タグGタンパク質共役受容体またはGPCRおよび/またはClaro機械のコンポーネントをコードするプラスミドを使用して、HEC 2 93細胞をトランスフェクションすることを開始する。テキストプロトコールに詳述されているように、トランスフェクションの翌日に12ウェルプレートに、0.5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSとそれぞれに1ミリモルのEDTAを加えます。

次に、3ラウンドの滅菌25ミリメートルカバーを6の別々のウェルにスリップします。ウェルプレート 各ウェルに2ミリリットルの培地を充填します。カバースリップをウェルの底までそっと押し下げて、カバースリップの下側で細胞が成長するのを防ぎます。

次に、12ウェルプレートのウェルを手動で攪拌して、ウェルの底から細胞を持ち上げます。1ミリリットルのDM EMと10%FBSを追加して再送します。次に、1つのウェルから持ち上げたセルを3つのカバースリップに均等に分配します。

イメージングする前に、カバースリップ上で細胞を少なくとも48時間増殖させます。また、クラスリンコーティングされたピットとカーゴダイナミクスのイメージングのために、細胞が広がって平らであることを確認してください。まず、テキストプロトコルに記載されているように、細胞を抗体で事前にインキュベートします。

次に、一対の鉗子と先端で曲げられた25ゲージの針をフックに使用して、カバースリップをライブセルイメージングチャンバーに移す準備をします。利き手で一対の鉗子を持ちます。曲がった針をもう片方の針に保持します。

フックがガラスに向かって下向きに曲がるまで針を回します。ニードルフック側を下にして、6ウェルプレートの底面をゆっくりと引きずり、カバースリップに引っ掛けます。カバースリップの表面を傷つけないように注意してください。

カバーをそっと持ち上げ、ウェルの底からスリップアップします。カバースリップをウェルの壁にバランスを取ってサポートします。鉗子を使用してカバースリップの端近くをつかみ、カバースリップセル側をイメージングチャンバーまで移動します。

チャンバーを組み立て、700マイクロリットルの予温イメージング培地を追加します。チャンバーを顕微鏡に移した後、芝生油浸対物レンズを使用して細胞に焦点を合わせ、従来のエピ、蛍光、または共焦点照明モードで細胞を画像化し、重要な安全対策として適切なコンストラクトを発現する細胞を特定します。レーザービームの角度に常に注意し、常にレーザービームを観察者から遠ざけてください。

次に、細胞の周りの原形質膜の輪郭が消えて細胞の底面が現れるまで、発現細胞の底面に焦点を合わせます。これは、ミューオピオイド受容体などの原形質膜に局在するカーゴタンパク質で最も明白です。従来の落射蛍光でイメージングに同じレーザーを使用する場合は、焦点が合わなくなるまでレーザーの入射角を大きくします。

細胞内部の蛍光は消え、細胞の周りの原形質膜の輪郭は見られません。芝mに入ったら、励起レーザーが対物レンズを通って反射し、対物レンズの上に見えないことを確認します。レーザースポットが見えているかどうかを確認することで、ピントを絞り込み、鮮明な画像を取得します。

細胞が同定されたら、少なくとも3秒ごとに10分間画像を取得します。すべての手順を繰り返して、追加のセルを画像化します。エンドサイトーシスダイナミクスの解析を開始するには、画像J.Imagesでファイルを開き、TIFFファイルの1つのスタックとして保存します。

インターリーフチャネル付き。ポップアップウィンドウで[画像ハイパースタック]を選択し、スタックからハイパースタックを選択して、画像をハイパースタックに変換します。集録したチャンネル数を入力します。

Zack用に1つ入力し、ムービーフレーム数を入力します。ハイパースタック形式では、2 つのスクロールバーを持つウィンドウが表示されます。上部のバーを使用してチャネル内を移動し、下部のバーを使用して時間内を移動します。

寿命がアッセイされるタンパク質のチャネルまでスクロールします。ムービーの最初のフレームを超えて移動し、既存のクラスリンコーティングされたピットや、全時間が表示されていないCCPのインクルードを減らします。ランダムに選択されたスポットの周囲に関心領域またはROIを描画します。

スポットが表示されているフレーム数をカウントします。オブジェクト認識で分析を開始するには、デフォルトで出現した画像解析ソフトウェアで生の画像ファイルを開きます。カラー画像が表示されます。

ディスプレイ調整ウィンドウを使用して、チャンネルの明るさを調整します。チャンネルの名前をクリックすると、表示される色を変更できます。チャンネルの横にあるチェックボックスをオフにして、チャンネルが表示されないようにします。

オレンジ色の斑点のあるアイコンをクリックして、スポットを作成します。セルの周囲のROIを選択し、それを使用して、明るいリーディングエッジとプラークを誤って検出する領域を除外します。スポットの直径を測定して、アルゴリズムの初期推定値を提供します。

スライスモードに切り替えて、スポットの極端をクリックしてその直径を測定します。これは、割譲前の形成後の安定性の高さでA CCPを示すように見える4つまたは5つの丸いスポットに対してこれを行い、これらの測定値を使用して、ミクロンの10分の1に最も近い平均直径を計算します。スポットを検出するには、サーパスモードに戻るには、検出する適切なチャネルを選択します。

平均測定直径(通常は0.3ミクロンまたは0.4ミクロン)を入力します。青い前方矢印をクリックして、スポットを定量化します。フィルターを調整して品質でスポットをフィルタリングし、背景なしでできるだけ多くのスポットをキャプチャします。

品質フィルターはデフォルトで選択されています。品質曲線をガイドとして使用して、適切なしきい値を設定します。フィルターの下限しきい値をマウスの左ボタンで、カーブの最初のくぼみに移動します。

これは、フィルターの出発点として適しています。この位置は通常、検出を目に見えるスポットのみに絞り込むためです。編集スポット画面でアラントスポットを削除する モードを選択し、スポットをクリックします 黄色に変わったら、[削除]をクリックします。

次に、青い矢印をクリックして、アルゴリズムの構築を続行します。トラックを動いているブラウニーに設定することで、トラックを測定します。CCPは指向性の動きを示さず、原形質膜を横切るドリフトを最小限に抑えるだけです。

このアルゴリズムは、そのモーションに最も適しています。次に、最大距離を0.7ミクロンなどの小さな値に設定します。距離を短く設定すると、隣接するスポットの接続が最小限に抑えられ、CCPまたは細胞移動を通じて細胞スポットを継続的に追跡できます。

次に、最大ギャップ サイズを 1 に設定します。これにより、フレームが 1 つだけ欠落している場合でも、トラックを続行できます。連続してギャップサイズが3を超えると、異なるトラックが誤ってリンクされます。

次のステップは、トラックの表示をドラゴンテイルに切り替えることです。動画をスクロールして、検出品質を観察します。隣接するスポットが接続されている場合は、最大距離を0.7ミクロン未満に減らします。

スポットがあまりにも簡単に分割されている場合は、最大ギャップサイズを増やします。青い矢印をクリックして、トラックを作成します。これにより、トラックをフィルタリングするためのフィルタートラック画面が表示されます。

強度フィルターを使用して、追加の明るいプラークを除去します。次に、ディスプレイスメントフィルターを使用して、芝生フィールドに入るエンドソームを除去します。スポットが長いと変位も長くなるので注意してください。

緑色の二重矢印をクリックして、プロトコルを完了します。データをエクスポートするには、[統計] タブに移動します。1枚のフロッピーディスクのアイコンをクリックして、選択した統計をエクスポートします。

一連のフロッピーディスクのようなアイコンをクリックして、すべての統計をエクスポートします。A接着性原形質膜と共焦点モードに着目すると、薄暗い蛍光で満たされた細胞が明らかになります。対照的に、細胞の中心に焦点を合わせると、細胞膜が細胞の周りの蛍光の輪として現れます。

焦点の合わない蛍光は、従来のエピ、蛍光、または誤った角度の芝に切り替えると明らかになります。芝の角度が正しい場合、原形質膜は非常に鮮明で、クリアで明るく、焦点が合っていません。蛍光によって画像が乱れることはありません。

ベータアレスチンが細胞質プールにあるとき、芝生フィールドにはほとんどなく、ぼんやりと外側の焦点に見えます。MORがアゴニストであるベータによって活性化されると、アレスチンは原形質膜に動員され、ベータアレスチンと受容体の両方がCCPに再分配されます。これらのクラスターの寿命は手動で定量化されます。

エンドサイトーシスの完了に関する3つのパラメータを使用すると、CCPを示すスポットが完全に点滅したり消えたり、より大きな構造をつまんだりすることができます。ここに示されているのは、MAを使用して検出されたCCPsをフィルタリングした後、非動的プラーク構造、オーバーレイされた白い球体、検出されたスポットを示し、全生涯にわたって検出できなかった薄暗いスポットも品質フィルターで除外されました。このビデオを見れば、芝生顕微鏡を使用して個々のカテーテルコード化されたピットを視覚化する方法を非常によく理解できるはずです。