PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析
2014年8月19日
DNA修復経路は、ゲノムの完全性の維持および変異および癌を予防するために必須である。このプロトコルの目的は、中期の染色体異常の直接観察によりゲノム不安定性を定量化することであるテロメアDNA反復のためのin situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光を使用して、マウスのB細胞から広がる。
次の実験の全体的な目標は、マウスBリンパ球のゲノム不安定性を定量化することです。これは、最初に初代細胞培養のためにB細胞を単離することによって達成されます。次に、細胞を固定し、中期スプレッドの調製を容易にする。
最後に、蛍光標識されたテロメアを可視化するために、テロメアPNAフィッシュを行います。最終的には、さまざまな種類の染色体異常のレベルを蛍光顕微鏡で定量化できます。この手法は、標的マウスモデルでゲノムの安定性を促進する遺伝子の同定に役立つため、DNA修復経路の理解を広げることができます。
この方法は、染色体の切断やその他の大きな染色体再配列に関する洞察を提供するだけでなく、転座などの他の形態のゲノム不安定性を測定するためにも適応させることができます。B細胞を単離するには、まず、分離したばかりの脾臓を、層流フード内の2ミリリットルの洗浄バッファーを含む35ミリメートルの組織培養皿に入れることから始めます。次に、5ミリリットルの注射器からプランジャーの後端を使用して、脾臓を穏やかに浸軟させます。
次に、プランジャーを使用して70マイクロメートルのナイロンメッシュストレーナーで組織スラリーをろ過し、大きな組織片をストレーナーに優しく押し込みます。プレートとシリンジを8ミリリットルの洗浄バッファーですすぎ、ストレーナーで洗浄液をろ過します。次に、細胞をスピンダウンした後、CK溶解バッファーの3ミリリットルでペレットを数回上下にピペットで動かします。
5分後、10ミリリットルの洗浄緩衝液で反応を停止します。次に、細胞を再度スピンダウンした後、チューブの底を軽くたたいてペレットを再懸濁し、細胞に1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。次に、50 μリットルの抗 CD 43 max マイクロビーズと細胞を氷上でインキュベートします。
30分後、10ミリリットルの洗浄緩衝液で細胞を穏やかに洗浄します。遠心分離中は、磁石の上にミニマックスカラムを置き、カラムの下にラベル付きの15ミリリットルの円錐管を置きます。次に、1ミリリットルの洗浄バッファーをカラムに加え、EITをチューブに集めます。
細胞ペレットを1ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、次に細胞をカラムにロードしますサンプルが通過した後、1ミリリットルの洗浄緩衝液でカラムをすすぎ、収集したサンプルに直接7ミリリットルの洗浄緩衝液を加えます。採取した細胞をカウントした後、50ミリリットルのチューブに移して遠心分離します。次いで、B細胞を活性化するために、補充されたB細胞培地中に1ミリリットルあたり6個の細胞のうち10個でペレットを再懸濁し、6ウェルプレート内の細胞をウェルあたり5ミリリットルの細胞でインキュベートし、摂氏37度および二酸化炭素5%の加湿細胞培養インキュベーターでB細胞を固定する。
次に、各ウェルに50マイクロリットルのスミットを注入します。摂氏37度で1時間のインキュベーションを行った後、B細胞を標識された15ミリリットルチューブに移します。ラベルをテープで覆い、セルをスピンダウンします。
次に、約1ミリリットルの上清を除くすべてを吸引し、ピペッティングでペレットを再懸濁します。摂氏37度、塩化カリウムの5ミリリットルを、渦で脈動しながら一滴ずつ加えます。次に、さらに10ミリリットルの塩化カリウムを加え、反転して細胞溶液を混合します。
次に、細胞を摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。次に、反転させて、新しい固定剤の混合液を5滴加えます。次に、ペレットを1ミリリットルの上清に懸濁した後、細胞をスピンダウンし、5ミリリットルの新鮮な固定液を、渦上で脈動しながら一滴ずつ加え、細胞とさらに10ミリリットルの固定液を室温でインキュベー
トします。30分後、細胞をペレット化し、固定剤の1ミリリットルを除くすべてを取り除きます。次いで、細胞を洗浄した後、15ミリリットルの固定液でさらに2回、ペレットを上清の最後の70マイクロリットルに再懸濁する。次に、ラベル付きのスライドを35度の角度で、摂氏22.9度、湿度52%に設定された湿度チャンバーに置きます。
再懸濁したB細胞の35マイクロリットルを各スライドに滴下し、サンプルごとに2枚のスライドを調製します。その後、スライドを湿度チャンバーで30分間乾燥させた後、完全に乾くまでスライドを摂氏37度のスライドボックスに保管します。乾いたら、ダイヤモンドペンを使用して、各スライドの背面に18 x 18ミリメートルのハイブリダイゼーション領域をマークし、魚のスライドを変性させます。
次に、120マイクロリットルの70%脱イオン形態アミドを24ミリメートル×60ミリメートルのカバースリップに塗布し、次に各スライドをカバースリップに接触させます。80°Cのホットプレートでスライドを90秒間変性させた後、カバースリップから迅速かつ慎重にスライドさせて連続的にスライドさせます。スライドを氷冷した70%、90%、100%エタノールにそれぞれ3分間入れます スライドが乾燥した後、スライドを湿ったチャンバーに入れ、スライドのマークされた領域にプレニードプローブミックスを適用します。
プローブミックスを18 x 18 mmのカバースリップで覆い、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、事前に警告された2つのXSSCでスライドを振って洗います。5分後、35マイクロリットルのモヤル埋込培地をスライドに塗布します。
メディウムを24mm×60mmのカバースリップで覆い、スライドを摂氏4度で保管します。最後に、標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用して中期スライドを分析します。1つのマウス細胞に由来する中期染色体は、40本の染色体を含む目立たないクラスターを形成するはずです。
各染色体の一方の端にはセントロメアがあり、2つのテロメア信号の近くにあり、染色体のもう一方の端にはさらに2つのテロメア信号があります。染色分体ブレークは、各中期染色体を構成する2つの姉妹染色分体のうちの1つのブレークです。場合によっては、染色体の切断された端は、同じ中期スプレッドにテロメアシグナルを持つフラグメントとして観察できます。
ラジオ染色体は、2つの染色体が関与する複雑な再配列です。染色体はまた、結合されて二心染色体を形成することがあり、これは染色体と両端のセントロメアのエンドツーエンドの融合として現れます。ロバートソン転座は、2つの染色体のセントロメア間の転座の一種であり、1つのセントロメアに付着した4つの姉妹染色体アームとして現れます。
この最後の画像では、テロメアシグナルが存在しない中期が示されています。テロメアシグナルの欠如は、プローブ調製のエラーや、ハイブリダイゼーション中のカバースリップの下の気泡から発生する可能性があります。この手順に続いて、細胞周期解析や結腸情報などの他の方法を実行して、ゲノムの不安定性の増加が細胞の生存率に影響を与えるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。
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概要
本プロトコルは、染色体異常を観察することにより、マウスBリンパ球におけるゲノム不安定性を定量化することを目的としています。この手法では、B細胞の単離、中期メタフェース標本の作製を行い、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いてテロメアDNAリピートを可視化します。
研究の主要構成要素
科学分野
- ゲノミクス
- 細胞生物学
- DNA修復機構
背景
- DNA修復経路は、ゲノムの完全性を維持するために不可欠です。
- 染色体異常は、変異や癌へとつながる可能性があります。
- これらの経路を理解することで、ゲノム安定性を促進する遺伝子の特定に役立ちます。
- 本研究では、マウスモデルを用いてこれらのメカニズムを探索します。
研究目的
- マウスBリンパ球におけるゲノム不安定性を定量化する。
- 染色体異常を観察し、解析する。
- DNA修復経路への理解を深める。
使用された方法
- 一次細胞培養のためのB細胞の単離。
- メタフェーズスプレッド作製のための細胞固定。
- テロメア可視化のための蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）。
- 蛍光顕微鏡を用いた染色体異常の定量化。
主な結果
- 蛍光標識されたテロメアの可視化に成功すること。
- さまざまな種類の染色体異常の定量化。
- ゲノム安定性におけるDNA修復経路の役割に関する知見。
- ゲノムの完全性維持に関与する遺伝子を同定できる可能性。
結論
- このプロトコルは、Bリンパ球におけるゲノム不安定性を効果的に定量化します。
- 得られた知見は、がんのメカニズムの解明に寄与する可能性があります。
- この手法は、ゲノム安定性に関する他の研究にも適用可能です。
よくある質問
業界における重要性
PNA-FISHを用いて初代マウスBリンパ球におけるゲノム不安定性を定量化することで、初期の探索段階においてDNA修復メカニズムを精密に解析することが可能になります。この手法は、染色体異常を直接可視化することで、メカニズムのリスク低減およびターゲットの検証を支援し、DNA修復パスウェイの調節に関するポートフォリオ上の意思決定に寄与します。本手法による迅速かつ定量的なアウトプットは、遺伝的モデルの検証から前臨床研究へのトランスレーショナルな連続性を促進します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 染色体異常を直接可視化することで、DNA修復遺伝子ノックアウトの機能評価が可能になります。
- ゲノム不安定性の定量分析により、ターゲット検証のためのメカニズム的なリスク低減が裏付けられます。
- 一次Bリンパ球を使用することで、二次的な変異による混同を減らし、予測の信頼性を向上させます。
- 観察された染色体の結果に基づいた、DNA修復ターゲットの選別（トリアージ）を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- PNA-FISH法によるラベル化により、テロメア関連異常の検出が標準化され、再現性のある読み取りが可能になります。
- 初代細胞を用いた中期分裂像の作製により、ゲノム不安定性に関するスケーラブルなアッセイ開発が可能になります。
- 定量的顕微鏡解析の出力により、異なる遺伝的背景間での信頼性の高い比較が容易になります。
- Bリンパ球の高い有糸分裂指数と正常な倍数性により、アッセイの準備効率が向上します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患に関連するDNA修復経路との整合性は、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を支援します。
- 遺伝子モデルの検証から、ゲノム安定性介入の前臨床評価までの連続性を確保します。
- 定量的なアウトプットにより、リスク調整に基づいたDNA修復モジュレーターの進展を導きます。
- 前臨床モデルにおけるゲノム不安定性と腫瘍形成リスクの間のメカニズム的な関連性を裏付けます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、DNA修復ターゲットに対する初期段階の探索からリード化合物の同定、および前臨床的な検証までを統合したものです。
- 探索生物学：染色体リードアウトによる直接的な評価を通じて、DNA修復遺伝子の機能に関する仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：さまざまなモデルにおけるゲノム不安定性について、標準化された定量的なアッセイ出力を提供します。
- 分析：比較分析のための測定可能なエンドポイント（染色体断裂、融合、転座）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：染色体異常を疾患メカニズムに関連付けることで、バイオマーカーの整合性を促進します。
- 企業における再利用：他の主要細胞種や遺伝的背景にも適応可能であり、幅広い研究開発（R&D）に活用できます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：DNA修復ターゲットの検証およびメカニズムのデリスキングにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値：再現可能でスケーラブルなワークフローにより、ゲノム不安定性の定量化を標準化する。
- 戦略的価値：DNA修復経路の調節に関するゴー/ノーゴー（継続・中止）の決定に情報を与え、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：DNA修復ターゲットおよび前臨床候補物質のリスク調整済み優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 一次細胞の分離、中期分裂相（メタフェーズ）のスプレッド調製、および蛍光顕微鏡観察に関する専門知識が必要です。
- PNA-FISHプローブ、高品質なイメージングシステム、および解析インフラへのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するためには、中期分裂相の調製とプローブハイブリダイゼーションの標準化が極めて重要です。
- 他の細胞型に適用する場合、有糸分裂指数および倍数性に応じてプロトコルの最適化が必要になる場合があります。
- 技術的な制限として、プローブ調製時のエラーや、シグナル検出に影響を及ぼすハイブリダイゼーションアーティファクトが考えられます。
