Name: マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 学ぶマウス胎児腸全体培養システムを用いたシグナル伝達経路の操作と絨毛発達の3次元ライブイメージング手法。この技術は発生生物学研究において器官形成メカニズムの解明に貢献します。

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私たちは、デボラ・L・グムシオ博士をアドバイザーとして、また、培養とイメージングの方法を定義するための彼女の貴重なサポートに感謝します。また、ジム・ブロディ博士、ホンシャン・ルー博士、シャーロット・ミストレッタ博士、アン・グロッセ博士にも、腸内臓器培養システムの開発に貢献していただいたことに感謝いたします。イメージングに関する有益なディスカッションでは、Chip Montrose博士、Michael Czerwinski博士、Sasha Meshinchi氏から優れたアドバイスが寄せられました。すべてのイメージングは、ミシガン大学の顕微鏡および画像解析研究室で行われました。資金援助はNIH R01 DK065850によって提供されました。

注：すべてのマウスを人道的に実験動物医学ミシガン大学医学部号機大学によって承認されたプロトコルを使用し、動物の使用およびケアに関する研究委員会のガイドラインに従って取り扱った。 1全臓器培養システム<ol><li>培地および培養プレートの調製<ol><li>組織培養フードでは、ストックボトルからBGJbメディアの5ミリリットルを除去し、ペニシリン/ストレプトマイシンを5ml加える。 （ペニシリン/ストレプトマイシンで）BGJb培地49 mlに5 mg / mlのアスコルビン酸の1ミリリットルを加えることで、50ミリリットルコニカルチューブ内のメディアの作業ストックを準備します。 </li><li>トランスウェルのそれぞれの下に1ミリリットルを追加することによって、6ウェル培養プレートを準備します。 注記：すべての6トランスウェルを使用しない場合は、後で使用するために、新鮮な無菌6ウェルプレートに余分なトランスウェル移動します。 3 10センチメートル無菌ペトリ皿のそれぞれに作業BGJbメディアの3ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li>解剖の準備<ol><li> 70％のETHAに解剖ツールを浸すとNOL作業中にきれいな道具を保管してください。 </li><li>大きな氷​​のバケツに解剖エリアを設定し、氷上でBGJbメディアを6ウェル培養プレートから10cmペトリ皿を置きます。解剖と文化のための腸の準備中に、できるだけ多くの氷の上で作業。 </li><li>胎児の腸の収穫のために頸椎脱臼により安楽死の前にイソフルラン（100μL）をチャンバー内での成体雌マウスを麻酔。 </li><li>母親から胎児を収穫した後、タイラーステージングチャート13に従って慎重にそれぞれの胎児を上演。日常的に、単一のゴミ内で観察された発生段階で最大24時間の変動などの各胎児の年齢を決定するために、後の性交日に依存しないでください。 </li></ol></li><li>胎児の腸の解剖<ol><li>前腸の除去に断頭によって胎児を安楽死させる。 </li><li> 1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で各腸を分析した後、ナンプラーBGJbメディアを作業した10センチメートルペトリ皿にそれをCE。 </li><li>慎重に胃および上部十二指腸から胃や膵臓から脾臓を除去します。 </li><li>静かに腸がまっすぐにさせることが可能とだけ十分な接続を分離する限り添付大網を残すように注意しながら大網を分離。 注：E14.5より古い腸以上24時間未満培養されたもののために、静かに管腔内容が腸を通って流れるようにし、切断端から排出されるために可能にするために3等分腸を分離する。培養はE13.5前に始まっただし、漿膜が正常に腸の長さにわたって成長を可能にするために、腸の3つのセグメントを分離する前に、培養24時間後まで待ちます。 </li><li>培養プレート（1.1.2）のトランスウェル上に腸の部分を転送するために口のピペットを使用してください。 </li><li>彼らはtranswel渡って真っ直ぐになるように、必要に応じて静かに腸の位置を変更lである。 注：腸管を通って管腔内容物を移動させ始めると、腸がねじれは、腸へのバックアップや損傷の原因となります。 </li></ol></li><li>文化と治療<ol><li>トランスウェルの下に（追加された組換えタンパク質または薬理学的阻害剤と作動媒体）、トランスウェルの下から培地を除去処理培地700μlのを追加します。 </li><li>腸の上に処理媒体の滴ずつ300μlのを追加し、それがトランスウェルを通して浸すことができます。必要に応じて腸の位置を変更。 </li><li>処理媒体は、少なくとも一日一回またはより頻繁に治療試薬の半減期に応じて変化する。 </li></ol></li><li>治療試薬の局在化のためのタンパク質源浸したアガロースビーズの調製<ol><li>彼らの貯蔵容器にアガロースビーズを再懸濁し、1.5mlマイクロチューブにアガロースビーズを100μlを移す。 </li><li>無菌1×pHのチューブの残りの容量を埋めるosphate-緩衝生理食塩水（PBS）と、それらを洗浄するためにビーズを混ぜて。ビーズが底に沈殿した後、ビーズの上から、PBSをオフにピペッティングすることを可能にするために数分間ラックにマイクロチューブを置きます。無菌1×PBSでマイクロチューブを補充し、さらに2回の洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 2回の治療のために所望の濃度で目的のタンパク質を準備します。 </li><li> 2倍のタンパク質原液5μlの水で洗浄したアガロースビーズを5μlを混合し、静かに、タンパク質中のビーズを攪拌する。静かに10〜15分毎に混合、1時間チューブを氷上に置きます。 </li><li>腸にビーズを配置する前に、滅菌1×PBS中で簡単にビーズをすすぐ。 </li></ol></li><li>アガロースビーズの配置<ol><li>静かに引っ張らキャピラリー針で口のピペットを用いて腸の上にアガロースビーズを配置します。乱暴な取り扱いが腸を損傷し、損傷した領域に絨毛の発達を防ぐことができますように細心の注意を払ってビーズを配置します。 </li><li>腸蠕動運動や培養時間にわたる腸のオフにロールバックされます置かれたビーズの約半分を受けるので、分析に必要とされる2倍のビーズを配置します。 </li></ol></li><li>培養された腸の固定<ol><li>慎重にトランスウェルの下から処理媒体を除去し、3分間空気乾燥腸を可能にします。 </li><li>その後定着時間の残りのための固定液2mlで腸の上部をカバーする、2分間のトランスウェルの下の固定液1ミリリットルを追加します。 4℃でまたは室温で2時間、4％パラホルムアルデヒドのO / Nで固定してください。 </li></ol></li></ol>固定腸の2イメージング<ol><li>ホールマウントイメージング<ol><li> 1X DPBS100μlのスライド上で（内因性蛍光を含む）全体の腸を置きます。優しく腸を配置する鉗子を使用してください。 </li><li>組織MOを作るために慎重に70％グリセロール100μlのDPBSを削除し、すぐに追加するには、実験室の組織を使用して、透明な再およびイメージングの可能性の深さを増加させる。 注：腸のさらなる浸透が望まれる場合、代わりに70％グリセロール中に腸を取り付ける、10〜30分間、フォーカスクリア溶液の数滴で腸を浸す。ピペットでフォーカスクリアソリューションオフとマウント解除と腸をマウントします。 </li><li>粘土にカバースリップの四隅を浸し、腸を平坦からカバースリップを保つために、スライドとカバーガラスの間にスペーサーとして使用するために、粘土の少量を拾う。 </li><li>綿棒で塗布溶融しVALAPでスライド上にカバーガラスを密封。 </li><li>イメージ直立または倒立型共焦点顕微鏡のいずれかで、腸。詳細については、議論を参照してください。 </li></ol></li><li> （腸の構造の断面図のために）固定された腸のビブラトーム切片<ol><li>小さなプラスチック金型7％アガロース（10×10×15ミリメートル）に埋め込む腸とにアガロースブ​​ロックを許可する冷却して凝固。 </li><li>瞬間接着剤でビブラコレクションステージにプラスチック金型及びグルーアガロースブ​​ロックからアガロースブ​​ロックを削除します。 </li><li>氷冷1X DPBSで収集段階を埋める。 </li><li> 100〜150ミクロンの間の厚さでセクションをカット。厚い部分は、断面が深く可視化すること（セクション2.1.2で説明します）決済ソリューションを使用してください。 </li><li> 4℃での保存のために6ウェルプレートのウェル内に収集段階からビブラトーム切片を注ぐ。 </li></ol></li><li>固定、ビブラトーム切片の組織の免疫蛍光染色<ol><li> 1X DPBSで24ウェルプレートにウェル当たり5-12ビブラトームのセクションを配置します。 </li><li> 1X DPBSを削除し、ウェルあたり透過処理溶液500μlを加える。静かに、室温で25分間サンプルを揺する。 </li><li>透過処理した後、1×PBSでサンプルを3回洗浄する。 </li><li>ブロッキング溶液500μlに、少なくとも30分間のサンプルをブロックします。 </li><li>ブロックした後、電子メールブロッキング溶液で希釈した一次抗体を500μlとブロッキング溶液をXchangeは、4℃のCO / Nでサンプルを保つ。 注：凍結し、パラフィン切片上でうまく動作し、一次抗体希釈液は、通常、しかし、一般的に、このプロトコル（ 例えば、BrdU）のではうまく機能しない核抗原回復を必要とする抗体、あまりにビブラトーム切片上でうまく動作します。 </li><li>翌日、ブロッキング溶液で15分間、試料を毎回3回洗浄する。 </li><li>洗浄後、ブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を500μlを適用します。光から蛍光団を保護し、室温で2時間に45分のためのサンプルを揺するようにアルミホイルで24ウェルプレートを包みます。 </li><li> 15分ごとに1×PBSでサンプルを3回洗浄し、2.4節で説明したようにスライド上のビブラトーム切片をマウントします。 </li></ol></li><li>取付ビブラトーム切片<ol><li>ビブラトームダブルSTIの薄切りを切断して取り付けるためのスライドを準備するCKテープとスライドの長辺に沿ってそれらを配置する。 </li><li>慎重に1×100μlのPBSの低下をスライド上に両面テープの間に5-10ビブラトームセクションを配置。 </li><li>すべてのセクションを展開するとスライド全体で単一層にそれらを広げた。 </li><li>フラットに座ってからカバースリップを妨げる余分なアガロースまたは不均一なビットを削除します。 </li><li>慎重にビブラトーム切片の周囲から過剰1X PBSを吸収するために実験室組織を使用しています。 </li><li>ビブラトーム切片の上部に水性封入剤のドロップを追加し、その後カバースリップ。 </li><li>綿棒で塗布溶融しVALAPでスライド上にカバーグラスを密封。 </li><li>イメージ直立または倒立型共焦点顕微鏡のいずれかでビブラトーム切片。イメージングシステムの選択についての詳細は、説明を参照してください。 </li></ol></li></ol>全腸の3。ライブイメージング腸fetuseから収穫E12.5後のsは、そのままに接続された大網で、成功した上記のシステムを用いて、培養中の絨毛を開発しています。したがって、このエキソビボシステムは、経時的な形態形成の三次元ビューを再構成することができる現像腸の生のz断面画像の捕捉を可能にする。 <ol><li>ライブイメージングの設定<ol><li>細かいメッシュのスクリーンに個別のポリカーボネート膜を接着する瞬間接着剤を使用してください。これは直立共焦点顕微鏡の浸漬レンズ下の場所に腸を保持するための支持足場を提供します。ライブイメージング顕微鏡の選択についての詳細については、議論のセクションを参照してください。 </li><li>中央ウェルの培養プレートにメッシュスクリーンを配置します。 </li><li>ポリカーボネート膜上に解剖し、腸を置き、両端に瞬間接着剤を一滴加える。腸に固定するだけの十分な接着剤を使用してくださいではなく、コート、それ！ </li><li>ポリカーボネート以下のフェノールレッドを含まない培養培地を追加します。培養プレートの中央ウェル中の膜。 </li><li>湿度を提供するために、培養プレートの外縁に水を加える。 </li><li>イメージングしながら、腸の動きを制御するために、メディアの3ミリリットルの1×PBS中のキシラジンの5溶液：胎児の腸は、培養中の収縮の蠕動様の波を起こしているので、1を100μlを追加。この投与量は、絨毛の発達を損なうことなく、約8〜10時間、腸の動きを制御します。 </li><li>腸の横断ビューの場合は3〜4％アガロース溶液中でのライブ腸を埋め込み、ビブラトーム上の厚い部分（150〜500μm）をカット。切断された腸の剛性とアガロースの剛性を合わせて、経験的に発達段階を決定した。一般的に、3％アガロース溶液はE14.5よりも若い腸に適していますし、4％溶液腸E15-E16に適しています。 </li><li> （3.1.1項のように）メッシュスクリーンに貼付されたポリカーボネート膜にビブラトーム切片を接着し、セクション3.1.2-3.1.6で説明したように文化。 </li><li>調整可能なテーブル付きのアップライトスタンドに二光子共焦点蛍光顕微鏡（690-1,040 nmの励起レーザー）を使用したライブイメージングを実施する。 </li><li> GFPシグナルのための最高の解像度と深い浸透を提供するから900nmに同調二光子レーザー。イメージングながら、組織への損傷を低減します。また、可能な限り低い発光レーザのパワーを設定する組織損傷を減少させる。典型的には、二光子レーザーに12％の電力を使用して、GFPの良好な励起を得る。 </li></ol></li></ol>

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著者らには開示すべき金銭的紛争はない。

動的な性質と途上腸の複雑な組織の相互作用は、これらの形態形成イベントの完全な理解を持つように3次元可視化を必要とします。イメージング技術の進化により、能力が/開発の改善とそれに、器官形成時の空間的なコミュニケーションと相互作用の理解が大幅に強化されている詳細に絨毛の形態形成を調べた。 全体腸を培養するための別の方法も試験されているが、トランスウェルシステムは、より長い培養時間のために、通常のクラスタと絨毛パターニングを維持するための最も信頼性の高いままです。若い腸（E12.5-E15.5）の三次元培養システム（マトリゲルまたはコラーゲン）短い培養期間の井戸（未満24時間）動作しますが、腸蠕動様運動を受けているし、酵素や廃棄物を分泌始めたら内腔に、三次元の基板がうまくホールドアップしないでください。液体培養における腸sはまた、しかし、浮遊培養でのオリエンテーションのためのサポートや参照の欠如を開発するクラスターおよび絨毛の正常なパターンを変更するために表示されます。したがって、トランスウェルシステムは、クラスタパターニングおよび絨毛出現と成長を調べることが好ましい。 <p c...

各腸絨毛は、上皮表面層と間葉系コアの2つの主要な組織区画で構成されています。マウスの小腸は、内胚葉のシートが閉じて密封され、間葉系細胞3に囲まれた上皮の管を形成する胚の10日目に形成されます。この扁平な上皮管は急速な増殖を遂げ、長さと胴回りの両方で成長し、動的な細胞形状の変化を伴う劇的な再配列を経ます1。同時に、周囲の間葉も、血管神経叢の形成、平滑筋の分化、腸管ニューロンの動員など、多くの発生過程を経ます4。胚の14.5日目の近位小腸では、ヘッジホッグおよびPDGF応答性細胞の凝縮(クラスター)が上皮に隣接して形成され始めます2,5。間葉系クラスターの形成は、腸の長さに沿って広がり続け、胚の16.52までに小腸全体を覆います。間葉系クラスターが形成されると、クラスターに最も近い上皮細胞は細胞周期から後退し始めますが、他の上皮細胞は増殖し続けます。細胞周期から撤退した間葉系クラスターの真上にある細胞は、出現する絨毛が内腔に屈曲するにつれて形状を変え始めます。絨毛のさらなる成長は、部分的には、出現する絨毛間の上皮の継続的な増殖によって推進されます。間葉系クラスターは、成長中の絨毛の上皮にしっかりと付着したままで、さまざまなシグナル伝達分子を発現し続けます。絨毛の出現の波は、間葉系クラスターの形成に続いて小腸の長さに沿って伝播します。腸が成長を続け、絨毛間領域が出現する絨毛の間に広がると、新しい間葉系クラスターが絨毛上皮に隣接して形成され、さらに絨毛の出現と成長が続きます6。
上皮と間葉の同期発達は、絨毛の形態形成に不可欠です。シグナル伝達分子は、一方の層から他方の層に分泌され、受容体はシグナルメッセージを受信して伝達し、上皮と間葉の間の発達を調整します。間葉系クラスターはシグナル伝達センターとして働き、さまざまな発生モルフォゲンを発現します7-10。クラスターの形成またはパターンの混乱は、絨毛の出現とパターンの喪失をもたらします。PDGFシグナル伝達の阻害は、より少ないクラスターとより少ない絨毛をもたらし、形成されたそれらの絨毛は、異常なクラスター11に続いて変形する。ヘッジホッグシグナル伝達の喪失は、クラスター形成の完全な喪失と絨毛の出現の失敗をもたらします2,12。まとめると、これらのデータは、クラスターが絨毛上皮とその間葉系コアの発達を調整していることを示しています。
この全臓器培養システムを使用して、上皮間葉系クラスターのクロストークに関与するシグナル伝達を変更し、それらのシグナルが絨毛の形態形成における役割を決定することができます。2光子共焦点光学セクショニングと再構成により、クラスター形成と絨毛の出現を3次元で視覚化し、間葉系クラスターとその上にある上皮との間の空間的関係をよりよく理解することができます。培養システムを4次元に拡張することで、発育中のクラスターと絨毛のzスタックを経時的に捕捉し、これらの相互作用を観察することができます。最終的に、この方法で絨毛の発達を追跡し、シグナル伝達の変化に伴って発生する変化を観察する能力は、絨毛の形態形成における上皮間葉系相互作用の理解に革命をもたらすでしょう。

<table><tbody><tr><td>微細解剖鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>&nbsp;11254-20</td><td>2ペア</td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mmシャー</td>レ <td>ファルコン</td><td>&nbsp;</td><td></td>451007</tr><tr><td>トランズウェルプレート、24 mmインサート、8.0 mmポリカーボネートメンブレン</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>プレートあたり6</td></tr>インサート <tr><td>BGJb 培地</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>ペンストレプ (10,000U/ml ペニシリン; 10,000 mg/ml ストレプトマイシン)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp;15140</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A0278</td>は<td>5 mg / mlのストックを作り、フィルターをかけ、分注し、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>口ピペット(ドラモンド1-15インチ吸引チューブアセンブリ)</td><td>フィッシャー</td><td>&nbsp;21-180-10</td><td>アスピレーター アセンブリを取り外し、1,000 &micro と交換します。l ピペットチップは、6インチのガラスパスツールピペットを差し込むためのアダプターとして機能します。</td></tr><tr><td>6インチガラスパスツールピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブワールド</td><td>プレシジョンインスツルメンツ&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>プル・トゥ・ニードル</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td></td><td></td><td>1 x PBS、pH 7.3</td></tr><tr><td>培養プレート</td><td>ファルコン&nbsp;</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>金物店</td><td></td><td></td>での<td>ファインメッシュステンレス鋼スクリーン</td>の購入</tr>ポリ<tr><td>カーボネート膜</td><td>トーマス科学&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>あるいは、トランズウェル サポート</td></tr> インスタント<tr><td>接着剤</td><td>の購入 金物店</td><td></td><td></td>でのインスタント接着剤の購入</tr> できれば <tr><td>35 x 10 mm プレート</td><td>ファルコン&nbsp;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7%アガロース</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;A9414</td>は<td>、1x DPBSでw / vを準備し、ウォーターバス</td></tr><tr><td>minutienピン</td>ファイン<td>サイエンスツール&nbspに</td>溶解するために加熱します。<td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドフリー培地 (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BD</td><td>356231</td><td>基底膜マトリックス、成長因子減少、フェノールレッド</td></tr><tr><td>フリー3-4%アガロース</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A9414</td>は<td>、1x DPBSでw / vを準備し、水浴に溶解するために加熱します</td></tr><tr><td>固定腸のイメージング材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>/機器の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号コメント</td><td>/説明</td></tr><tr>VALAPを作るために使用される<td>薬局</td><td></td>での<td>ワセリン</td>の購入<td>:等量ワセリン、ラノリン、パラフィン</td></tr><tr><td>ラノリン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>L7387</td><td>VALAPの製造に使用:等量ワセリン、ラノリン、パラフィン</td></tr><tr><td>パラ</td><td>フィン Surgipath</td><td>39601006</td><td>VALAPの製造に使用:等量ワセリン、ラノリン、パラフィン</td></tr><tr><td>70%グリセロール、1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォーカスクリアおよびマウントクリア</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp;F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>画材店</td><td></td><td></td>での<td>モデリングクレイ</td>購入</tr><tr><td>両面テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿棒 綿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棒 プラスチック型 10mm x 10mm x 5 mm)</td><td>ティッシュテック&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラボワイ</td>プ<td>キンバリークラーク</td><td>34155</td><td>リントフリーデリケートタスクワイプ</td></tr><tr><td>Theilerステージングチャート&nbsp;</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ ダウンロード/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>ライカSP5X共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td>ライブイメージングの実施に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ライカDMI 6000スタンド&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td>ライブイメージングの実施に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>水性封入剤(Prolong Gold)</td><td>Molecular Probes&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>材料名/装置会社</td><td></td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>&nbsp;3524</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ&nbsp;</td>透過化溶液の製造に使用される<td>T-8787</td><td>:0.5% Triton X-100 in 1 x PBS</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td></td><td></td><td>ブロッキング溶液の製造に使用:4%ヤギ血清、0.1% Tween20 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;P9416</td><td></td></tr></tbody></table>型

マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

胎児の腸内のほとんどの形態形成のプロセスは、発達段階的な変化のスナップショットを提供し、固定した組織の薄い部分から推論されてきた。薄連続切片から三次元情報が原因完全連続切片を再構築し、連続切片上の組織の適切な向きを維持することの難しさを解釈するために挑戦することができます。グロッセらによる最近の知見。、2011腸1の現像絨毛の形態形成を理解する上で三次元情報の重要性を強調している。単独でラベルされた腸細胞の三次元再構成は、腸管上皮細胞の大部分が頂端および基底表面の両方に接触することを実証した。さらに、上皮の頂端表面でのアクチン細胞骨格の三次元再構成は、腸管腔が連続しており、二次管腔は、複数のアーチファクトであることが示されectioning。これら2点は、腸管上皮におけるinterkinetic核移動の実証とともに、以前に1思った層別化多列上皮としないように開発する腸上皮を定義しました。上皮三次元的に観察する能力は、この点を実証し、胎児の腸上皮形態形成を再定義する精液だった。多光子イメージング技術と三次元再構築ソフトウェアの進化により、無傷の、現像器官を視覚化する能力が急速に向上している。二光子励起は、高解像度の組織への損傷が少ない深い浸透を可能にする。二光子イメージングとウォルトンら全体の胎児のマウスの腸の3D再構成は、2012年には絨毛伸長2のパターンを定義することができました。ここでは、許可する絨毛およびその培養系の拡張のex vivoで開発を可能にする全器官培養系を記述する腸を三次元的にその開発中に撮像される。

このシステムは、薬理学的試薬または組換えタンパク質とシグナル伝達の操作を可能として、胎児腸の全体の外植片の培養は、腸の開発を調整シグナル伝達分子の位置、分布、および期間の分析が可能になります。トランスウェル培養系（ 図1Aは 、ウォルトンらから再生される。2012）2が組織上に薬物またはタンパク質浸したアガロースビーズを配置することを可能にし、それによってローカルシグナリング源を確立する気液界面（ 図1Bを提供）。 E18.5にE10の胚から採取された腸をトランスウェル上で培養中で生き残るためには、運動の蠕動様波を受ける。腸は、約10日間、またはおよそ陰窩形成が最初に観察され、P3、マウス発生段階に生き残るE13.5から文化に始まった。初期段階の腸が培養で生存しているが、腸が前に収穫漿膜は完全にその時までに、腸をカバーするために成長していないため、E12.5は、確実に可能性絨毛をemergeしないでください。間葉系クラスターは形成し、絨毛は腸内に出現し、長くし始める開発は少しウォルトンらから再生...

改良されたイメージング技術により、発生中の臓器の3次元イメージングが可能になりました。ここでは、マウス胎児の腸で発生中の絨毛をライブイメージングできる全臓器培養システムについて説明します。

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

この手順の全体的な目標は、マウス胚性腸の全臓器培養物をex vivoで増殖させ、細胞シグナル伝達経路の調節を可能にすることです。これは、まず胎児の12.5日目から18.5日の間に胎児からマウス腸を採取することによって達成されます。2番目のステップは、腸をトランズウェル培養またはライブイメージング培養プレートに入れることです。次に、細胞シグナル伝達経路または場所の薬理学的阻害剤で調製した培地で腸を治療します。aroは、腸の上で細胞シグナル伝達を変化させるために、組換えタンパク質を浸した速度です。最後のステップは、培養された腸を厚いビオーム切片またはホールマウントで画像化することです。最終的には、共焦点イメージングとそれに続く3次元再構成を使用して、細胞シグナル伝達経路の調節が絨毛形成中の組織層の発達にどのように影響したかを視覚化します。胚組織は非常にデリケートで、解剖や取り扱いには細心の注意が必要なため、この方法を視覚的に示しておくことが重要です。解剖の準備をするには、解剖ツールを70%エタノールに浸します。6ウェル培養プレートとBGJB培地を入れた10cmのシャーレを氷上に置きます。次に、安楽死させた胎児から腸を取り出します。それらを1つずつ1つのX-D-P-B-Sで解剖します。胃から脾臓を慎重に取り除き、次に胃と上部十二指腸から膵臓を取り除きます。その後、大網をできるだけ付着させたまま、腸がまっすぐになるのに十分なだけ接続部を分離して、静かに分離します。次に、BGJB培地が動作する10cmのペトリプレートにサンプルを置きます。次に、マウスピペットを使用して、腸片を培養プレートのトランズウェルに移します。トランズウェルの下からメディアを取り出します。次に、トランスの下に700マイクロリットルの治療培地を追加します。その後、300マイクロリットルの治療培地を腸に滴下し、トランズウェルに染み込ませます。処理媒体は、少なくとも1日1回、または処理試薬の半減期に応じてそれ以上の頻度で交換してください。あるいは、引っ張った毛細血管針付きのマウスピペットを使用して、アグロビーズを腸にそっと置きます。乱暴な取り扱いは腸を損傷し、負傷した領域の絨毛の発生を防ぐため、ビーズは細心の注意を払って配置してください。この手順では、腸を小さなプラスチック型に7%arosに埋め込み、arosブロックを冷まして固化させます。その後、プラスチック型からarosブロックを取り外します。アロスブロックをビブラムコレクションステージに瞬間接着剤で接着します。次に、収集ステージに氷冷したX-D-P-B-Sを入れます。切片を100〜150マイクロメートルの厚さでカットします。次に、収集段階からセクションを6ウェルプレートのウェルに移し、摂氏4度で保存します。取り付け用のスライドを準備するには、各スライドの長いスライドに沿って両面テープを貼ります。その上に 1 つの XPBS をドロップします。次に、スライドに5〜10個のセクションを慎重に配置します。すべてのセクションを展開し、1つのレイヤーに広げます。スライドを横切って。カバーの滑りが平らになるのを防ぐ余分なアロや不均一なビットをすべて取り除きます。ラボティッシュを慎重に使用して、切片の周囲から余分な1つのXPBSを吸収します。次に、切片の上に水性封入剤を滴下します。次に、カバースリップをその上に置き、溶かした蒸気でスライドに密封します。その後、直立または倒立共焦点顕微鏡でビオーム切片を画像化します。次に、瞬間接着剤を使用して、個々のポリカーボネートメンブレンを細かいメッシュスクリーンに接着します。メッシュスクリーンを培養プレートの中央ウェルに置きます。次に、解剖した腸をポリカーボネート膜に置き、両端に瞬間接着剤を一滴加えます。次に、フェノールレッドを含まない培地を、培養プレートの中央ウェルのポリカーボネート膜の下に加えます。培養プレートの外縁に水を加えて湿度を確保します。胎児の腸は文化の収縮の波のような蠕動運動を経るので、xylazineの解決の100マイクロリットルを版の中央の井戸の媒体の3ミリリットルに加えてイメージ投射しながら腸の動きを制御するため。直立したスタンドで2光子共焦点蛍光顕微鏡を使用してライブイメージングを行います。ここに示されているのは、本明細書のecatおよびdpiで染色された、新たに収穫されたE14、E15、およびE16十二指腸組織の断面である。この腸内セグメントはE14で収穫され、2日間培養されました。E 14では、モデル化されていない上皮はまだ疑似層化されていました。培養で2日後、VIIは見えますが、VIIに比べてわずかに遅れています。E 16では、E14十二指腸のpcam染色血管系の光学切片の3次元再構成を示し、この図は、抗体免疫蛍光染色したE 15.5 viome切片腸からの共焦点画像の3次元再構成を示しています。このビデオを見れば、胚組織を解剖する方法、腸を全臓器培養用に設定する方法、高品質の3次元イメージングのための組織の準備方法についてよく理解できるはずです。

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Research

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Biology

生物学

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マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

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