Name: PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶマウスBリンパ球における染色体異常のPNA-FISHによる迅速分析方法。ゲノム不安定性を定量化し、DNA修復経路とがん発生メカニズムの理解に貢献する技術を習得できます。

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この作品は、NIHの助成金R00 CA160574（SFB）でと（SMM）はラトガースバイオテクノロジートレーニングプログラムの交わりによってサポートされています。

この手順は、ラトガース、ニュージャージー州の州立大学で動物実験委員会によって承認された。マウスは、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って処理した。科学者たちは、確立され、承認されたガイドラインについては、彼らの国や機関投資家、動物の組織に相談してください。 開始前に、 表1に列挙溶液を調製する。 1 B細胞の単離とアクティベーション頸椎脱臼に続いてCO 2を使用して、マウスを安楽死させる。体の左側がアップしているので、マウスを置き、毛皮が湿っているまで、70％エタノールでマウスをスプレー。 2mLの洗浄緩衝液で35mm組織培養皿に脾臓および場所を解剖。層流フードでは、静かに5ミリリットルの注射器の平らな先端を使って組織培養皿に脾臓を壊す。 <ol><li> 50に70μmのナイロンメッシュを挿入mlチューブとナイロンメッシュに2ミリリットルの洗浄緩衝液で脾臓サンプルを転送する。静かにシリンジの平らな端を使用してメッシュに脾臓を混乱させる。 </li><li> 70μmのナイロンメッシュを通して洗浄バッファーとフィルタ8mlで注射器の背面に35mmのプレートをすすぐ。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。 </li><li>吸引し、上清を廃棄し、ACK溶解バッファー3mlにペレットを再懸濁します。塊を破壊し、5分間インキュベートするようにピペット上下簡潔に。 4℃で10分間300×gでの洗浄緩衝液および遠心の10ミリリットルを追加します。 </li><li>吸引し、上清を廃棄し、洗浄緩衝液1ミリリットル中にピペット操作により、次にチューブの底をタップしてペレットを再懸濁すること。抗CD43 MACSマイクロビーズを50μlを加え、30分間氷上でインキュベートする。 4℃で10分間300×gで、洗浄緩衝液10ミリリットルを追加し、穏やかに混合し、遠心。 4℃で10分間300×gで、洗浄緩衝液10ミリリットルを追加し、穏やかに混合し、遠心。 </li><li>セットアップするMACS磁石に列を配置することによってミニMACSカラム。コラム下のラベル15ミリリットルコニカルチューブを配置します。カラムに洗浄緩衝液1ミリリットルを加え、15 mlチューブに通すことができます。 </li><li>洗浄バッファー1mlに再懸濁上清を吸引。洗浄バッファーが通過実行された後、列にサンプルをロードします。 </li><li>試料がカラムに流した後、カラムを洗浄する1ミリリットルの洗浄緩衝液を加える。 15mlチューブにおける収集されたサンプルを直接洗浄バッファー7mlのを追加します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を数える。 50ミリリットルチューブに/ウェル500万細胞のために必要な細胞の必要量を転送します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。 500およびIL4 1：LPS 1サプリメントB細胞培地1,000 </li><li>上清を吸引1,000,000細胞/ mlの最終濃度のために必要な補充したB細胞培地の適切なボリュームを追加する。 </li><li> humidifi 1,000,000細胞/ mlの場所で細胞を5 mlの6ウェルプレート中の細胞をプレート37°C、5％CO 2での細胞培養インキュベーターエド。 </li></ol> 2のB細胞固定<ol><li>ウエル（100 ngの/ mlの最終濃度のために）B細胞の5ミリリットルを含有し、37℃で1時間インキュベートするコルセミドを50μl加える。 37℃の水浴中でPrewarm 75mMのKCl溶液。ラベルされた15mlチューブにB細胞を移す。 4℃で10分間300×gでテープと遠心分離機を持つラベルをカバー。 </li><li>チューブ内の1ミリリットルを残して上清を吸引し、ピペッティングによりペレットを再懸濁。タッピングあるいはボルテックスに脈動しながら降下によって予め温め塩化カリウム降下の5ミリリットルを追加します。 </li><li> KClを10ミリリットルを加え、転倒混和する。 15分間37℃の水浴中でインキュベートする。反転させ、新鮮な固定液とミックスの5滴を追加します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。ピペッティングによりチューブ再懸濁ペレット中の1ミリリットルを残して上清を吸引。 </li><li> VORをタップまたは脈動しながら降下によって新鮮な固定降下の5ミリリットルを追加します。TEX。固定液をさらに10 mlを加え、室温で30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。ピペッティングによりチューブに再懸濁に1ミリリットルを残して上清を吸引。 4℃で10分間300×gで、新鮮な固定液と遠心の14ミリリットルを追加します。 </li><li>繰り返し手順2.7倍以上である。 </li><li>新鮮な固定液14ミリリットルを追加します。パラフィルムでキャップを密封し、-20℃で一晩保管してください。 </li></ol>中期染色体スプレッドの調製<ol><li> 22.9℃、52％の湿度に調整された環境室を設定します。 </li><li>遠心分離し、4℃で10分間300×gでB細胞を固定。吸引し固定液は、ピペッティングによりチューブに再懸濁に70μLを残す。 </li><li> 35°の角度で湿度室中の標識スライドを配置します。スライド上に再懸濁したB細胞の35μlのを削除し、サンプルあたり2スライドをドロップします。その後、スライドを保存するスライドは30分間湿度室で乾燥することができます37℃でスライドボックス中。 </li></ol> 4。テロメアのPNA FISH <ol><li>プローブの調製<ol><li> 37℃に予備温脱イオンホルムアミド。 7μlの脱イオン予め温めホルムアミドとテロメアPNAプローブ2μlのを混合し、1時間振とうしながら37℃でインキュベートする。 </li><li> 37℃に予備暖かいFISHマスターミックス。ステップ4.1.1からの混合物に7μlを予め温めFISHマスターミックスを追加し、1〜3時間、37℃でインキュベートする。 </li><li> 80℃で8分間のプローブ混合物を変性させる。 37°Cで1時間プローブをあらかじめアニールする。 </li></ol></li><li>染色体スライドの前処理<ol><li>水浴中で37℃に0.01 MのHClを50mlの入ったガラス製スライド染色ジャーを予め温める。 </li><li>室温で5分間、2×SSCを含む別のスライドガラス染色ジャー内の場所スライド。 </li><li>予め温めたスライドガラス染色ジャーにペプシン株式の2μLを加え転倒混和する。このガラスSLにスライドを移し、IDE-染色ジャー、37℃で90秒間インキュベートする。 </li><li>スライドが揺れ、室温で5分間ずつ1×PBSを含む別のガラススライド染色ジャー中で2倍洗う。そして揺れ、室温で1×PBS / MgCl 2を 5分間スライドを洗浄します。 </li><li>室温で10分間、新たに調製した1％ホルムアルデヒド/ 1×PBS / MgCl 2を含むガラススライド染色ジャーにスライドを移す。 </li><li>揺れ、室温で1×PBSを含む別のガラススライド染色ジャー中で5分間スライドを洗浄する。 </li><li> 70％、90％、および100％エタノールを含有する別個のスライドガラス染色ジャーを有することにより、エタノール脱水シリーズを調製する。 </li><li>その後、70％エタノール、90％エタノール、次いで100％エタノールから出発し、3分間、各ジャーにスライドを移す。終了したら、-20℃でのエタノールの瓶を置きます。 </li><li>ペーパータオルの上に過剰のエタノールをタップし、35°の角度でスライドを支えて空気の乾燥にスライドを許可します。乾燥したら、マダイヤモンドペンを使用して、スライドの背面にあるハイブリダイゼーションのために18×18ミリメートルの領域をRK。 </li></ol></li><li> FISH用のスライドの変性<ol><li> 24×60ミリメートルのカバースリップに120μlの70％脱イオン化ホルムアミド/ 2×SSCを適用します。カバーガラススライドをタッチします。 90秒間、ホットプレート上で80℃でスライドを変性さ。 </li><li>迅速かつ丁寧にカバースリップをオフにスライドさせ、90％エタノールに続いて3分間の氷冷70％エタノール、および3分間、100％エタノール各スライドに配置します。スライドを空気乾燥させます。 </li><li>タイトな蓋とウェットティッシュペーパーでプラスチックの箱を並べて湿潤チャンバーを準備します。論文は湿ってもよいが、水で飽和しないようにしてください。 </li><li>湿度の高い室では、18×18ミリメートルのカバースリップでカバーし、1時間、37℃でインキュベート、スライド上のマークされた領域へのステップ4.1.3からプレアニールプローブミックスを適用します。 </li></ol></li><li>ポストインキュベーションウォッシュ<ol><li>前の温かい50％ホルムアミド/ 2×SSC、1×SSC、および4×SSC / 0.1％Tween-20を45°における; Cの水浴。 </li><li>慎重にカバースリップを除去し、暗いし、振盪に予め温めておいた50％ホルムアミド/ 2×SSC 3xfor 5分で、それぞれのスライドを洗う。揺れ、予め温めた1×SSC 3xfor 5分ごとにスライドを洗浄します。最後に、予め温めておいた4×SSC中でスライドを洗浄/ 0.1％のTween-20 3xfor 5分の各。 </li><li>光保護されたガラススライド染色ジャー中DAPIでの3分間のスライドを染色する。 </li><li>揺れ、2×SSC中で5分間スライドを洗浄する。 24×60ミリメートルのカバースリップで覆い、モヴィオール封入剤35μlのを適用し、4℃でスライドを保存します。 </li></ol></li></ol>染色体の顕微鏡分析5。 <ol><li>標準落射蛍光顕微鏡を用いて中期スライドを分析します。最良の結果を得るために、そのようなメタシステムMetaferプラットフォームとして自動化されたステージとイメージングプラットフォームを使用してください。テロメアpから各中期スプレッドは、染色体を可視化するためにDAPI蛍光のために一つの画像を収集し、蛍光シグナルのための一つの画像ローブ。 （ 例えば 、Cy3標識他の蛍光体が利用可能であり、同様に良好に動作します。） </li><li>画像解析プログラムで画像をオーバーレイして分析する。 </li></ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害を有していない。

一方、活性化Bリンパ球は、他の細胞型も使用することができ、有糸分裂染色体スプレッドの調製に特に適している。 Tリンパ球は脾臓またはリンパ節から精製することができるように、B細胞の利点の多くを共有し、そして適切なマイトジェン8を含む培地中での増殖によって刺激された場合、高い有糸分裂指数を有する。胚性幹細胞（ES細胞）は、中期染色体分析9に適している。これらが入手できない場合コルセミド、より長い治療（ 例えば 、10ngの/ mlの最終濃度でのコルセミドで16時間）を固定する前中期でトラップする複数のセルを推奨しているが、線維芽細胞を用いることができる。 中期の調製の整合性が大幅にそのようなサーモCDS-5細胞遺伝乾燥チャンバーなどの制御された湿度チャンバ内に固定された染色体をドロップすることによって促進されるスプレッドが、それはWH良好な結果を得ることが可能であることを私たちは発見ラボ環境の湿度や温度に応じて、ベンチで働くILE。信頼性の高い結果を得るためには、サンプル当たり少なくとも100中期から染色体異常をスコアリング...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

癌は、正常な細胞増殖を調節する遺伝子に影響を与える変異の蓄積によって引き起こされる。突然変異は、DNAの損傷によって引き起こされるゲノムの構造および配列の変化の結果である。 DNA損傷は、電離放射線のような外因性の薬剤を含む、プロセスのさまざまなを通して発生し、副生成物などのヌクレオチド塩基または反応性酸素種1との接触によって生じた損傷の自発的脱アミノ化などの通常の細胞代謝のようにすることができる。 哺乳動物の細胞がDNA損傷を逆転またはブレーク·サイトで順序を復元することができ、修復活動の範囲を有するが、変異は、それにもかかわらず、細胞の生涯を通じて蓄積する。 DNA損傷は、さらに、老化および老化関連疾患2に関連付けられた幹細胞を、2つの方法の効力の喪失に寄与することができる。 DNA損傷の修復を理解することは、2の符号に対処する上で、したがって、中央に重要である公衆衛生におけるificant問題。増加する証拠は、哺乳動物のDNA修復経路は、それが一層急務分子レベルでの突然変異の抑制に関与するプロセスを理解すること、癌細胞ゲノム3,4の進化に寄与し得ることを示唆している。 染色体異常の直接可視化は、特定の細胞型においてゲノム不安定性の程度を決定するための強力かつ定量的な手段である。分裂中期の細胞からの凝縮染色体を単離し、光または蛍光顕微鏡を用いて検査することができる。このような細胞遺伝学的アプローチは、数十年間実際にされており、転座またはDNA修復活性の喪失に関連する染色体異常の特定のタイプの外観を示すために使用することができる。プロトコルは、いくつかの潜在的な機能拡張に適しています：染色体は、in situハイブリダイゼーションスペクトル核型分析のためのプローブ（SKY）または多色の蛍光で標識することができる（mFISH）が転座5,6を識別します。これらの技術はまた、染色体転座の頻度と、このプロトコルで可能なものを超えて、追加情報を提供して決定することが、複雑な染色体転座の構造を、有効にします。代替的に、配列特異的なプローブが生成され、選択されたゲノム部位7においてDNA切断の頻度を試験するために用いることができる。 このプロトコルでは、中期染色体の調製は、Bリンパ球から広がる記述する。テロメア反復のための蛍光標識されたペプチド核酸（PNA）プローブを効率的に分裂中期染色体テロメアマークが使用されるが、このプロトコルはいくつかの利点を有する広がる。 B細胞は、高品質のスプレッドは一貫して製造することができるように、高い分裂指数で成長するように誘導することができる。遺伝的に改変されたマウス由来のB細胞は、はるかに少ない寄与度の分析を混乱させる可能な二遺伝的変異を含む可能性が高いゲノムの完全性の特異的な遺伝子。 PNA-FISH法は、1日で完了し、染色体切断のより正確なスコアリングを可能にすることができます。特に、このプロトコルに記載されている特定の装置と組み合わせて、このアプローチを用いることにより、非常に一貫した、高品質のスプレッドを生成し、急速に速度およびゲノム不安定性のタイプを分析することが可能である。

<table><tbody><tr><td>50% デキストラン硫酸塩</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>脱イオンホルムアミド</td><td>アンビオン</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>ペプシン (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu;g)</td><td>シグマ</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA テロメア プローブ</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>コルセミド</td><td>ロシュ</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>シグマ</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) マイクロビーズ</td><td>ミルテニル バイオテック。</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 細胞遺伝学的乾燥チャンバー</td><td>サーモトロン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pna-fishによるマウスのbリンパ球における染色体異常の迅速分析

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

不良DNA修復は、腫瘍形成につながる変異の根本的な原因であるゲノム不安定性を増加につながる。異なる細胞型における染色体異常の頻度および種類の分析は、DNA修復経路に欠陥を解明することを可能にする。哺乳動物のDNA修復生物学を理解することは、大幅に特定の遺伝子におけるノックアウトとマウスの作製に助けられてきた。このプロトコルの目的は、マウスBリンパ球におけるゲノム不安定性を定量化することである。 PNA-FISHプローブ（ペプチド核酸-蛍光in situハイブリダイゼーション ）を使用してテロメアの標識は、中期染色体スプレッドのゲノム不安定性の迅速な分析を容易にします。彼らは、正常な倍数性及びより高い分裂指数を持っているので、B細胞は、線維芽細胞に対して特有の利点を有する。 B細胞の短期培養は、したがって、より少ない二次遺伝子突然変異を有する可能性がある一次細胞集団におけるゲノム不安定性の正確な測定を可能に一般的に変換された線維芽細胞または患者の細胞株に見られるものより秒。

一つの細胞から誘導された分裂中期染色体は、染色体40（マウス細胞を用いた場合）（ 図1A）を含む別個のクラスタを形成すべきである。各染色体は、水色の球として表示されている、一方の端部に動原体を持っています。正常な染色体では、2つのテロメア信号は、各セントロメアによって染色し、二つの信号の最後に見られる。間期核は同様に、スライド上に存在することになる。これらは、赤テロメア信号と青の球、、ない凝縮された染色体（例えば、 図1Bを参照のこと）として表示されます。間期核のゲノム不安定性を定量化する目的のために無視することができる。 染色体異常の異なる種類の数を観察することができる。染色分体ブレークは、各中期染色体を構成する2つの姉妹染色分のいずれかで休憩です。研究者は、一方の端Oから単一のテロメア信号の一染色分の不連続、または損失を見れば彼らは得点することができますFA染色体（ 図1（b）の例を参照）。染色体切断は、染色体（ 図1Cの例）の一端からテロメア...

DNA修復経路は、ゲノムの完全性の維持および変異および癌を予防するために必須である。このプロトコルの目的は、中期の染色体異常の直接観察によりゲノム不安定性を定量化することであるテロメアDNA反復のためのin situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光を使用して、マウスのB細胞から広がる。

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

次の実験の全体的な目標は、マウスBリンパ球のゲノム不安定性を定量化することです。これは、最初に初代細胞培養のためにB細胞を単離することによって達成されます。次に、細胞を固定し、中期スプレッドの調製を容易にする。最後に、蛍光標識されたテロメアを可視化するために、テロメアPNAフィッシュを行います。最終的には、さまざまな種類の染色体異常のレベルを蛍光顕微鏡で定量化できます。この手法は、標的マウスモデルでゲノムの安定性を促進する遺伝子の同定に役立つため、DNA修復経路の理解を広げることができます。この方法は、染色体の切断やその他の大きな染色体再配列に関する洞察を提供するだけでなく、転座などの他の形態のゲノム不安定性を測定するためにも適応させることができます。B細胞を単離するには、まず、分離したばかりの脾臓を、層流フード内の2ミリリットルの洗浄バッファーを含む35ミリメートルの組織培養皿に入れることから始めます。次に、5ミリリットルの注射器からプランジャーの後端を使用して、脾臓を穏やかに浸軟させます。次に、プランジャーを使用して70マイクロメートルのナイロンメッシュストレーナーで組織スラリーをろ過し、大きな組織片をストレーナーに優しく押し込みます。プレートとシリンジを8ミリリットルの洗浄バッファーですすぎ、ストレーナーで洗浄液をろ過します。次に、細胞をスピンダウンした後、CK溶解バッファーの3ミリリットルでペレットを数回上下にピペットで動かします。5分後、10ミリリットルの洗浄緩衝液で反応を停止します。次に、細胞を再度スピンダウンした後、チューブの底を軽くたたいてペレットを再懸濁し、細胞に1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。次に、50 μリットルの抗 CD 43 max マイクロビーズと細胞を氷上でインキュベートします。30分後、10ミリリットルの洗浄緩衝液で細胞を穏やかに洗浄します。遠心分離中は、磁石の上にミニマックスカラムを置き、カラムの下にラベル付きの15ミリリットルの円錐管を置きます。次に、1ミリリットルの洗浄バッファーをカラムに加え、EITをチューブに集めます。細胞ペレットを1ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、次に細胞をカラムにロードしますサンプルが通過した後、1ミリリットルの洗浄緩衝液でカラムをすすぎ、収集したサンプルに直接7ミリリットルの洗浄緩衝液を加えます。採取した細胞をカウントした後、50ミリリットルのチューブに移して遠心分離します。次いで、B細胞を活性化するために、補充されたB細胞培地中に1ミリリットルあたり6個の細胞のうち10個でペレットを再懸濁し、6ウェルプレート内の細胞をウェルあたり5ミリリットルの細胞でインキュベートし、摂氏37度および二酸化炭素5%の加湿細胞培養インキュベーターでB細胞を固定する。次に、各ウェルに50マイクロリットルのスミットを注入します。摂氏37度で1時間のインキュベーションを行った後、B細胞を標識された15ミリリットルチューブに移します。ラベルをテープで覆い、セルをスピンダウンします。次に、約1ミリリットルの上清を除くすべてを吸引し、ピペッティングでペレットを再懸濁します。摂氏37度、塩化カリウムの5ミリリットルを、渦で脈動しながら一滴ずつ加えます。次に、さらに10ミリリットルの塩化カリウムを加え、反転して細胞溶液を混合します。次に、細胞を摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。次に、反転させて、新しい固定剤の混合液を5滴加えます。次に、ペレットを1ミリリットルの上清に懸濁した後、細胞をスピンダウンし、5ミリリットルの新鮮な固定液を、渦上で脈動しながら一滴ずつ加え、細胞とさらに10ミリリットルの固定液を室温でインキュベートします。30分後、細胞をペレット化し、固定剤の1ミリリットルを除くすべてを取り除きます。次いで、細胞を洗浄した後、15ミリリットルの固定液でさらに2回、ペレットを上清の最後の70マイクロリットルに再懸濁する。次に、ラベル付きのスライドを35度の角度で、摂氏22.9度、湿度52%に設定された湿度チャンバーに置きます。再懸濁したB細胞の35マイクロリットルを各スライドに滴下し、サンプルごとに2枚のスライドを調製します。その後、スライドを湿度チャンバーで30分間乾燥させた後、完全に乾くまでスライドを摂氏37度のスライドボックスに保管します。乾いたら、ダイヤモンドペンを使用して、各スライドの背面に18 x 18ミリメートルのハイブリダイゼーション領域をマークし、魚のスライドを変性させます。次に、120マイクロリットルの70%脱イオン形態アミドを24ミリメートル×60ミリメートルのカバースリップに塗布し、次に各スライドをカバースリップに接触させます。80°Cのホットプレートでスライドを90秒間変性させた後、カバースリップから迅速かつ慎重にスライドさせて連続的にスライドさせます。スライドを氷冷した70%、90%、100%エタノールにそれぞれ3分間入れます スライドが乾燥した後、スライドを湿ったチャンバーに入れ、スライドのマークされた領域にプレニードプローブミックスを適用します。プローブミックスを18 x 18 mmのカバースリップで覆い、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、事前に警告された2つのXSSCでスライドを振って洗います。5分後、35マイクロリットルのモヤル埋込培地をスライドに塗布します。メディウムを24mm×60mmのカバースリップで覆い、スライドを摂氏4度で保管します。最後に、標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用して中期スライドを分析します。1つのマウス細胞に由来する中期染色体は、40本の染色体を含む目立たないクラスターを形成するはずです。各染色体の一方の端にはセントロメアがあり、2つのテロメア信号の近くにあり、染色体のもう一方の端にはさらに2つのテロメア信号があります。染色分体ブレークは、各中期染色体を構成する2つの姉妹染色分体のうちの1つのブレークです。場合によっては、染色体の切断された端は、同じ中期スプレッドにテロメアシグナルを持つフラグメントとして観察できます。ラジオ染色体は、2つの染色体が関与する複雑な再配列です。染色体はまた、結合されて二心染色体を形成することがあり、これは染色体と両端のセントロメアのエンドツーエンドの融合として現れます。ロバートソン転座は、2つの染色体のセントロメア間の転座の一種であり、1つのセントロメアに付着した4つの姉妹染色体アームとして現れます。この最後の画像では、テロメアシグナルが存在しない中期が示されています。テロメアシグナルの欠如は、プローブ調製のエラーや、ハイブリダイゼーション中のカバースリップの下の気泡から発生する可能性があります。この手順に続いて、細胞周期解析や結腸情報などの他の方法を実行して、ゲノムの不安定性の増加が細胞の生存率に影響を与えるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この記事では、シングルセルFISH、割球の核の拡散技法、およびin...

着床前遺伝子診断のためのFISH

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

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in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。...

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

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使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

現在のプロトコルは、全身照射への曝露後のマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常の同定における多重蛍光in situハイブリダイゼーション(mFISH)およびスペクトル核型分析(SKY)の有用性を説明しています。...

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

この尿細管スカッシュ手法の目的は、急速に細胞の完全性を維持しながらマウス精母細胞の開発の細胞機能を評価するためです。このメソッドにより、精子形成のすべての段階の調査のため、マウスの減数分裂の研究のため他の生化学的な分子の生物学的アプローチと一緒に簡単に実装することができます。...

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

核表面の拡散は、間見下がれの間に染色体の事象を研究するために不可欠なツールです。ゼブラフィッシュの精子から前相Iの間にマイオサイト染色体を調製し、可視化する方法を実証する。...

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ここで提示されるアッセイは、マウスペイヤーのパッチから胚中心B細胞を用いた免疫グロブリン重鎖遺伝子遺伝子軌跡内の体細胞過突然変異を定量化するアッセイである。...

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染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。...

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シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

学ぶマウスBリンパ球における染色体異常のPNA-FISHによる迅速分析方法。ゲノム不安定性を定量化し、DNA修復経路とがん発生メカニズムの理解に貢献する技術を習得できます。

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

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