下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

この手順の全体的な目標は、膀胱平滑筋組織の生理学的および薬理学的特性を評価することです。これは、ラットの膀胱を解剖し、平らなシートに開き、尿路上皮の平滑筋と神経を含むストリップを切断することによって達成されます。2番目のステップでは、筋肉の収縮性を測定するための増幅器と刺激装置に接続された力変換器に組織が取り付けられます。

次のステップでは、ベースライントーンと組織の生存率が確立され、次にストリップが薬理学的刺激および/または電気刺激にさらされます。最終的には、膀胱平滑筋組織の収縮性に対する刺激の影響を測定できます。この方法は、膀胱全体に対する病理学的および薬理学的化合物の影響、ならびに尿路上皮の平滑筋神経などの特定の膀胱組織成分、ヒトおよび動物への影響を特徴付けるために使用されます。

この技術は、明確に定義され制御された環境での薬理学的薬剤の迅速、簡単、再現性のあるスクリーニング方法を表すため、さまざまな膀胱機能障害の治療法の開発中に広く使用されています。後肢の喪失により麻酔を確認した後、反射を撤回し、動物の腹部を剃った後、腹部正中線切開により骨盤内臓器を露出させます。次に、膀胱と尿道を特定し、近位尿道に近い膀胱頸部を切断します。

膀胱を取り外すには、通気されたクレブ溶液で満たされたシルガードコーティング皿に組織をすぐに置きます。.次に、動物を犠牲にした後、膀胱ドームの首と尿管に組織解剖ピンを挿入して、組織を伸ばさずに組織を安定させ、さらに解剖します。無関係な組織の膀胱をトリミングし、次に組織を基部からドームまで開いて、平らなシートの肝硬変側を下にして、管腔側を上にして作成します。

組織の各角に解剖ピンを配置し、膀胱、首、ドーム組織を取り出します。次に、ティッシュを基部からドームまで縦に約2×8mmのストリップにカットし、各ストリップの両端にティッシュクリップを取り付けます。ストリップを実験チャンバーに移し、各ストリップの一方の端を力変換器に、もう一方の端を固定ロッドに取り付けます。

次に、ベースライン張力が1グラムに達するまで組織を優しく伸ばします。最初は、組織は弛緩する傾向があり、これはベースライン張力の低下として記録されます。温かい通気されたクレブで約15分ごとにストリップを洗い、ベースライン張力を1グラムに調整します。

各洗浄後、組織がリラックスしなくなるまで、組織を約1〜2時間平衡化させます。ベースライン張力が安定したら、塩化カリウムを5分間、またはプラトー反応に達するまで浴に直接追加して、組織の生存率をテストします。次に、温かい通気されたクレブで組織を3〜5回洗い、組織が治療前の状態に戻るようにします。

薬理学的平滑筋刺激のためには、濃縮溶液からの薬物を直接浴に加える。例えば、カルバホール刺激の場合、各10ミリリットルの組織浴に、刺激の各濃度の10マイクロリットルを加える。前の濃度からの応答がプラトーに達するとすぐに。

平行なストリップで、平滑筋の神経刺激または電界刺激のために、ビヒクルを等量追加します。列車の所要時間を 3 秒から 10 秒に設定し、列車間の間隔を少なくとも 1 分間隔に設定します。列車刺激の周波数を確立した後、0.5〜50ヘルツの範囲の周波数応答曲線を実行して、刺激の強度を確立します。

収縮の振幅がプラトーに達するまで電圧を体系的に増加させ、周波数を一定に保ちます。刺激パラメータが確立されたら、電界刺激のために約20〜30分待ち、誘発された収縮が安定するまで薬物試験の前に。次に、電界刺激に対するアルファベータメチレンTPとアトロピンの影響をテストするには、たとえば、2つの制御周波数応答曲線を実行し、次にテストストリップに10マイクロリットルのアルファベータメチレンTPを追加し、制御ストリップに10マイクロリットルの車両を追加します。

アルファベータメチレンA TPは、平滑筋の純粋受容体を直接刺激し、これらの受容体を脱感作して初期ベースライン収縮を引き起こします。応答がベースラインに戻ったら、すべてのストリップで周波数応答曲線を繰り返します。テストストリップに10マイクロリットルのアトロピンを追加し、コントロールストリップに10マイクロリットルの車両を追加し、電界刺激の終わりに周波数応答曲線を繰り返します。

ナトリウムチャネル遮断薬テトラによる毒素への神経伝達を遮断することにより、電界刺激の選択性を検証します。最後に、ストリップのクリップを外します。ティッシュペーパーで軽くブロックして余分な水分を取り除き、天びんの各ストリップの重量を測定して、平滑筋の緊張への影響を判断します。

適切なデータ解析ソフトウェアを使用して、薬物誘発反応のピークの少なくとも10〜30秒のウィンドウを選択し、収縮の振幅を測定して、神経誘発性収縮に対する実験的治療の効果を決定します。薬物誘発反応のピーク前とピーク時の少なくとも 3 回の収縮の振幅、持続時間、および曲線下面積を測定します。最後に、データを正規化して、ストリップと薬理学的処理の結果を比較します。

自発的な筋原性活動は、出生後の発達および病理学中に変化する平滑筋の特徴です。この代表的な実験では、新生児ラットのストリップは大きな振幅の低周波のリズミカルな収縮を示しますが、成体ラットのストリップは脊髄損傷後に小さな振幅の高周波活性を示します。新生児のパターンは、A-K-C-N-Qチャネルオープナーは、成体ラットの平滑筋の緊張と収縮性の特性からストリップの自発的な活動の振幅を減少させます。これは、尿路上皮と粘膜の影響を受ける可能性がありますが、尿の貯蔵と排尿中の適切な膀胱機能のための重要な要素です。

例えば、このグラフでは、平滑筋の緊張度が高いほど濃度依存性が増しています。カリコールにより、ブタ膀胱ストリップにおけるムスカリン受容体の活性化が示される。カルバホール治療に反応した筋肉の収縮性の低下は、粘膜の存在下で観察されます。

このグラフが示すように、副交感神経では5つのHT4受容体が事前に発現しており、その活性化によりアセチルコリン濃度が上昇します。これらのグラフは、ヒトの膀胱と回腸ストリップに対する5つのHT4受容体アゴニストであるシサプリドの興奮効果の異なる有効性と効力を示しています。多くの受容体に存在する種差は、この膀胱ストリップ法を使用して評価できます。

例えば、これらのデータは、ボンベシン受容体拮抗薬がラットの膀胱に興奮性の作用を持ち、マウスまたはブタの膀胱ストリップには影響を与えないことを示しています。薬理学的刺激では、薬物適用の濃度、タイミング、および期間に注意を払うことが重要です。他の受容体への非特異的な影響や神経刺激の標的受容体の脱感作を避けるためには、実験の目的に応じて電界刺激の正しいパラメータを選択し、刺激が平滑筋を直接活性化しないようにすることが重要です。