PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

次の実験の全体的な目標は、マウスBリンパ球のゲノム不安定性を定量化することです。これは、最初に初代細胞培養のためにB細胞を単離することによって達成されます。次に、細胞を固定し、中期スプレッドの調製を容易にする。

最後に、蛍光標識されたテロメアを可視化するために、テロメアPNAフィッシュを行います。最終的には、さまざまな種類の染色体異常のレベルを蛍光顕微鏡で定量化できます。この手法は、標的マウスモデルでゲノムの安定性を促進する遺伝子の同定に役立つため、DNA修復経路の理解を広げることができます。

この方法は、染色体の切断やその他の大きな染色体再配列に関する洞察を提供するだけでなく、転座などの他の形態のゲノム不安定性を測定するためにも適応させることができます。B細胞を単離するには、まず、分離したばかりの脾臓を、層流フード内の2ミリリットルの洗浄バッファーを含む35ミリメートルの組織培養皿に入れることから始めます。次に、5ミリリットルの注射器からプランジャーの後端を使用して、脾臓を穏やかに浸軟させます。

次に、プランジャーを使用して70マイクロメートルのナイロンメッシュストレーナーで組織スラリーをろ過し、大きな組織片をストレーナーに優しく押し込みます。プレートとシリンジを8ミリリットルの洗浄バッファーですすぎ、ストレーナーで洗浄液をろ過します。次に、細胞をスピンダウンした後、CK溶解バッファーの3ミリリットルでペレットを数回上下にピペットで動かします。

5分後、10ミリリットルの洗浄緩衝液で反応を停止します。次に、細胞を再度スピンダウンした後、チューブの底を軽くたたいてペレットを再懸濁し、細胞に1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。次に、50 μリットルの抗 CD 43 max マイクロビーズと細胞を氷上でインキュベートします。

30分後、10ミリリットルの洗浄緩衝液で細胞を穏やかに洗浄します。遠心分離中は、磁石の上にミニマックスカラムを置き、カラムの下にラベル付きの15ミリリットルの円錐管を置きます。次に、1ミリリットルの洗浄バッファーをカラムに加え、EITをチューブに集めます。

細胞ペレットを1ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、次に細胞をカラムにロードしますサンプルが通過した後、1ミリリットルの洗浄緩衝液でカラムをすすぎ、収集したサンプルに直接7ミリリットルの洗浄緩衝液を加えます。採取した細胞をカウントした後、50ミリリットルのチューブに移して遠心分離します。次いで、B細胞を活性化するために、補充されたB細胞培地中に1ミリリットルあたり6個の細胞のうち10個でペレットを再懸濁し、6ウェルプレート内の細胞をウェルあたり5ミリリットルの細胞でインキュベートし、摂氏37度および二酸化炭素5%の加湿細胞培養インキュベーターでB細胞を固定する。

次に、各ウェルに50マイクロリットルのスミットを注入します。摂氏37度で1時間のインキュベーションを行った後、B細胞を標識された15ミリリットルチューブに移します。ラベルをテープで覆い、セルをスピンダウンします。

次に、約1ミリリットルの上清を除くすべてを吸引し、ピペッティングでペレットを再懸濁します。摂氏37度、塩化カリウムの5ミリリットルを、渦で脈動しながら一滴ずつ加えます。次に、さらに10ミリリットルの塩化カリウムを加え、反転して細胞溶液を混合します。

次に、細胞を摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。次に、反転させて、新しい固定剤の混合液を5滴加えます。次に、ペレットを1ミリリットルの上清に懸濁した後、細胞をスピンダウンし、5ミリリットルの新鮮な固定液を、渦上で脈動しながら一滴ずつ加え、細胞とさらに10ミリリットルの固定液を室温でインキュベー

30分後、細胞をペレット化し、固定剤の1ミリリットルを除くすべてを取り除きます。次いで、細胞を洗浄した後、15ミリリットルの固定液でさらに2回、ペレットを上清の最後の70マイクロリットルに再懸濁する。次に、ラベル付きのスライドを35度の角度で、摂氏22.9度、湿度52%に設定された湿度チャンバーに置きます。

再懸濁したB細胞の35マイクロリットルを各スライドに滴下し、サンプルごとに2枚のスライドを調製します。その後、スライドを湿度チャンバーで30分間乾燥させた後、完全に乾くまでスライドを摂氏37度のスライドボックスに保管します。乾いたら、ダイヤモンドペンを使用して、各スライドの背面に18 x 18ミリメートルのハイブリダイゼーション領域をマークし、魚のスライドを変性させます。

次に、120マイクロリットルの70%脱イオン形態アミドを24ミリメートル×60ミリメートルのカバースリップに塗布し、次に各スライドをカバースリップに接触させます。80°Cのホットプレートでスライドを90秒間変性させた後、カバースリップから迅速かつ慎重にスライドさせて連続的にスライドさせます。スライドを氷冷した70%、90%、100%エタノールにそれぞれ3分間入れます スライドが乾燥した後、スライドを湿ったチャンバーに入れ、スライドのマークされた領域にプレニードプローブミックスを適用します。

プローブミックスを18 x 18 mmのカバースリップで覆い、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、事前に警告された2つのXSSCでスライドを振って洗います。5分後、35マイクロリットルのモヤル埋込培地をスライドに塗布します。

メディウムを24mm×60mmのカバースリップで覆い、スライドを摂氏4度で保管します。最後に、標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用して中期スライドを分析します。1つのマウス細胞に由来する中期染色体は、40本の染色体を含む目立たないクラスターを形成するはずです。

各染色体の一方の端にはセントロメアがあり、2つのテロメア信号の近くにあり、染色体のもう一方の端にはさらに2つのテロメア信号があります。染色分体ブレークは、各中期染色体を構成する2つの姉妹染色分体のうちの1つのブレークです。場合によっては、染色体の切断された端は、同じ中期スプレッドにテロメアシグナルを持つフラグメントとして観察できます。

ラジオ染色体は、2つの染色体が関与する複雑な再配列です。染色体はまた、結合されて二心染色体を形成することがあり、これは染色体と両端のセントロメアのエンドツーエンドの融合として現れます。ロバートソン転座は、2つの染色体のセントロメア間の転座の一種であり、1つのセントロメアに付着した4つの姉妹染色体アームとして現れます。

この最後の画像では、テロメアシグナルが存在しない中期が示されています。テロメアシグナルの欠如は、プローブ調製のエラーや、ハイブリダイゼーション中のカバースリップの下の気泡から発生する可能性があります。この手順に続いて、細胞周期解析や結腸情報などの他の方法を実行して、ゲノムの不安定性の増加が細胞の生存率に影響を与えるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。