マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

この手順の全体的な目標は、マウス胚性腸の全臓器培養物をex vivoで増殖させ、細胞シグナル伝達経路の調節を可能にすることです。これは、まず胎児の12.5日目から18.5日の間に胎児からマウス腸を採取することによって達成されます。2番目のステップは、腸をトランズウェル培養またはライブイメージング培養プレートに入れることです。

次に、細胞シグナル伝達経路または場所の薬理学的阻害剤で調製した培地で腸を治療します。aroは、腸の上で細胞シグナル伝達を変化させるために、組換えタンパク質を浸した速度です。最後のステップは、培養された腸を厚いビオーム切片またはホールマウントで画像化することです。

最終的には、共焦点イメージングとそれに続く3次元再構成を使用して、細胞シグナル伝達経路の調節が絨毛形成中の組織層の発達にどのように影響したかを視覚化します。胚組織は非常にデリケートで、解剖や取り扱いには細心の注意が必要なため、この方法を視覚的に示しておくことが重要です。解剖の準備をするには、解剖ツールを70%エタノールに浸します。

6ウェル培養プレートとBGJB培地を入れた10cmのシャーレを氷上に置きます。次に、安楽死させた胎児から腸を取り出します。それらを1つずつ1つのX-D-P-B-Sで解剖します。

胃から脾臓を慎重に取り除き、次に胃と上部十二指腸から膵臓を取り除きます。その後、大網をできるだけ付着させたまま、腸がまっすぐになるのに十分なだけ接続部を分離して、静かに分離します。次に、BGJB培地が動作する10cmのペトリプレートにサンプルを置きます。

次に、マウスピペットを使用して、腸片を培養プレートのトランズウェルに移します。トランズウェルの下からメディアを取り出します。次に、トランスの下に700マイクロリットルの治療培地を追加します。

その後、300マイクロリットルの治療培地を腸に滴下し、トランズウェルに染み込ませます。処理媒体は、少なくとも1日1回、または処理試薬の半減期に応じてそれ以上の頻度で交換してください。あるいは、引っ張った毛細血管針付きのマウスピペットを使用して、アグロビーズを腸にそっと置きます。

乱暴な取り扱いは腸を損傷し、負傷した領域の絨毛の発生を防ぐため、ビーズは細心の注意を払って配置してください。この手順では、腸を小さなプラスチック型に7%arosに埋め込み、arosブロックを冷まして固化させます。その後、プラスチック型からarosブロックを取り外します。

アロスブロックをビブラムコレクションステージに瞬間接着剤で接着します。次に、収集ステージに氷冷したX-D-P-B-Sを入れます。切片を100〜150マイクロメートルの厚さでカットします。

次に、収集段階からセクションを6ウェルプレートのウェルに移し、摂氏4度で保存します。取り付け用のスライドを準備するには、各スライドの長いスライドに沿って両面テープを貼ります。その上に 1 つの XPBS をドロップします。

次に、スライドに5〜10個のセクションを慎重に配置します。すべてのセクションを展開し、1つのレイヤーに広げます。スライドを横切って。

カバーの滑りが平らになるのを防ぐ余分なアロや不均一なビットをすべて取り除きます。ラボティッシュを慎重に使用して、切片の周囲から余分な1つのXPBSを吸収します。次に、切片の上に水性封入剤を滴下します。

次に、カバースリップをその上に置き、溶かした蒸気でスライドに密封します。その後、直立または倒立共焦点顕微鏡でビオーム切片を画像化します。次に、瞬間接着剤を使用して、個々のポリカーボネートメンブレンを細かいメッシュスクリーンに接着します。

メッシュスクリーンを培養プレートの中央ウェルに置きます。次に、解剖した腸をポリカーボネート膜に置き、両端に瞬間接着剤を一滴加えます。次に、フェノールレッドを含まない培地を、培養プレートの中央ウェルのポリカーボネート膜の下に加えます。

培養プレートの外縁に水を加えて湿度を確保します。胎児の腸は文化の収縮の波のような蠕動運動を経るので、xylazineの解決の100マイクロリットルを版の中央の井戸の媒体の3ミリリットルに加えてイメージ投射しながら腸の動きを制御するため。直立したスタンドで2光子共焦点蛍光顕微鏡を使用してライブイメージングを行います。

ここに示されているのは、本明細書のecatおよびdpiで染色された、新たに収穫されたE14、E15、およびE16十二指腸組織の断面である。この腸内セグメントはE14で収穫され、2日間培養されました。E 14では、モデル化されていない上皮はまだ疑似層化されていました。

培養で2日後、VIIは見えますが、VIIに比べてわずかに遅れています。E 16では、E14十二指腸のpcam染色血管系の光学切片の3次元再構成を示し、この図は、抗体免疫蛍光染色したE 15.5 viome切片腸からの共焦点画像の3次元再構成を示しています。このビデオを見れば、胚組織を解剖する方法、腸を全臓器培養用に設定する方法、高品質の3次元イメージングのための組織の準備方法についてよく理解できるはずです。