Name: 下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶ膀胱平滑筋収縮ストリップ法による下部尿路薬理学評価。ラット膀胱を解剖し平滑筋と神経を含む組織片を作製し、力トランスデューサーで収縮性を測定する。薬理学的・電気的刺激の効果を定量化し、膀胱機能と創薬スクリーニングの理解に貢献する。

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この研究は、LBにNIH R37 DK54824およびR01 DK57284助成金によってサポートされていました

ここで説明するすべての手順は、ピッツバーグ大学のIACUC委員会により承認されています。 1。ソリューション<ol><li>レシピに従ってKrebs溶液を調製します。 mM単位組成：NaClの118、塩化カリウム4.7、 塩化カルシウム1.9、 硫酸マグネシウム1.2、 炭酸水素ナトリウム24.9、KH 2 PO 4 1.2、ブドウ糖11.7。 </li><li> 95％O 2、5％CO 2で曝気クレブスを、実験全体にわたって使用される37ºC水浴中に置き。脇に置く〜室温で曝気クレブス溶液200mlを組織切開に使用する。 </li><li>曝気クレブスのpH（〜7.4）と、浸透圧（〜300 mOsmで）を測定します。 </li></ol> 2。実験セットアップ（回路図図1A） <ol><li> （95％O 2、5％CO 2）を10mlのクレブスとチャンバー曝気埋める。 </li><li> 37℃にチャンバを加熱する循環水ポンプを始動;アンプ（S）、刺激剤（：必要な機器の電源を入れるs）とレコーディングソフトウェア。 </li><li> 1グラムの重量を有する変換器を校正します。 </li></ol> 3組織（図1B） ：以下の手順に従って、大人のナイーブな女性のSprague Dawleyラット（〜10〜12週齢200〜250グラム）から膀胱を削除する<ol><li>解剖エリアと必要な器具の準備：電気カミソリ、歯鉗子、メスの刃、解剖ハサミ、microscissorsを、2解剖鉗子は、組織·クリップ（または絹縫合糸）、クレブスとしたシルガードコーティングされた解剖皿（著者は、デュモン鉗子＃3を好む）組織切開端子です。 </li><li>誘導チャンバー内のイソフルラン吸入（O 2中4％）で動物を麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。継続的に反射を撤回呼吸数、外部刺激に応答して、リア四肢の喪失を観察することによって、麻酔のレベルを監視します。 </li><li>動物は、ひげをそる下腹部A麻酔をされた場合レア。腹部正中切開により骨盤臓器を公開します。膀胱と尿道を特定します。近位尿道の近くに膀胱頸部で切断することにより、膀胱を削除します。曝気クレブス溶液で満たされたシルガードコーティングされた皿に、すぐに組織を置きます。 </li><li>必要であれば、この時点で追加の組織を除去する：尿道、胃腸（GI）管および/ ​​または前立腺の断片など </li><li> IACUC承認された方法（ 例えば 、麻酔薬の過剰投与または二次の方法に続いてCO 2窒息）を用いて動物を生け贄に捧げる。 </li><li>さらに解剖のための組織を安定させるために、膀胱ドーム、首、尿管を通って組織切開のピンを挿入します。組織を伸ばさない。存在する場合、脂肪、結合組織、近位尿道および尿管を取り外します。 </li><li>平坦なシートを作成するためにドームにベースから膀胱を開き、漿膜側を下/腔側アップ（ 図1B）。組織の各コーナーに解剖のピンを配置します。膀胱D​​OMを削除するeと首組織。 </li><li>実験の目的は粘膜（尿路上皮と固有層-ダイアグラム図1Cを参照）の寄与を決定することである場合には、平滑筋収縮をして、添付粘膜ずに排尿筋ストリップの特性を比較。このために、帯状に組織を切断する前に、慎重にアイリスを用いて粘膜層を除去し、ハサミ、解剖顕微鏡下で、微細鉗子を春。実験の最後に、粘膜の完全な除去を確認するために、H＆E染色のためにストリップを固定します。この手順は、ラットの膀胱に比べて、マウスの膀胱内に簡単であることに注意してください。 </li><li> 〜2×8ミリメートル（ 図1B）の短冊状にドームにベースから縦に組織を切断する。接続するか、各ストリップの両端に、組織のクリップを取り付けます。 注：ワンラットの膀胱は、通常は4ストリップに切断することができますが、ストリップの数は、動物/膀胱サイズに応じて増減することができます。 </li><li> EXPERにストリップを転送imental室。固定されたガラス/金属棒に組織収縮を測定する力変換器に各ストリップの一端を取り付け、その他。 注：組織チャンバーのサイズは（20ミリリットル以上0.2 ml）を変化させる。げっ歯類ブラダーのための典型的なチャンバーは完全に溶液中に浸漬するストリップのために十分な高さを提供する5〜20ミリリットルである。一部のチャンバーは、内蔵の刺激電極と他人をしない来る。ケアは、特に電場刺激が信頼できない、電極のすべての接続が良好な状態であることを保証するために注意すべきである。 </li><li>ベースライン張力が1g（〜を10mN）に達するまで穏やかに組織を延伸することによって、各ストリップに力が規定量を適用する。当初は組織は、ベースラインの張力の減少として記録されているリラックスする傾向がある。ウォッシュ暖かい曝気クレブスを用いて組織ごとに約15分であり、各洗浄後に1グラムのベースライン張力を調整すること。 （ベースラインテンションが安定している組織は〜のために1〜2時間まで、または平衡化することを許可するすなわち 、それ以上の組織弛緩）。 </li><li>直接〜5分間浴、またはプラトー応答が到達するまでのKCl（80ミリモル）を添加することにより、試験組織の生存率。 KClを高濃度に応答も実験中または実験の最後に反復し（データ解析部の下に正規化を参照）、他の薬物またはストリップ間の応答を正規化するために使用することができる。 </li><li>組織が前処理条件に戻れるようにする温かい曝気クレブスで洗う組織を複数回（3-5x）。 </li></ol> 4。刺激プロトコル<ol><li>自発的な筋原性活動や平滑筋緊張に対する病理学の影響を調査するために、平滑筋などのSCI、BOOなどの異なる動物モデルからのストリップ、または新生児を使用します。 図2に、開発中に膀胱の自発活動の変化を調査するためにこの方法を使用することを示し、 SCI後。さらに、薬理学的薬剤は、種を調節するために使用され得るontaneous活動。 図3に、自発的な活動と平滑筋の緊 ​​張に、KCNQチャネル調節、フルピルチンとXE991の効果を示す。 </li><li>定義された時間間隔で浴に直接濃縮ストック溶液から化合物を添加することにより薬理平滑筋刺激コンストラクト濃度応答曲線である。車両や時間の影響を考慮するために平行なストリップに薬物および車両を使用してください。 <ol><li> 1000倍の最終使用濃度において所望の試験化合物のストック溶液を作る。 10 -5 M、3×10 -5 M、10 -4 M、3×10 -4 M、10 -3 M、3×10 -3 M：カルバコール（CCH）、ムスカリン性受容体作動薬は、以下のストックを調製、10 -2 M.浴中の最終濃度は10 -5 M（ 図4C、D）を10 -8 Mである。 10 -8 M、10 -7：ニューロメジンB（NMB）、ボンベシン受容体サブタイプ1アゴニストは、以下の株式を準備M、10 -6 M、10 -5 M、10 -4 M、10 -3 Mと浴中の最終濃度である10 -11 M〜10 -6 MのCChとNMB両方は、組織の収縮性を増加することが予想される。 </li><li> 10ミリリットル組織槽の場合は、できるだけ早く応答がプラトー（ 図4C、D）に到達するように、各制御CHのストック溶液10μlを加える。平行なストリップでは車両の等量（水）を追加します。同様に、各ニューロメジンBストック溶液10μl毎〜5分を追加します。 注： 図4の異なる種からのストリップにおける平滑筋緊張に対するNMBとのCChの興奮効果を観察します。 </li><li>興奮剤は、通常のCChまたはKClで予め収縮組織中の平滑筋の弛緩特性を調査します。 </li><li>アゴニスト応答をブロックするには、事前のアゴニスト刺激に対する組織の浸透を、可能にするためにアンタゴニストで10〜20分間、組織を前処理。 </li></ol></li><li>神経stimのためにまた、電場刺激（EFS）と呼ばれる平滑筋のulationは、3.13〜ステップ1に従い、以下に説明するように継続する。 EFSを選択的に平滑筋に対する神経を活性化することを意図している。刺激のパラメータは、慎重に直接平滑筋の刺激を避けるように選択すべきである。 <ol><li>刺激パラメータを確立します。刺激のタイプ（単一パルスまたは電車）、持続時間（パルス持続時間と列持続時間）、頻度と強度は、以下の手順で説明し、 図5A、Bに示すように。 <ol><li>単一パルス刺激は、パルス持続時間、刺激間間隔および所望の刺激の数を設定する。通常の刺激持続時間パラメータは、所望の間隔（ 図5A）で供給0.05〜0.3ミリ秒の持続時間の単一のパルスである。刺激強度に対するステップ4.3.1.4に従ってください。 </li><li>列車の刺激のために、列持続時間およびインタートレイン間隔を設定します。膀胱組織の典型的な値は3〜10秒には、少なくとも1メートルを配信されます離れにある（ 図5B）。組織疲労が（ つまり、EFS収縮が制御期間中に減少）が発生した場合は、インタートレイン間隔を増やします。 </li><li>電車の中で列車の刺激の周波数（パルスの数を確立 - 図5B）。 0.5〜50 Hzの範囲の周波数応答曲線を実行します。膀胱のための典型的な周波数は、ATPとのAChによって仲介再現性のある安定した収縮を与える10-20 Hzである。この方法は、コリン作動性神経伝達にプリンのメカニズムの寄与を評価するために使用できる方法を示す図5のマウスの膀胱ストリップにおけるEFS刺激に対する周波数依存応答を観察します。 </li><li>刺激の強度を確立する：（使用して列車は周波数を一定に保つ場合）収縮の振幅がプラトーに達するまで体系的に刺激の強度（電圧）を増大させる。 </li><li>に応じて刺激の強さを設定実験の目的。目的は、神経誘発収縮を増加させることである場合には、収縮の振幅が最大収縮の約50％であるような準最大強度を使用する。目的は、神経誘発収縮を減少させることである場合は、組織の疲労を回避するために、最大振幅の〜80％に強度を設定する。 </li></ol></li><li>刺激パラメータ（期間、頻度と強度）が確立されると、EFS-のため20〜30分は、薬物検査の前に安定させるために収縮を誘発〜許す。 注：Na +チャネル遮断薬で、神経伝達を遮断、神経伝達のためにEFSの選択性を確認するには、テトロドトキシン（TTX; 0.5〜1μM）。 TTXは、比較的簡単に洗い流すように、実験開始時にこの手順を実行します。また、（ステップ4.3.5を参照してください。下の）実験の最後に、これを実行します。 </li><li>のために1,000倍の最終作業濃度でストック溶液を準備します。アルファ、ベータメチレンATP（ABMA;プリン受容体活性化剤と減感）10 -2 M、アトロピン（ムスカリン受容体拮抗薬）10 -3 M（ 図5C）。図6の他の例を観察する。5HT4受容体アゴニスト、シサプリド（3×10 -6 M、10 -6 Mを、3×10 -5 M、10 -5 M、3×10 -4 Mを、10 -4 M、 3×10 -3 M、10 -3 M）は、組織の収縮およびSB-203186（3×10 -3 M）、5HT4受容体拮抗薬が増加しシサプリドの効果を逆転させる。 </li><li> EFS（ 図5C）にABMAおよびアトロピンの効果を試験するために、2つの制御周波数応答曲線を実行する。 10μMの最終濃度浴に10 -2 M ABMA10μlのを追加します。これは、平滑筋におけるプリン受容体の直接刺激に組織を収縮する。ベースラインへの応答が戻った後、周波数応答曲線を繰り返す。最後のconcentrat 10 -3 Mのアトロピン10μlのを追加1μMのイオン。 （ムスカリン受容体を遮断するアトロピンのために必要）〜10分後、周波数応答曲線を繰り返す。平行なストリップでは、各ステップにおいて、車両、水10μlを加える。 注： 図6の他の例については、定義された時間間隔で、各シサプリドストック溶液10μlを加える（〜15分毎に、説明を参照）、お風呂に直接SB-203186のストック溶液10μlが続き、に対するそれらの効果を監視するEFS誘発収縮。平行なストリップでは車両のDMSO 10μlを加える。シサプリドの効果を観察し、 図6のヒト膀胱と回腸組織におけるEFS誘発収縮に対する5HT4受容体作動薬は、。さらに、ヒト膀胱および回腸組織におけるEFS誘発収縮に対するDMSOの影響、シサプリドのための車両を観察。 </li><li> EFSプロトコルの終わりに、Na +チャネル遮断薬、テトロドトキシン（TTXで神経伝達を遮断することにより、EFSの選択性を検証する。0.5-1＆＃181; M）。 TTX抵抗性の収縮がまだ存在している場合は、その後の実験では、刺激の持続時間と強度を調整することをお勧めします。 </li></ol></li><li>前または後シナプス部位（ 図7A）に対する薬物の効果を測定するために4.3.2ステップ1に従ってください。カルバコールとEFSに再現性のある反応を確立し、その後、薬物Xを追加</li><li>実験の最後に、クリップを取り除くまたはストリップをほどく、余分な液を除去し、天秤を使用して各ストリップの重量を測定するためにティッシュ紙の上にそっとブロット。また、断面積を決定するために、キャリパーを用いて組織の長さを測定する。この情報は、データの正規化のために使用されます（セクション5.4を参照）。 </li></ol> 5。データ解析適切なソフトウェア（ 例えば 、Windaq、LabChartの）を使用してデータを分析します。 <ol><li>自発的活動のために、薬剤誘発性応答のピークの前とで少なくとも30秒のウィンドウを選択してくれASURE振幅と筋原性活動の頻度（ 図3）。 <ol><li>膀胱の異なる部分の間に相違がある応答の収縮性かどうかに寄与する周波数のスペクトルを決定するために、高速フーリエ変換解析を使用して（ 例えば 、首対ドーム）または開発、病理学、および薬8である。 </li></ol></li><li>平滑筋の緊張への影響については前と薬剤誘発性応答のピークで少なくとも10〜30秒のウィンドウを選択し、収縮の振幅を測定。 </li><li>神経誘発収縮に対する効果について（少なくとも3）の前に、薬剤誘発性応答のピーク時に収縮の曲線下振幅、持続時間と面積を測定します。 NOTE：プリン作動性およびコリン作動性の成分が異なる速度を持っているので、EFS誘導性収縮の振幅曲線下面積の両方を測定する必要がある。プリンコンポーネントは迅速かつ一過性である（ATPはpurinergiを活性化させるカルシウムの迅速な流入を可能にするようなP2X1などのCイオンチャネル型チャンネルは、それらは、このように曲線下面積に対するピーク振幅応答に対してより少ない貢献、）脱感作。コリン作動性成分（アセチルコリンが最終的に収縮を誘導するために、平滑筋を脱分極イオンチャネルを活性化する細胞内経路を活性化するために多くの時間を必要とする代謝型ムスカリン受容体を活性化する）遅く、持続的である。このように、ムスカリン性成分は曲線下面積を測定することによって、より良いキャプチャされます。 </li><li>ストリップ及び薬理学的治療を横切っ結果を比較することができるようにデータを正規化する。正規化のために選択されたパラメータは、病理学的状態を研究や実験計画、試験化合物によって影響されるべきではありません。これらのパラメータのうち、利用ストリップの重量、断面積、塩化カリウム応答（ 図4B）、最大応答（ 図7B）の％または別の収縮剤に対する最大応答の％（ 例えば 、のCCh）やリラックス剤（ 例えば 、パパベリン）。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

本論文では、膀胱生理学および病理学に関連する重要な科学的問題の数だけでなく、膀胱機能不全を治療する新薬の発見を助けるに対処するために使用することができ、簡単なin vitroでの平滑筋収縮方法を説明した。私たちは、膀胱平滑筋の収縮（ 図2-4）、神経伝達変調（ 図5-7A）、種差（ 図4）、臓器差（ 図6）、発達病理学的および薬理学的特性を評価するためのこの方法の使用を例示している特定の膀胱のコンポーネントの関連性（ 例えば 、粘膜、 図7B）。ここでは図示していない付加的なアプリケーションには、薬理学的物質3,10,11、各種薬物22-24、または評価/送信機RELEの定量化の構造活性相関を用いた細胞内経路の評価を含める神経刺激25の後アーゼ。 膀胱機能が最終的にインビボで評価することができるが...

膀胱平滑筋は、尿貯蔵及び契約は、尿排泄を誘発することができるように緩和する。リラクゼーションには、固有の平滑筋の特性によっておよび排尿筋におけるβアドレナリン受容体（ヒトにおけるβ3 AR）を活性化する交感神経からのノルエピネフリンの持続放出（NE）によって媒介される。排尿は、交感神経入力を抑制し、膀胱平滑筋1を収縮させるアセチルコリン/ ATPを放出する副交感神経を活性化することによって達成される。脳および/ ​​または脊髄損傷、神経変性疾患、糖尿病、膀胱出口閉塞または間質性膀胱炎を含む多くの病理学的状態は 、重度の生命2の患者の質に深刻な影響を与え、膀胱機能を変化させることができる。平滑筋、求心性または遠心性神経および/またはこれらの条件は、膀胱の1つ以上の構成要素に影響を与えることにより、平滑筋の収縮性を変化させる粘膜。 膀胱機能を研究するin vivoおよびin vitroの方法にはいくつか開発されている。 インビボでは 、膀胱内圧測定は、膀胱機能の主要な測定である。これは生理的条件に近い条件下での情報の収集を可能にする無傷製剤であるが、平滑筋ストリップの使用が優先される状況が多数ある。これらは、外科的および/ ​​または薬理学的操作は生存およびインビボでの製剤の安定性、または影響を与える状況を含む研究は、ヒト組織または高価な化学薬品の使用を必要とする場合。この方法はまた、膀胱の各コンポーネントに対する薬剤、年齢や病状の効果の検討を容易にする平滑筋、粘膜、求心性及び遠心性神経、すなわち 。 膀胱ストリップは、科学的な質問の数に答えるために、多くのグループによって長年にわたって使用されてきた。彼らは、エヴァに使用された病理学によって誘導された筋原自発活動のluate変化。この活動は、過活動膀胱（OAB）の緊急性と周波数の症状に寄与すると考えられ、したがって、OAB 3-9のために開発されて薬物のための標的である。膀胱ストリップはまた、イオンチャネルおよび/ ​​または平滑筋の弛緩または収縮のいずれかを誘導するために標的化され得る受容体および/ ​​または細胞内経路を発見する目的で、平滑筋緊張を調節する筋原性および神経因子を調査するために使用された3,10- 13。他の研究では、送信機及び受容体関与しており、病理14,15によって誘導された変更を含む、神経伝達の性質に焦点を当てている。さらに、この方法は、器官19-21、および薬物の構造活性相関の評価の22〜24の間、異なる種からの組織の16〜18間の比較のために使用されてきた。この方法の拡張は、MEASURするために使用されている遠心性神経25から伝達物質の放出に対する薬物の効果を電子。さらに、組織（膀胱、尿道、消化管、GI）（研究のために承認手術または臓器ドナー組織からの）動物またはヒトから採取し、脊髄損傷（SCI）、膀胱出口閉塞などの動物モデルの多様から多様な（BOO）、または間質性膀胱炎（IC）は、この技術を使用して調べることができる。 本論文では、上記のいくつかの科学的問題に対処するために、必要な実験プロトコルと一緒に、このメソッドの使用例を示します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Tissue Bath System with Reservoir</td><td>Radnoti, LLC</td><td>159920</td><td>隔離されたティッシュバス</td></tr><tr><td>温水循環ポンプ</td><td>Kent Scientific Corporation&nbsp;</td><td>TPZ-749</td><td>ティッシュバスを 37 &#176 に保ちます。C</td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ取得システム</td><td>DataQインスツルメンツ</td><td>DI-710-UH</td><td>データの表示・記録・分析へ</td></tr><tr><td>トランスブリッジトランスデューサアンプ</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>SYS-TBM4M</td><td>トランスデューサアンプ</td></tr><tr><td>グラススティミュレータ</td><td>グラステクノロジー</td><td>ズモデル S88</td>型<td>スティミュレータ</td></tr><tr><td>麻酔システム</td><td>ケントサイエンティフィック・コーポレーション&nbsp;</td><td>ACV-1205S</td><td>動物麻酔</td></tr><tr><td>ボックス</td><td>ハーバード大学装置</td><td>500116</td><td>動物麻酔</td></tr><tr><td>マスク</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション&nbsp;</td><td>AC-09508</td><td>動物</td></tr><tr>を麻酔するには<td colspan="4">Materials and Surgical Instruments</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning Corp</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td>組織をピンで留め、解剖し、切断する</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>3160-152</td><td>組織を解剖/切断するには</td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>ENTOMORAVIA Austerlitz 昆虫ピン</td><td>サイズ 5</td><td>組織を固定する</td></tr><tr><td>ベンチパッド</td><td>VWR International</td><td>56617-014</td><td>吸収性ベンチアンダーパッド</td></tr><tr><td>ラット手術キット</td><td>ケントサイエンティフィックコーポレーション&nbsp;</td><td>INSRATKIT</td><td>組織を切除して解剖するには</td></tr><tr><td>2 Dumont #3 Forceps Kent</td><td>Scientific Corporation&nbsp;</td><td>INS500064</td> 組織鉗子 Kent Scientific Corporationの<td>組織を切除して解剖するには</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>INS500092</td><td>組織を切除して解剖するには</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Kent Scientific Corporation&nbsp;</td><td>INS500236</td><td>組織を切除して解剖するには</td></tr><tr><td>メスの刃</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション&nbsp;</td><td>INS500239</td><td>組織を除去して解剖するには</td></tr><tr><td>Professional Clipper&nbsp;</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック株式会社</td><td>CLP-223&nbsp;45</td>毛<td>皮縫</td></tr><tr><td>合糸</td>を取り除くには <td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td>Tie tissue</td></tr><tr><td>Tissue Clips</td><td>Radnoti, LLC</td><td>158802</td><td>組織をロッド/トランスデューサーに取り付ける</td></tr><tr><td>1 g 重量</td><td>&nbsp;メトラー・トレド</td><td>11119525</td><td>トランスデューサの校正</td></tr><tr>用<td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>Krebs Solution: 塩化ナトリウム 塩化カリウム 一塩基性リン酸カリウム 硫酸マグネシウム デキストロース 重炭酸ナトリウム 塩化カルシウム 塩化マグネシウム</td><td>&nbsp; Sigma fisher fisher fisher fisher sigma EMD Baker</td><td>&nbsp; S7653 P. 217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444</td><td>クレブス溶液を調製するには</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>029405</td><td>To動物に麻酔をかける</td></tr><tr><td>&nbsp;酸素タンク</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>ox251</td><td>麻酔システムで使用する</td></tr><tr><td>カルボゲンタンク (95% 酸素; 5% 二酸化炭素)&nbsp;</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>Moxn00hn36D</td><td>クレブス溶液を曝気するには</td></tr></tbody></table>

下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

私たちは、 インビトロ膀胱平滑筋の収縮性を測定する方法、及び生理学的および薬理学的な平滑筋の特性ならびに病理学によって誘導された変化を調査するためのその使用を記載している。この方法は、外科的および薬理学的調製物の安定性および生存に影響を与える操作が、ヒト組織の使用、および/ ​​または高価な化学物質の使用のようなin vivo実験において遭遇する主要な方法論的な困難を克服しながら膀胱機能を理解するための重要な情報を提供する。また、健康的で病的状態で各袋コンポーネント（ すなわち 、平滑筋、粘膜、神経）の特性を調べるための方法を提供します。 膀胱は、麻酔した動物から取り出しクレブス溶液中に入れ、ストリップに切断される。ストリップは温かいKrebs溶液で満たされたチャンバ内に配置されている。一端はアイソメトリックtensioに取り付けられている収縮力を測定するためのn個のトランスデューサ、他端が固定されたロッドに取り付けられている。組織を直接浴にまたはインビボで膀胱収縮をトリガーに似神経を活性化する電場刺激電極によって化合物を添加することによって刺激される。個々の膀胱の成分の役割は、平滑筋活性の調節に関与する因子、発達中および実験的脊髄損傷後の神経伝達（関連する送信機および受容体）の性質を自発的平滑筋収縮性を評価するために、この方法の使用を実証する、と種との薬理学的薬剤に応答して、臓器の違い。さらに、それは伝達物質の放出の収縮および/または平滑筋の弛緩、薬物の構造活性相関評価に関与する細胞内経路を調査するために使用することができる。 in vitroでの平滑筋収縮法がfoは広く使用されている50歳以上のR、および大幅に膀胱機能の理解にも同様に、現在膀胱管理のために臨床的に使用される化合物の医薬開発に貢献したデータを提供してきました。

自発筋原アクティビティ 自発筋原活性は生後発達6-9および病理学的変化（ 例えば 、SCI、BOO）3-5を受ける重要な平滑筋の特徴である。この活性は、過活動膀胱（OAB）2の症状に寄与すると考えられるので、それを調節する受容体、細胞内経路及び薬理学的薬剤の評価は、OABおよびその他の平滑筋機能障害のための有効な治療を開発するための重要度が高いものである。ここで紹介する方法は、簡単にこれらの質問を調査することができます。図2は、新生児（ⅰ）、若年性（ⅱ）成人（iii）および脊髄損傷ラット（SCI;ⅳ）での開発中に筋原性の自発的活動の異なるパターンを示している。新生児ラットからストリップは、成体ラットからストリップしながら、大振幅、低周波リズミカルな収縮（ 図2AI）を示すsは小振幅、高周波活性（ 図2Aiiこと、iii）を示す。 SCI後新生児パターン（ <str...

この原稿は、薬理学的薬剤または神経刺激に応答して平滑筋収縮性を評価するためのインビトロの方法で 、シンプルでありながらパワフルなを提示します。主な用途は、薬物スクリーニングと理解組織生理学、薬理学、病理学である。

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

この手順の全体的な目標は、膀胱平滑筋組織の生理学的および薬理学的特性を評価することです。これは、ラットの膀胱を解剖し、平らなシートに開き、尿路上皮の平滑筋と神経を含むストリップを切断することによって達成されます。2番目のステップでは、筋肉の収縮性を測定するための増幅器と刺激装置に接続された力変換器に組織が取り付けられます。次のステップでは、ベースライントーンと組織の生存率が確立され、次にストリップが薬理学的刺激および/または電気刺激にさらされます。最終的には、膀胱平滑筋組織の収縮性に対する刺激の影響を測定できます。この方法は、膀胱全体に対する病理学的および薬理学的化合物の影響、ならびに尿路上皮の平滑筋神経などの特定の膀胱組織成分、ヒトおよび動物への影響を特徴付けるために使用されます。この技術は、明確に定義され制御された環境での薬理学的薬剤の迅速、簡単、再現性のあるスクリーニング方法を表すため、さまざまな膀胱機能障害の治療法の開発中に広く使用されています。後肢の喪失により麻酔を確認した後、反射を撤回し、動物の腹部を剃った後、腹部正中線切開により骨盤内臓器を露出させます。次に、膀胱と尿道を特定し、近位尿道に近い膀胱頸部を切断します。膀胱を取り外すには、通気されたクレブ溶液で満たされたシルガードコーティング皿に組織をすぐに置きます。.次に、動物を犠牲にした後、膀胱ドームの首と尿管に組織解剖ピンを挿入して、組織を伸ばさずに組織を安定させ、さらに解剖します。無関係な組織の膀胱をトリミングし、次に組織を基部からドームまで開いて、平らなシートの肝硬変側を下にして、管腔側を上にして作成します。組織の各角に解剖ピンを配置し、膀胱、首、ドーム組織を取り出します。次に、ティッシュを基部からドームまで縦に約2×8mmのストリップにカットし、各ストリップの両端にティッシュクリップを取り付けます。ストリップを実験チャンバーに移し、各ストリップの一方の端を力変換器に、もう一方の端を固定ロッドに取り付けます。次に、ベースライン張力が1グラムに達するまで組織を優しく伸ばします。最初は、組織は弛緩する傾向があり、これはベースライン張力の低下として記録されます。温かい通気されたクレブで約15分ごとにストリップを洗い、ベースライン張力を1グラムに調整します。各洗浄後、組織がリラックスしなくなるまで、組織を約1〜2時間平衡化させます。ベースライン張力が安定したら、塩化カリウムを5分間、またはプラトー反応に達するまで浴に直接追加して、組織の生存率をテストします。次に、温かい通気されたクレブで組織を3〜5回洗い、組織が治療前の状態に戻るようにします。薬理学的平滑筋刺激のためには、濃縮溶液からの薬物を直接浴に加える。例えば、カルバホール刺激の場合、各10ミリリットルの組織浴に、刺激の各濃度の10マイクロリットルを加える。前の濃度からの応答がプラトーに達するとすぐに。平行なストリップで、平滑筋の神経刺激または電界刺激のために、ビヒクルを等量追加します。列車の所要時間を 3 秒から 10 秒に設定し、列車間の間隔を少なくとも 1 分間隔に設定します。列車刺激の周波数を確立した後、0.5〜50ヘルツの範囲の周波数応答曲線を実行して、刺激の強度を確立します。収縮の振幅がプラトーに達するまで電圧を体系的に増加させ、周波数を一定に保ちます。刺激パラメータが確立されたら、電界刺激のために約20〜30分待ち、誘発された収縮が安定するまで薬物試験の前に。次に、電界刺激に対するアルファベータメチレンTPとアトロピンの影響をテストするには、たとえば、2つの制御周波数応答曲線を実行し、次にテストストリップに10マイクロリットルのアルファベータメチレンTPを追加し、制御ストリップに10マイクロリットルの車両を追加します。アルファベータメチレンA TPは、平滑筋の純粋受容体を直接刺激し、これらの受容体を脱感作して初期ベースライン収縮を引き起こします。応答がベースラインに戻ったら、すべてのストリップで周波数応答曲線を繰り返します。テストストリップに10マイクロリットルのアトロピンを追加し、コントロールストリップに10マイクロリットルの車両を追加し、電界刺激の終わりに周波数応答曲線を繰り返します。ナトリウムチャネル遮断薬テトラによる毒素への神経伝達を遮断することにより、電界刺激の選択性を検証します。最後に、ストリップのクリップを外します。ティッシュペーパーで軽くブロックして余分な水分を取り除き、天びんの各ストリップの重量を測定して、平滑筋の緊張への影響を判断します。適切なデータ解析ソフトウェアを使用して、薬物誘発反応のピークの少なくとも10〜30秒のウィンドウを選択し、収縮の振幅を測定して、神経誘発性収縮に対する実験的治療の効果を決定します。薬物誘発反応のピーク前とピーク時の少なくとも 3 回の収縮の振幅、持続時間、および曲線下面積を測定します。最後に、データを正規化して、ストリップと薬理学的処理の結果を比較します。自発的な筋原性活動は、出生後の発達および病理学中に変化する平滑筋の特徴です。この代表的な実験では、新生児ラットのストリップは大きな振幅の低周波のリズミカルな収縮を示しますが、成体ラットのストリップは脊髄損傷後に小さな振幅の高周波活性を示します。新生児のパターンは、A-K-C-N-Qチャネルオープナーは、成体ラットの平滑筋の緊張と収縮性の特性からストリップの自発的な活動の振幅を減少させます。これは、尿路上皮と粘膜の影響を受ける可能性がありますが、尿の貯蔵と排尿中の適切な膀胱機能のための重要な要素です。例えば、このグラフでは、平滑筋の緊張度が高いほど濃度依存性が増しています。カリコールにより、ブタ膀胱ストリップにおけるムスカリン受容体の活性化が示される。カルバホール治療に反応した筋肉の収縮性の低下は、粘膜の存在下で観察されます。このグラフが示すように、副交感神経では5つのHT4受容体が事前に発現しており、その活性化によりアセチルコリン濃度が上昇します。これらのグラフは、ヒトの膀胱と回腸ストリップに対する5つのHT4受容体アゴニストであるシサプリドの興奮効果の異なる有効性と効力を示しています。多くの受容体に存在する種差は、この膀胱ストリップ法を使用して評価できます。例えば、これらのデータは、ボンベシン受容体拮抗薬がラットの膀胱に興奮性の作用を持ち、マウスまたはブタの膀胱ストリップには影響を与えないことを示しています。薬理学的刺激では、薬物適用の濃度、タイミング、および期間に注意を払うことが重要です。他の受容体への非特異的な影響や神経刺激の標的受容体の脱感作を避けるためには、実験の目的に応じて電界刺激の正しいパラメータを選択し、刺激が平滑筋を直接活性化しないようにすることが重要です。

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膀胱内圧測定では、小動物の膀胱機能を測定するための効率的な手法である...

小型げっ歯類における膀胱内圧測定の使用：膀胱Chemosensationの研究

膀胱拡大の外科的段階は、マウスおよびラットモデルでの3​​-Dの足場を使用して記述されています。膀胱拡大で使用するための生体材料の構成の有効性をテストするには、目を覚ましと麻酔の両方膀胱内圧測定するためのテクニックを紹介しています。...

各種齧歯類モデルで内圧分析を用いた膀胱補強のためのバイオマテリアルの評価

このプロトコルは、孤立した組織浴システムとコンピュータベースのデータ取得を使用して、孤立した平滑筋製剤における等尺性収縮の測定を説明しています。...

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

この説明は前のヴィヴォひと子宮筋の収縮や創.の応用を研究する実験的プロトコル小説研究プローブから薬理学的データを検証するだけでなく新たな子宮筋生理機能の理解を改善するためにこのテクニックを使用または薬剤をリードします。...

援助医薬品開発への人間の子宮平滑筋の収縮力測定

膀胱体積、膀胱壁厚、尿速度、空隙容積、空隙持続時間、尿道径を測定する方法として、コントラストイメージングを用いて高周波超音波の使用について説明する。この戦略は、下部尿路機能障害(LUTD)の様々なマウスモデルにおける空虚な機能不全および治療有効性を評価するために使用することができる。...

尿機能検査のための成人男性尿路の超音波検査

2段階の酵素手順を用いたヒト尿膀胱標本からの単一の単一の単離されたデトルザス平滑筋細胞の調製方法を記載する。得られた生存可能なDSM細胞は、生理学的および薬理学的特性を明らかにするために記載されたアンホテリシン-Bパッチクランプ電気生理学を含む様々な単一細胞技術によって研究することができる。...

9-フェナントロル感受性カチオン電流の特性評価のための新たに分離されたヒトデトルサトール平滑筋細胞の調製と利用

デトルソールフリー膀胱モデルは、サブグロテリウムへの直接アクセスを可能にし、尿の貯蔵および空洞化中にサブロテリウム/ラミナ・プロプリアにおける生物学的に活性なメディエーターの可用性を調節するための局所メカニズムを研究する。調製物は、無傷の膀胱の充填によく似ており、全身的な影響を受けずに圧力量の研究を行うことができます。...

膀胱充填中にスブロテリウムに直接アクセスするために脱皮筋を除去した分散型(Ex Vivo)マウス膀胱モデル

このプロトコルは、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を測定するための手順を説明しています。...

インビボ げっ歯類における膨満誘発性尿路上皮ATP放出の内腔測定

マウスの膀胱壁の注入は、同所膀胱の幹細胞と癌の生物学を研究するために有用なアプローチである。この繊細な顕微法は慎重に手法と実践を習得することができます。...

マウスの膀胱壁インジェクション

急性呼吸窮迫症候群（ARDS）や重症疾患の生存者はしばしば長期的な筋力低下を開発する。徒手筋力テスト（MMT）は、一般的に末梢骨格筋群の強度を測定するために使用される標準化された臨床試験です。このビデオでは、6ポイントの医学研究評議会のスケールを使用してMMTを示しています。...

徒手筋力テスト：四肢筋力の測定方法は、危篤状態の患者に適用

学ぶ膀胱平滑筋収縮ストリップ法による下部尿路薬理学評価。ラット膀胱を解剖し平滑筋と神経を含む組織片を作製し、力トランスデューサーで収縮性を測定する。薬理学的・電気的刺激の効果を定量化し、膀胱機能と創薬スクリーニングの理解に貢献する。

下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

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