神経回路基盤記憶形成を解剖するための新生児ラットの左右で非対称匂い学習モデル

このプロトコルは、急性の単一閉塞を使用してラットに側方化された早期の匂い嗅覚学習を導入します。これは、最初に取り外し可能なポリエチレン製のノーズプラグを構築することによって達成されます。2番目のステップは、行動トレーニングの前に目的の牡羊座を閉塞することです。

次に、香りのする寝具を準備し、絵筆で撫でながら香りの寝具で動物を訓練します。最後のステップは、2つの選択式試験装置を使用して横方向の臭気の好みをテストすることです。最終的に、リン酸化Cアンプ応答エレメント結合タンパク質またはPクリブの免疫組織化学を使用して、単一隔離によるニューロン活動の片側性サイレンシングとメソッドの可逆性を実証します。

この技術の主な利点は、既存の動物間防除方法の主な利点は、出生後の層11の前に動物内防除実験デザインの性質を通じて変動性と動物数を減らすことができることです。MA成熟した前部の予測がないため、2つの嗅覚半球が接続されていません。これにより、単一の栄養オクルージョンを通じて、一方の半球を他方の半球から独立して操作することができます。閉塞した半球は、動物内制御として機能します。

この手法は、新生仔ラットの嗅覚学習に焦点を当てていますが、その意味するところにより、シナプス可塑性、化生、およびそれらの基盤となる分子メカニズムなど、学習と記憶の神経プロセスに関する基本的な質問に答えることができます。この方法を用いた研究から導き出された結論は、特に出生後の臨界期における学習と記憶、および哺乳動物の基本原理に一般化することができる。これにより、病態生理学的状態に関連する記憶喪失の潜在的な治療法の有望な背景を構築することができます。

この方法は、匂いの知覚や匂いのコーティングなど、他の嗅覚関連プロセスにも非常に適しています。ノーズプラグは、ポリエチレン20チューブと3本のゼロシルク縫合糸で構成されています。まず、ポリエチレンの小片を22センチメートルから約0.8センチメートルにカットします。

次に、準備したチューブに絹の縫合糸を通し、チューブのセクションの両側に糸が通るようにします。プラグの外側のネジ山の一方の端で、結び目を作ります。チューブの部分をねじ山の結び目の上に引き下げます。

結び目はチューブの内側に留まる必要があります。チューブの一方の端から約2mmのねじ山が突き出るように、ねじ山の両端をトリムします。この手順を開始するには、子犬をダムから取り外し、通常の寝具で覆われた安全な皿に入れます。

綿の先端アプリケーターを使用して、牡羊座に局所麻酔ゼリー、2%キシロカインを軽くたたき、閉塞させます。子犬を皿の中で約3分間休ませます。子犬のルーシンは、この手順で最も重要なステップです。

鼻栓の挿入中に治療を行い、出血や組織の損傷を防ぐ必要があります。次に、子犬を拾い上げ、利き手の非利き手で優しく、しかししっかりと保持し、鼻をつまみ、糸がはみ出していない先端の周りに同じ局所麻酔薬ゼリーを差し込んで軽くたたきます。これは、プラグの挿入に関連する軽度の痛みの麻酔薬と、NES内の潤滑剤の両方として機能します。

子犬をしっかりと保持し、プラグが完全に挿入され、牡羊座から2ミリメートルの糸だけが突き出るまで、非常に優しく押してプラグをゆっくりと回転させることで、鼻プラグをそっと挿入します。この過程で、どちらの牡羊座からの出血もあってはなりません。鼻栓挿入時に出血した子犬は実験には使用できません。

動物を皿に5分間休ませて、プラグに慣れさせます 臭気の汚染を防ぐためのトレーニングを開始する前に、ヒュームフードに香りのする寝具を準備し、新しい手袋を着用しながら、500ミリリットルの木材チップ寝具をビニール袋に入れます。注射器を使用して0.3ミリリットルのペパーミント抽出物を引き出し、これをビニール袋の寝具にスプレーします。バッグを閉じ、バッグを激しく振って寝具をバッグに5分間置くと、香りのよい寝具をヒュームフードに覆われていない透明な浅い20 x 20 x 5cmのアクリルトレーニングボックスに入れます5分間使用前に。

寝具が準備できたら、使用済みの手袋は捨ててください。手袋が動物に触れないようにしてください。500ミリリットルの無香料の寝具を別の清潔なアクリルトレーニングボックスに入れ、匂いのする寝具や使用済みの手袋と接触しないようにします。

匂いコンディショニングパラダイムは、慣れた子犬を実験的な匂いのする寝具の上に置くことから始めます。さらに、ストロークOS陽性の子犬。子犬を30秒間撫でます。

小さな絵筆を使用して、主に子犬の後部の周りで急速な円運動を使用します。なでると、嗅球と嗅皮質へのノルエピネフリンの放出が誘発されます。これは無条件の刺激として機能します。

子犬を30秒間休ませます。30秒間のストロークを繰り返し、続いて30秒間の休憩を合計10分間繰り返します。なでることと臭いの10組が完成したら、子犬をコンディショニングボックスから取り出します。

ノーズプラグを取り外し、子犬をダムに戻して制御します。OSネガティブな子犬のみの臭い。慣れ親しんだ子犬を香りのよい寝具に10分間置かずに

10分後、子犬をコンディショニングボックスから取り出します。ノーズプラグを取り外し、子犬をダムに戻します。ラテラル化された臭気選好テストは、最終トレーニングセッション後のさまざまな時点で実行されます。

試験は、2センチメートルの中性ゾーンで区切られた2つのアクリルトレーニングボックスの上に置かれた30 x 20 x 18センチメートルのステンレス鋼試験チャンバーで行われます。1つのトレーニングボックスには香り付きの寝具が入っており、もう1つのボックスには清潔な無香料の寝具が入っています。先に示したように、ペパーミントの香りの寝具と香りのない寝具を1つずつ用意し、各ボックスを試験室の反対側の下に置きます。

2センチ離れています。プラスチックメッシュを試験チャンバーの金属グリッド床に置きます。ダムからPを取り外し、閉塞している牡羊座に無臭のシリコングリースをしっかりとたたきます。

トレーニング中、グリースは必要に応じて最初のテスト手順全体で再塗布できます。子犬を試験チャンバーの中立ゾーンに置きます。子犬がチャンバーを1分間探索し、子犬がチャンバーの両側、つまりペパーミントまたは中性的な香りの寝具で過ごした時間を記録します。

子犬を蓋付きのプラスチック製の保持チャンバーに移し、1分間休ませます。テスト試行を合計10分間繰り返し、チャンバー内の子犬の初期向きを切り替えて、方向の好みを制御します。テストの直後に、Ariesからグリースを拭き取ります。

前に示したのと同じRY隔離手順に従って、ポリエチレン製の鼻プラグを反対側の牡羊座に挿入し、動物を10分間休ませます。その後、子犬に対して横方向の臭気選好試験が行われます。又。テストが完了したら、プラグを取り外し、子犬をダムに戻します。

匂いとストロークトレーニング中の単一の狭い隔離は、免れたNRIに限定された横方向の匂いの記憶につながります。子犬がトレーニング中と同じ人里離れた場所で匂いの好みをテストすると、子犬は条件付けされた匂いを好むことを示します。これは、テストが反対側の人里離れた場所で行われたときには観察されませんでした。

対照的に、臭気のみの対照群は、どのナイスが閉塞しているかに関係なく、臭気の好みを示さない。テスト中、横方向の臭気トレーニングは、臭気曝露中の嗅覚系の側方活性化をもたらし、嗅球またはOBおよび前梨状皮質またはPCの免疫組織化学は、匂い曝露後の閉塞した半球のリン酸化クレブを対側のスペア半球と比較して有意に少ないことを示しました。ニッセル染色は、OBの僧帽弁細胞層と両半球のPCの錐体細胞層に同等の細胞体を示しています。

鼻栓の除去から24時間後 エンドウ豆のカニの発現 OBの僧帽細胞とPCの錐体細胞における臭気への曝露は、閉塞した半球と温存された半球の間で同等です。これは、1回の試行および隔離の効果が一時的かつ可逆的であり、試験中の匂い知覚および匂いに対するニューロンの活性化に影響を与える可能性のある目に見える長期的なニューロン損傷をもたらさないことを示している。一度マスターすると、NAオクルージョンは適切に行われれば5分以内に行うことができます。

この手順を試みるときは、鼻孔を塞ぐときに細心の注意を払うことが重要です。過度の力や不適切な技術は、出血を引き起こし、したがってこの手順の後に鼻孔に損傷を与える可能性があります。ex vivo、電気生理学、分子技術などの他の方法を使用して、シナプス可塑性に関する追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、匂い学習を側方化し、記憶形成を支える神経回路を解剖するために、一時的な片側狭義の咬合をどのように使用するかを十分に理解できるはずです。