Name: TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶTIRF顕微鏡を用いたクラスリン被覆ピットの動態解析法。Gタンパク質共役型受容体のエンドサイトーシスメカニズムを単一イベント解像度で可視化・定量化し、細胞シグナル伝達の理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、Imarisの助けをいただいたC. Szalinski博士、H. Teng博士、M. Bruchez博士、技術的な助けとアドバイスを提供してくださったR. Vistein博士、D. Shiwarski博士、試薬と有益な議論をいただいたM von Zastrow博士、Dr. T Kirchhausen、Dr. D Drubin、Dr. W Almersに感謝したいと思います。T32 助成金による資金は SLB と NIH DA024698 にNS007433、MAP にDA036086されます。

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li>
<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li>
<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、リアルタイムで生きた細胞内の個別のCCPのレベルでクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）を可視化するTIRFMの使用を記載している。 CMEは、多くの空間的および時間的に独立した個別のイベントの累積効果により媒介される迅速かつ高ダイナミックなイベントです。そのような結合は、フローサイトメトリーまたは固定細胞アッセイは、内在化タンパク質の量、またはタンパク質の電子顕微鏡局在化を測定する表面ビオチンまたはリガンドを用いて、内在化の生化学的測定値として現在使用されているほとんどのアッセイは、固定された時点でのタンパク質局在のアンサンブルの変化を監視。これらの既存の方法は、CMEのために必要であるが、CMEや他の動的な膜輸送プロセスの生理的尺度に一致する空間的および時間分解能を欠くタンパク質を特定するのに非常に有用であった。最近の証拠は、清算機関がそのタンパク質組成とダイナミクス9-1に不均一であることを示唆しているので、これは重要です2、およびCMEはそう急速に空間的に離散的に規制されているように。ライブセルTIRFMは、生細胞中で、リアルタイムで、空間的に分離された単一のCCPのレベルでCMEを分析する...

クラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）の過程は、小胞1-3に貨物を収集し、原形質膜を操作するクラスリン媒介エンドサイトーシス機構の多くのコンポーネントの時宜を得た到着時に依存している。 CMEは、膜が変形し、エンドサイトーシス1の発生期の現場で一緒になる貨物アダプタータンパク質によって開始されます。これらのタンパク質は、クラスリン被覆ピット（CCP）4を形成し 、かご状構造に組み立てるコートタンパク質クラスリンを募集。 CCPが完全に球状に組み立てられると、膜の切断は、主に大規模なGTPアーゼの作用を介して、ダイナミンは、無料のクラスリン被覆小胞（CCVS）5,6を生成します。この内在化は、コンポーネントが、CMEの複数のラウンドのために再利用することができるように、クラスリンコートの急激な分解をトリガします。 CMEに関与するタンパク質の発見および特徴は、伝統的なbiochに根付いてきたemical、遺伝的および顕微鏡技術4-6,8。これらのアッセイは、これらのエンドサイトーシスのコンポーネントの役割と相互作用点を解明した。売買機構の必須成分を定義するために非常に有用であるが、これらのアッセイは、高度CMEコンポーネントまたは貨物濃度の動的挙動を捉えることに限定されている。 CMEが定義されたステップにおけるタンパク質のモジュールのセットの振り付けアセンブリによって駆動されるので、これは重大な制限であり、そして個別のエンドサイトーシスイベントのダイナミクスの小さな変化は、エンドサイトーシスに大きな累積的な結果をもたらすことができるからである。さらに、最近のデータは、個別の清算機関がこのプロセスの生理学的調節が非常に空間的および時間的に9-14を拘束されていることを示唆している、組成物中にと行動の両方で異なる場合がありますことを示している。個別のエンドサイトーシス事象の可視化、したがって、複数の冗長CMEに関与するタンパク質とどのようにこれらのタンパク質は、Bを制御することかもしれないがある理由を理解することが不可欠であるyの生理学的信号は、貨物内在化を調節する。 ここでは、生きた細胞内の個別のCCPのダイナミクスのレベルでCMEを観測する全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の使用を記載している。 TIRFMは、カバーガラスとセル15,16の流体環境との間の屈折率の差に依存しています。励起光が臨界角以上で細胞に向けられるとき、それは内部カバースリップの上に、約100nmを拡張する照明の薄いフィールドを維持するエバネッセント波を作成し、反射される。これは、この狭いフィールド内の蛍光分子が励起されることを保証します。実際に、これは原形質膜上またはその近くの蛍光分子の励起を可能にし、細胞の内部部分からの蛍光を最小化する。これは、原形質膜、共同でイベントを視覚化するための有意に高い信号対雑音比、z軸の解像度を提供このような従来の落射蛍光または共焦点蛍光顕微鏡のようなより一般的に使用されるモードにmpared。また、入門、実用的なレベルで、個別の貨物エンドサイトーシスイベントの単純な形態学的特徴および動力学を分析し、定量するために一般に使用される画像解析プラットフォームの使用を記載している。

<table><tbody><tr><td>L-グルタミンとピルビン酸ナトリウムを含むDMEM/高グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3024301</tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no Calcium, no magnesium</td><td>Gibco, by Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Free Acid</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco, by Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE by Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>25 mm coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Corning cell culture treated flasks, 25 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養 6 ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One、VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG[</td><td></td></tr><tr><td>D-Ala2、N-Me-Phe4、Gly5-ol]-エンケファリン酢酸塩 (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 タンパク質ラベリングキット</td><td>Life Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Imaris 画像解析ソフトウェア</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris、自動解析用</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 倒立顕微鏡とフィルターキューブやフィルターなどの必要なアクセサリ</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TIRF アームと必要なアダプターNikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>入射角の調整用</td></tr><tr><td>iXon+ EMCCDカメラと</td><td>アダプターAndor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tirf顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のgタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

多くの重要なシグナル伝達受容体は、クラスリン媒介性エンドサイトーシス(CME)のよく研究されたプロセスを通じて内在化されます。エンドサイトーシスの全体的な変化を測定する従来の細胞生物学的アッセイでは、CMEに関与する30を超える既知の成分が特定されており、生化学的研究により、これらの成分の多くの相互作用マップが生成されています。しかし、CMEは非常にダイナミックなプロセスであり、その制御は複雑で繊細であることがますます明らかになっています。この原稿では、全反射蛍光法(TIRF)顕微鏡を使用して、クラスリン媒介エンドサイトーシス機構の成分のダイナミクスを、生細胞内で、このプロセスを媒介する個々のイベントのレベルでリアルタイムに直接視覚化する方法について説明します。このアプローチは、生理学的調節に見られるように、エンドサイトーシスを全球的にブロックすることなく、エンドサイトーシスを変化させる可能性のある微妙な変化を解明するために不可欠です。この手法を使用して、新たな関心領域、つまり、異なるクラスリン被覆ピット(CCP)のダイナミクスを調節する貨物組成の役割を分析することに焦点を当てます。このプロトコールは、広く利用可能なさまざまな蛍光プローブと互換性があり、細胞表面から内在化される多くのカーゴ分子のダイナミクスの可視化に適用できます。

生細胞TIRF顕微鏡を用いて、私たちは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）とそのエンドサイトーシスアダプタータンパク質β-アレスチンをμ-オピオイド受容体（MOR）のエンドサイトーシスダイナミクスを記録している。 β-アレスチン構築物は一過性に、図1で概説したプロトコルを用いて安定に発現MOR細胞株にトランスフェクトし、96時間後に画像化した。安定した細胞株におけるMORはN末端pH感受性GFPでタグ付けされる。この蛍光タンパク質は、中立的な細胞外液に蛍光を発する。また、MORは一度だけ、アゴニストによって活性化endocytoses、それ以外均等に原形質膜に分散されたままである。薄暗い蛍光で満たされている細胞内の共焦点モード結果にカバーガラスの上に座っている接着性の細胞質膜に着目。これは、原形質膜のみをセルの周囲の蛍光のリングとして見られているセルの中心に焦点を当てて異なっている。左の比較図2（a）の右のパネル。誤った角度で、従来の落射蛍光またはTIRFに切り替えると、 図2（b）に示すように、同じ細胞で明らかになるように、焦点蛍光か...

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

この手順の全体的な目標は、生細胞内の個々のクラスリンコーティングピットのダイナミクスを視覚化し、定量化することです。これは、最初に蛍光タグ付きエンドサイトーシスタンパク質およびカーゴタンパク質を接着細胞株にトランスセクトすることによって達成されます。次のステップは、全反射、蛍光、または芝生顕微鏡で細胞をイメージングすることです。クラスリンコーティングされたピットの小さなセットの寿命は、画像処理および分析プログラムを使用して手動で定量化されます。最後のステップは、客観的な自動検出と分析により、クラスリンコーティングされたピットの寿命を定量化することです。最終的に、芝顕微鏡法を使用して、個々のクラスリン被覆ピットのダイナミクスを単一イベント分解能で定量化し、クラスリンを介したGタンパク質共役受容体のエンドサイトーシスを調査します。この方法は、エンドサイトーシスのアセンブリとダイナミクスが、存在するさまざまなエンドサイトーシスタンパク質とカーゴタンパク質に基づいてどのように変化するかなど、メンブレン輸送分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。タグGタンパク質共役受容体またはGPCRおよび/またはClaro機械のコンポーネントをコードするプラスミドを使用して、HEC 2 93細胞をトランスフェクションすることを開始する。テキストプロトコールに詳述されているように、トランスフェクションの翌日に12ウェルプレートに、0.5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSとそれぞれに1ミリモルのEDTAを加えます。次に、3ラウンドの滅菌25ミリメートルカバーを6の別々のウェルにスリップします。ウェルプレート 各ウェルに2ミリリットルの培地を充填します。カバースリップをウェルの底までそっと押し下げて、カバースリップの下側で細胞が成長するのを防ぎます。次に、12ウェルプレートのウェルを手動で攪拌して、ウェルの底から細胞を持ち上げます。1ミリリットルのDM EMと10%FBSを追加して再送します。次に、1つのウェルから持ち上げたセルを3つのカバースリップに均等に分配します。イメージングする前に、カバースリップ上で細胞を少なくとも48時間増殖させます。また、クラスリンコーティングされたピットとカーゴダイナミクスのイメージングのために、細胞が広がって平らであることを確認してください。まず、テキストプロトコルに記載されているように、細胞を抗体で事前にインキュベートします。次に、一対の鉗子と先端で曲げられた25ゲージの針をフックに使用して、カバースリップをライブセルイメージングチャンバーに移す準備をします。利き手で一対の鉗子を持ちます。曲がった針をもう片方の針に保持します。フックがガラスに向かって下向きに曲がるまで針を回します。ニードルフック側を下にして、6ウェルプレートの底面をゆっくりと引きずり、カバースリップに引っ掛けます。カバースリップの表面を傷つけないように注意してください。カバーをそっと持ち上げ、ウェルの底からスリップアップします。カバースリップをウェルの壁にバランスを取ってサポートします。鉗子を使用してカバースリップの端近くをつかみ、カバースリップセル側をイメージングチャンバーまで移動します。チャンバーを組み立て、700マイクロリットルの予温イメージング培地を追加します。チャンバーを顕微鏡に移した後、芝生油浸対物レンズを使用して細胞に焦点を合わせ、従来のエピ、蛍光、または共焦点照明モードで細胞を画像化し、重要な安全対策として適切なコンストラクトを発現する細胞を特定します。レーザービームの角度に常に注意し、常にレーザービームを観察者から遠ざけてください。次に、細胞の周りの原形質膜の輪郭が消えて細胞の底面が現れるまで、発現細胞の底面に焦点を合わせます。これは、ミューオピオイド受容体などの原形質膜に局在するカーゴタンパク質で最も明白です。従来の落射蛍光でイメージングに同じレーザーを使用する場合は、焦点が合わなくなるまでレーザーの入射角を大きくします。細胞内部の蛍光は消え、細胞の周りの原形質膜の輪郭は見られません。芝mに入ったら、励起レーザーが対物レンズを通って反射し、対物レンズの上に見えないことを確認します。レーザースポットが見えているかどうかを確認することで、ピントを絞り込み、鮮明な画像を取得します。細胞が同定されたら、少なくとも3秒ごとに10分間画像を取得します。すべての手順を繰り返して、追加のセルを画像化します。エンドサイトーシスダイナミクスの解析を開始するには、画像J.Imagesでファイルを開き、TIFFファイルの1つのスタックとして保存します。インターリーフチャネル付き。ポップアップウィンドウで[画像ハイパースタック]を選択し、スタックからハイパースタックを選択して、画像をハイパースタックに変換します。集録したチャンネル数を入力します。Zack用に1つ入力し、ムービーフレーム数を入力します。ハイパースタック形式では、2 つのスクロールバーを持つウィンドウが表示されます。上部のバーを使用してチャネル内を移動し、下部のバーを使用して時間内を移動します。寿命がアッセイされるタンパク質のチャネルまでスクロールします。ムービーの最初のフレームを超えて移動し、既存のクラスリンコーティングされたピットや、全時間が表示されていないCCPのインクルードを減らします。ランダムに選択されたスポットの周囲に関心領域またはROIを描画します。スポットが表示されているフレーム数をカウントします。オブジェクト認識で分析を開始するには、デフォルトで出現した画像解析ソフトウェアで生の画像ファイルを開きます。カラー画像が表示されます。ディスプレイ調整ウィンドウを使用して、チャンネルの明るさを調整します。チャンネルの名前をクリックすると、表示される色を変更できます。チャンネルの横にあるチェックボックスをオフにして、チャンネルが表示されないようにします。オレンジ色の斑点のあるアイコンをクリックして、スポットを作成します。セルの周囲のROIを選択し、それを使用して、明るいリーディングエッジとプラークを誤って検出する領域を除外します。スポットの直径を測定して、アルゴリズムの初期推定値を提供します。スライスモードに切り替えて、スポットの極端をクリックしてその直径を測定します。これは、割譲前の形成後の安定性の高さでA CCPを示すように見える4つまたは5つの丸いスポットに対してこれを行い、これらの測定値を使用して、ミクロンの10分の1に最も近い平均直径を計算します。スポットを検出するには、サーパスモードに戻るには、検出する適切なチャネルを選択します。平均測定直径(通常は0.3ミクロンまたは0.4ミクロン)を入力します。青い前方矢印をクリックして、スポットを定量化します。フィルターを調整して品質でスポットをフィルタリングし、背景なしでできるだけ多くのスポットをキャプチャします。品質フィルターはデフォルトで選択されています。品質曲線をガイドとして使用して、適切なしきい値を設定します。フィルターの下限しきい値をマウスの左ボタンで、カーブの最初のくぼみに移動します。これは、フィルターの出発点として適しています。この位置は通常、検出を目に見えるスポットのみに絞り込むためです。編集スポット画面でアラントスポットを削除する モードを選択し、スポットをクリックします 黄色に変わったら、[削除]をクリックします。次に、青い矢印をクリックして、アルゴリズムの構築を続行します。トラックを動いているブラウニーに設定することで、トラックを測定します。CCPは指向性の動きを示さず、原形質膜を横切るドリフトを最小限に抑えるだけです。このアルゴリズムは、そのモーションに最も適しています。次に、最大距離を0.7ミクロンなどの小さな値に設定します。距離を短く設定すると、隣接するスポットの接続が最小限に抑えられ、CCPまたは細胞移動を通じて細胞スポットを継続的に追跡できます。次に、最大ギャップ サイズを 1 に設定します。これにより、フレームが 1 つだけ欠落している場合でも、トラックを続行できます。連続してギャップサイズが3を超えると、異なるトラックが誤ってリンクされます。次のステップは、トラックの表示をドラゴンテイルに切り替えることです。動画をスクロールして、検出品質を観察します。隣接するスポットが接続されている場合は、最大距離を0.7ミクロン未満に減らします。スポットがあまりにも簡単に分割されている場合は、最大ギャップサイズを増やします。青い矢印をクリックして、トラックを作成します。これにより、トラックをフィルタリングするためのフィルタートラック画面が表示されます。強度フィルターを使用して、追加の明るいプラークを除去します。次に、ディスプレイスメントフィルターを使用して、芝生フィールドに入るエンドソームを除去します。スポットが長いと変位も長くなるので注意してください。緑色の二重矢印をクリックして、プロトコルを完了します。データをエクスポートするには、[統計] タブに移動します。1枚のフロッピーディスクのアイコンをクリックして、選択した統計をエクスポートします。一連のフロッピーディスクのようなアイコンをクリックして、すべての統計をエクスポートします。A接着性原形質膜と共焦点モードに着目すると、薄暗い蛍光で満たされた細胞が明らかになります。対照的に、細胞の中心に焦点を合わせると、細胞膜が細胞の周りの蛍光の輪として現れます。焦点の合わない蛍光は、従来のエピ、蛍光、または誤った角度の芝に切り替えると明らかになります。芝の角度が正しい場合、原形質膜は非常に鮮明で、クリアで明るく、焦点が合っていません。蛍光によって画像が乱れることはありません。ベータアレスチンが細胞質プールにあるとき、芝生フィールドにはほとんどなく、ぼんやりと外側の焦点に見えます。MORがアゴニストであるベータによって活性化されると、アレスチンは原形質膜に動員され、ベータアレスチンと受容体の両方がCCPに再分配されます。これらのクラスターの寿命は手動で定量化されます。エンドサイトーシスの完了に関する3つのパラメータを使用すると、CCPを示すスポットが完全に点滅したり消えたり、より大きな構造をつまんだりすることができます。ここに示されているのは、MAを使用して検出されたCCPsをフィルタリングした後、非動的プラーク構造、オーバーレイされた白い球体、検出されたスポットを示し、全生涯にわたって検出できなかった薄暗いスポットも品質フィルターで除外されました。このビデオを見れば、芝生顕微鏡を使用して個々のカテーテルコード化されたピットを視覚化する方法を非常によく理解できるはずです。

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、高コントラスト分解能と時間分解能で細胞表面に近い構造を観察するための強力なアプローチです。我々は、全反射は、細胞壁で囲まれた細菌や真菌細胞の皮質でのタンパク質のダイナミクスを研究するために用いることができる方法を示しています。...

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。...

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

このビデオは、ガラス底皿の表面に付着したIgGオプソン化赤血球(RBC)のマクロファージ媒介性食作用におけるファゴソームの形成と閉鎖をリアルタイムで可視化するための高解像度の全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を示しています。マクロファージはRBCの周囲に偽足を伸ばし、ファゴソーム内に飲み込み、ガラス表面から分離します。...

TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

出典: Winkle, C. C., et al.軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。...

エキソサイトーシスイベントの可視化のための全反射蛍光顕微鏡

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

この論文は、シナプトブレビン2-pHluorinコンストラクトと全反射蛍光顕微鏡を使用して、神経芽細胞腫細胞における神経伝達物質小胞動態を調査する方法を提供します。また、画像処理とデータ分析のために開発された戦略についても報告されています。...

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きたマクロファージにおける前例のない高分解能のファゴソーム形成とクロージャを3次元で可視化するための実験設定について説明します。これにより、食細胞カップの基部、伸びる偽足、および食細胞の正確な部位を監視できます。...

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

学ぶTIRF顕微鏡を用いたクラスリン被覆ピットの動態解析法。Gタンパク質共役型受容体のエンドサイトーシスメカニズムを単一イベント解像度で可視化・定量化し、細胞シグナル伝達の理解に貢献します。

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

さらに動画を探す