Name: マルチモーダル光学顕微鏡法カリビアン·リーフビルサンゴにポリープの組織形態と構造を明らかに (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶマルチモーダル光学顕微鏡法でカリビアンリーフビルドサンゴのポリープ組織形態と構造を明らかにする方法。蛍光顕微鏡とシリアルブロックフェイスイメージングを用いて、色素細胞と共生藻類の分布を三次元で可視化し、サンゴ礁保全に貢献する。

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私たちは、イリノイ大学アーバナシャンペーン校(UIUC)のゲノム生物学研究所の組織学者であるDonna Epps氏に、サンプル調製と切片化における彼女の有能な技術支援に感謝します。この研究は、Office of Naval Research(N00014-00-1-0609)からB.W. Foukeへの研究助成金によって支援されました。さらに、C.A.H. Millerは、UIUC地質学部Wanless Fellowship、UIUC地質学部レイトン基金、UIUC地質学部ロスコー・ジャクソンフィールドワーク基金から助成金を受けました。この原稿で提示されている解釈は著者のものであり、必ずしも助成機関の解釈を表すものではありません。また、キュラソー島のカリブ海生物多様性研究管理(Carmabi)研究所にも、サンゴ組織生検サンプルの収集における支援と協力に感謝します。IGBメディアコミュニケーションスペシャリストのクラウディア・ルッツ氏には、言語修正が可能な方に感謝します。

注：試薬シリアルブロックフェイスイメージングサンゴのサンプルのために準備する 1 Preinfiltrationワックス<ol><li>ガラスビーカー中でステアリンフレーク3.6gのメルト。ホットプレート（60〜70℃）でよく混ぜる。 </li><li>スーダンIVの400 mgの追加（ワックスバックグラウンド蛍光を最小限にするため）。よく混ぜ、赤い半透明の溶液が得られるまで待つ。 </li><li> 96ミリリットルホット溶融パラフィン（100％）を加え、よく混ぜる。 </li></ol> 1.2）埋め込みワックス<ol><li>ガラスビーカーにステアリンフレーク7.2gの溶融し、ホットプレート（60〜70℃）でよく混ぜる。 </li><li>スーダンIVの0.8グラムを追加します。よく混ぜ、赤い半透明の溶液が得られるまで待つ。 </li><li>パラフィン顆粒（162グラム）を追加し、パラフィンが完全に溶けるまで混ぜる。 </li><li>白い粒状VYBARの30グラムを加え、同じビーカーに完全に溶融。溶けたら、混ぜる。 </li><li>緩く蓋をガラスボトルを閉じます。 60℃の対流OVにガラス瓶を置きエンは、液体状態で成分を維持する。このオーブン内のすべての浸潤を実施する。 </li><li>各100mlの二枚のガラスボトルに200mlの赤いワックスの総容量を分割します。最終的な埋め込みのために1浸潤分量やその他を使用してください。 </li></ol> 1.3）シリアルブロックフェイスイメージング用埋め込みコーラル組織<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（3×5分）でサンゴのポリープフィールド（SIビデオ1）に回収し、（パラホルムアルデヒド中で4〜5℃で3〜6ヶ月）を記憶を洗浄したときに画像化することができる状態に脱灰。 24時間以上のポリープは、 炭酸カルシウムを全く欠いているようになるまでExCal溶液中のポリープを脱灰。サンプルを脱水する1倍キシレン代替が続く、25、50、75、および100％エタノール系に単一のブロックなど、いくつかの脱灰サンゴのポリープをインキュベートする。 </li><li> 100％のキシレン代替品を含有する予熱した65℃のオーブン内で処理ポリープを置きます。チャンギ二回30分間インキュベートする新鮮な溶液にngの。ポリープの上部が下方に面しており、上面はできるだけ平坦であるような方法で、ポリープを方向付ける。 </li><li> 1,1：1,1：2の溶液を作る2キシレン代用し、50mlファルコンチューブ内preinfiltrationワックス（ステップ1.1）。 </li><li> 30〜60分ごとに時間を100％のpreinfiltrationワックス中3倍インキュベートしpreinfiltrationワックスのこれら三つの濃度を増加させ、サンゴのポリープをインキュベートする。 </li><li>注：試料の厚さに応じて、ステップは1.3.1-1.3.5より長い期間を増加させることができる。 </li><li> 100％preinfiltrationワックス中3倍のインキュベーションの後（ステップ1.2.6を参照）ワックスを埋め込むにサンプルを移動します。 </li><li> 30分後に埋め込むワックスを削除します。新鮮な埋め込みワックスで交換して、65℃で4時間の最小インキュベーションを続ける。 </li></ol> 1.4）赤ワックスに埋め込み<ol><li> （ステンレス白ろうが配置されるトレイとサムの上にブロックを撮影PLE）が配置されます。一度ワックスに埋め込ま埋め込む赤いワックスが不透明であるように、サンプルの位置が不可視になるために必要です。 </li><li>金型を埋め込む新しい予熱したステンレス鋼を中心に高融点ワックスの小滴を置き、冷却します。ステップ1.2.6で述べたように、第2の容器から新鮮に溶け埋め込むワックスを少量を注ぐ。 </li><li>ワックスは、プラスチック金型の表面まで来るように位置白蝋ドットの上に迅速に下向きにサンゴポリープは、次にステンレス鋼トレイにプラスチック製の試料ホルダを配置し、さらに埋め込みワックスを注ぐ。 </li><li> 65℃のオーブンの中から全体のセットアップを取り、ワックスが完全に硬化するまで、それがベンチや冷たい表面上で冷まします。 </li><li>これは一日か二日に6時間までかかる場合があります。長期保存のため、光から保護し、4℃で冷蔵庫内で乾燥さのブロックを、配置する。 </li></ol> 1.5）シリアルブロックフェイスのセットアップでセクショニング<ol><li> Trはブロックイムとミクロトームを使用して1μmのセクションをカット。彼らが粉のようになるようにセクションを収集することはありません。私たちが唯一のブロック面を画像化していることを覚えておいてください。白ろうが消え始めるとサンプルが表示されます。 </li><li>サンプルのセクションが削除されるたびに含まれている滑らかなブロック面の画像を取り込む。サンゴポリープはSIのビデオ2のように消えるまで続けます。 </li><li>録音/色素胞/サンゴポリープの自家蛍光をピックアップして、FITC蛍光フィルターを使用して白黒カメラで画像をキャプチャします。それぞれの種からの画像3-4脱灰のコアを。 </li></ol>二光子蛍光顕微鏡下では2イメージングサンゴ<ol><li>とすぐに、彼らは水の下で収穫されるように、それぞれがコレクション（海岸）の部位で4％パラホルムアルデヒド中で、直径約​​インチの周り10〜12ポリープを含む、サンゴポリープコアを修正しました。 </li><li>イメージングまで、4℃でサンプルを保管してください。洗浄されたコアは、目に配置されます逆さまにカバーガラスボトムディッシュでの電子と同じ溶液（0.17ミリメートルの厚さ）。 </li><li> 10X（0.3 NA）対物レンズを用いて780nmで励起、画像2の異なる倍率（デジタルズーム）で3〜4ポリープで2光子レーザーを使用した。形状および高さは試料（1〜2 mm）とし、撮像深度との間で変化するサンゴポリープはまた、結像対物レンズの作動距離によって制限される。 </li><li> XYでの焦点面あたりの画像と50〜100の画像は/ 5,000〜10,000の画像を中心に、合計10または20ミクロン間隔でのz軸を約25〜100（5×5または10×10のタイル）を収集するタイルスキャンモードを使用してくださいサンゴポリープ。 </li><li>コアとサンゴ種を表すためのイメージ三から四ポリープエリア。注：画像取得時間は2-5時間/ポリープエリアとの間で変化する。 </li><li> LSM 5は、3D画像解析およびレンダリングソフトウェアで、3Dレンダリングなどのシステムのハードディスクに、生データ形式ですべての画像を保存してください。 </li></ol> 3次元ボリュームレンダリングとVisualizatioSBFIのnおよび二光子分光蛍光データ<ol><li>収集ソフトウェア（8ビットフォーマットでファイルを保存することにより、ファイルサイズを小さくする）プログラム正方形トリミングツールを使用して、単一のポリープに着目してファイルサイズを小さくし、単一のTIFFファイルとしてコンパイルする2Dデータをトリミング。 </li><li> Imarisがボリュームアルゴリズムの下にモジュールを突破プログラム内SBFIデータの組み立てファイル（ステップ1.5.1収集）または（ステップ2.1.4収集）2光子光学切片のタイル張りの複数のz-スタックを開きます。 </li><li>影の投影を使用して3DでレンダリングSBFIデータを投影。ボクセルは、固体表面パターン（SIビデオ3）を作成するために閾値処理された等値面モードを作成します。 </li><li>サンゴの3D構造と形状を明らかにするためにxz平面、XYでのクリッピング平面のアルゴリズムを使用して3D突起とyz平面の直交モードを可視化する。 </li><li>同じImarisプログラム（SI Viには 、キーフレームアニメーションモジュールを使用して予測をアニメーションDEOS 3-7）。 </li><li> 5％の圧縮でビデオファイルを生成し、ボリュームを使用してのAVI形式のムービークリップを生成する（SIビデオ4および6）、3Dおよび等値面のモダリティ（SIビデオ5,7）。 </li></ol>

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著者は利益相反がないことを宣言します。

サンゴ礁研究は同時物理的、化学的、および海洋環境で動作する生物学的現象の分析を含む、高度に学際的な研究努力である。複雑なサンゴ礁生態系の研究は、そのための最良のコンテキストフレームワーク（ 図10）「10の累乗」で終了する。このグラフィックコンパイルはサンゴ生態系が空間次元（10 -9 5〜10メートル）の広い範囲をカバーすることを示している。また、この演習はgeobiologicalがフィールドを結合し、実験室分析するために必要なブリッジである1ミリメートル-1cmの中間の長さスケールで解析することを示している。テンフレームワークのこのパワーズは、実験のためのコンテキストである分析し、モデリング、物理的、化学的合成、およびキュラソーサンゴ礁生態系を制御する生物学的パラメーター。 本研究は、完全に統合されたスイートoを適用する最初のものですF、FM、SBFIおよびCLSM技術が増加し、水深に見かけ上健康なサンゴの反応を追跡する。画像全体の組織または厚い生物学的サンプルが利用可能な光学顕微鏡ツールは、吸収、散乱、および他の現象を...

地球温暖化および付随する環境変化を直接、熱帯の海洋サンゴ1-4の健康と分布に影響を与えている。複数の影響は、サンゴの白化や感染症5-6の出現など、観察されています。しかし、これらの環境の脅威に対する将来のサンゴ応答のより正確な予測が組織学的「ベースライン」は、「外見上健康」サンゴのための組織形態や細胞組成および分布を定義する、確立されることが必要になります。ターンでは、サンゴはその後、定量的に比較することができ、「影響を受ける」。 「健康な応答」、環境勾配を越え測ることができるようにさらに、このベースラインは、環境条件の多様な条件下で明らかに健康なサンゴのために確立されるべきである。このベースラインを確立に向けた最初のステップとして、高解像度の3D研究がどのように明らかに健康なサンゴのポリープ組織から行われてきた形態および細胞組成は、太陽光の放射照度での水深の増加（WD）及び添付減少に応答します。結果は、サンゴ適応のより包括的なメカニズムの理解を確立すること、ならびにサンゴ共生生物の進化への洞察と集光の増強を得るために使用することができる。 ストーニーサンゴ（ イシサンゴ ） をまとめサンゴは 7-10 holobiontと呼ばれる他の微生物の複雑な集合体にホストを果たしている植民地の海洋無脊椎動物の動物である。本研究で行わ研究では、同時に、組織の顔料および明らかに健康なホストサンゴの共生藻の高まり水深での変更を追跡するために、最先端のイメージング技術のスイートを使用しようとしています。これはサンゴょんの指標として明らかに健康なサンゴや行為に対して海底地形勾配を越え必要な比較の組織細胞「ベースライン」を確立しますLTH 10。 胞と呼ばれるサンゴ顔料は、吸収反映し、散乱、屈折、回折、またはその他入射太陽放射線11に干渉するように作用する。褐虫藻-色素胞内共生関係は、サンゴの動物12のための戦略的に有利な光捕集最適化と骨格成長戦略だけでなく、栄養の可塑性（栄養要求から従属栄養に前後送り戦略をシフト）の共進化を可能にした。 キュラソー南部のカリブ海の島国（オランダ領アンティル諸島の旧一部）アルバ·ラBlanquilla列島（ 図1A）トレンド東西以内に約65キロ北のベネズエラにある。キュラソーの70キロ長い南海岸は、連続モダンで新世-鮮新-更新世、完新世の古代フリンジサンゴ礁管13,14が含まれています。キュラソーで毎年恒例のSST平均は約3℃ANを変えるnually、27.5±0.5ºC（NOAA水温データセット2000-2010年）の年平均気温と1月下旬に26℃の最小値から9月上旬に29℃の最高に及ぶ。それは、以前はよく研究されてとしているため、キュラソー（ 図1A）の北西端の近くに横たわって、サンプリングのために選択されたプラヤカルキでサンゴ礁（12°22&#39;31.63 &quot;N、69°09&#39;29.62&quot; W）この場所での海洋生態系は、新鮮な非汚染海水7,15-19を浴びている。 。二つの密接に関連サンゴサンゴ種、 結核annularisとM faveolataは 、この研究での実験や分析のために選択したそれぞれの種のため、（1）棚ブレークとに関してサンゴ礁管に展示明確に異なるとオーバーラップしない海底地形分布関連した炭酸塩堆積堆積環境（M. annularis範囲= 0〜10メートルWD、M. faveolata範囲= 10〜20メートルWD 20; 図1B、2A、および2B）。 （2）カリブ海21全体で共通のサンゴ礁のフレームワークビルダーです。及び（3）よく研究された生態学的、生理学的、および進化的関係22を有している。 本研究のフィールドのサンプリングがオフショアキュラソープラヤカルキの標準スキューバダイビング技術を用いて行った。浅い対深海海底地形のトランセクトは棚ブレークオーバー、及び深海フォアサンゴ礁環境に、棚に偶然出会ったことが設立されました。 （1）3の個別Mの〜1メートル、直径サンゴヘッド：どうやら、健康なサンゴヘッドがその後を含め、この海底地形トランセクトに沿ってサンプリングのために同定された5メートルの水の深さ（WD）にあったそのすべてがannularis; Mの（2）は、3つの個別の〜1メートル、直径珊瑚faveolataは 、そのすべてが12メートルWDにあった。光合成有効放​​射（PAR）は、33から36までパーセントのPとして測定した10メートルWDで5メートル、WDと百分の18から22までの額面でのAR。 SSTは5メートルと12メートルの両方の水の深さで26℃のときのサンプリング1月に実施した。これらの6つのサンゴヘッドのそれぞれは、同等の空間的位置（6半球状のサンゴヘッドのそれぞれにすなわち 、約45°北緯）で三重にサンプリングした。各個別のサンプルを洗浄アーチパンチで採取した直径2.5cmサンゴ組織スケルトンコア生検で構成されていた。三サンゴ組織の骨格の生検は、サンゴのヘッドのそれぞれから手袋をはめた手で、標準的なスキューバでサンプリングされた（9 Mから12メートルのWDでのM. faveolataから5メートルWDと9位のコロニーをannularis）。直ちに深さで収集すると、各生検コアサンプルを密閉スクリュートップ、無菌の50mlポリプロピレン遠心管に入れ、表面に戻った。海水は、各遠心分離管からデカントし、各コア生検は、その後、浸漬保存し、4％パラホルムアルデヒド中で搬送した。 23-30無傷の骨を、全脳および全心臓、ヒト組織を含む、生物学的サンプルの広い範囲で無傷のマウス胚、ゼブラフィッシュ胚および動物試料の複数のタイプを行っていた。これらの研究の大部分は、蛍光または明視野いずれかの技術を有する光/光顕微鏡を利用した。しかし、研究は、過去31における走査型電子シリアルブロック顔画像を用いた超高倍率で行われている。本研究では、修飾SBFIプロトコルがために開発された初めてサンゴに適用した。 M.ので、 annularisとM. faveolataサンゴのポリープは、厚さ1〜2mmであり、日常的光顕微鏡技術のいずれも、サンゴのポリープ組織の厚さ全体を貫通することが可能でないであろう。そこで、具体的にはサンゴのサンプルのために設計されSBFI試料調製プロトコルを有している。さらに、当社は、カスタム実体顕微鏡ホルダーを設計したxおよびyの両方向に移動するように電動化されている。この装置ではなく、顕微鏡の前に定期的なミクロトームを使用してセクションを集めるよりも、サンプルのブロック面の画像を取ります。また、サンゴの組織の厚さ全体にわたってイメージに同じサンゴのポリープを別の非線形光学二光子顕微鏡技術を導入しました。これは、脱灰および試料調製（脱水）および処理プロトコルによって誘導され得る組織形態および量（収縮）の変化の可能性の点でSBFIによって課される制限を克服する。さらに、サンゴからの発光プロファイルは、スペクトル的に色素胞と褐虫藻の光合成の間にそれらのピークの排出量および変形を識別するために解決されました。これらの結果は、使用される方法の文脈及び取得時間に関して各自の長所、分析時間、とstrを損なうことなく、微細な構造の詳細を解決する能力で評価したサンゴ組織のuctural整合性。

<table><tbody>自然の生息地アーチパンチ<tr><td>コアリングデバイス</td><td>CSオズボーンと会社</td><td>番号149</td><td>から</td></tr>サンゴ<tr><td>組織スケルトン</td><td></td><td></td><td>2.5cm生</td></tr>検パラ<tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>RT 15700</td><td>16%事前に希釈された</td></tr><tr><td>組織/セーフクリアII</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>RT64111-04</td><td>キシレンの非毒性の代替品、脱水および脱パラフィン化</td></tr><tr><td>キシレンとエタノール</td><td>フィッシャー科学的な</td><td></td><td>脱水</td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>リチャード・アレン科学</td><td>的なタイプH REF 8338</td>浸透<td>溶液</td></tr><tr><td>Vybar</td><td>赤いワックス</td>の<td>キャンドルメーカー</td><td></td>コンポーネント</tr><tr><td>ステアリン</td><td>赤いワックス</td>の<td>キャンドルメーカー</td><td></td>コンポーネント</tr><tr><td>スーダンIV</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S667-25</td><td>赤いワックス不透明な背景</td></tr><tr><td>小麦胚芽凝集素(WGA)</td><td>Life Technologies</td><td>W32466ラベリング</td><td>用&nbsp;サンゴ粘液</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36095</td><td>色あせ防止封入剤</td></tr><tr><td>フルオロディッシュ</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD-35-100</td><td>2光子イメージング用</td></tr><tr><td>XYモーター、ドライバー、コントローラー</td><td>Lin Engineering</td><td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td><td>XY Translational Movement</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>コーニング</td><td>DC-220</td><td>すべてのワックス</td></tr><tr><td>を溶かす対流式オーブン</td><td>ヤマト</td><td>DX-600</td><td>浸潤・包埋</td></tr><tr><td>組織処理装置</td><td>ライカ</td><td>ASP 300</td><td>脱水・浸潤</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2055</td><td>ディスポーザブルナイフ</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>ステレオルマー V 12</td><td>1.5x (30 mm WD) 対物</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡 アポトーム付き</td><td>カールツァイス</td><td>アクシオーバート M 200,ApoTome I システム</td><td>ポリープの薄い部分のイメージング: Zooxanthellae</td></tr><tr><td>Axiocam カメラ</td><td>Carl Zeiss</td><td>MRm</td><td>モノクロカメラ 1388x1040 ピクセル</td></tr><tr><td>Axiovision ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss</td><td>バージョン 4.8</td><td>画像取得プログラム</td></tr><tr><td>Two-Photon Laser</td><td>Spectraphysics</td><td>Maitai eHP, pulsed laser (70 fs)</td><td>With DeepSee module</td></tr><tr><td>レーザー走査顕微鏡</td><td>カール・ツァイス</td><td>LSM 710 スペクトル検出器付き</td><td>34チャンネルPMT検出</td></tr><tr><td>Zenソフトウェア</td><td>Carl Zeiss</td><td>2010以降</td><td>2光子およびスペクトル画像取得用</td></tr><tr><td>Imaris Suite Software</td><td>Bitplane, Inc.,</td><td>Version 7.0 or above</td><td>3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization</td></tr></tbody></table>

マルチモーダル光学顕微鏡法カリビアン·リーフビルサンゴにポリープの組織形態と構造を明らかに

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

イメージング技術の統合スイートは、カリブ海造礁サンゴMontastraeaのannularisおよびMを含む三次元（3D）形態およびポリープ組織の細胞構造を決定するために適用されているfaveolata。これらのアプローチは、蛍光顕微鏡（FM）、シリアルブロック面イメージング（SBFI）、および二光子共焦点レーザー走査顕微鏡（TPLSM）が挙げられる。 SBFIは、物理的なセクショニング後に深部組織イメージングを提供します。それ以上2mmの組織深さに組織表面テクスチャと3D可視化を詳述する。組織細胞構造の相補FMとTPLSM収率は、超高解像度の画像。結果は、きた：（1）個別のサンゴのポリープの外壁に、以前に報告されていない葉状組織形態を特定し、（2）色素胞および藻類様渦鞭毛藻褐虫藻の内部共生の3次元分布と組織の密度の第1面のマップを作成しました。分光吸収エンドウ500 nmおよび675 nmでksとは、それぞれ、ことを示唆しているM. annularisとM. faveolataはクロロフィル色素胞と同様のタイプが含まれています。しかし、M. annularisとM.組織密度及びこれらの重要な細胞成分の3次元分布に有意な相違を示すfaveolata。イメージング方法に焦点を当てこの研究は、SBFIを脱灰サンゴ組織の大ミリメートル規模サンプルの分析に非常に有用であることを示す。無料のFMおよびTPLSMはnondecalcifiedサンゴの組織試料中の細胞分布と密度の微妙なサブミリ規模な変更を明らかにした。 TPLSM技術が得られる：（1）低侵襲性試料調製、（2）優れた光学セクショニング能、及び（3）最小の光吸収及び散乱が、依然として深部組織のイメージングを可能にしつつ。

（具体的には、本研究のために製造され、 図3）、カスタム設計されたSBFI装置は、Mの外側表面の質感と形態の最初の詳細な3Dデジタル標高地図（DEMの）を生じたannularisとM. faveolatureサンゴのポリープ（ 図4とSIビデオ1-2）。これは同心円状に各ポリープ（ 図4B、4D、および4E）の中心から外側に放射するサンゴの組織の以前に未記載積み重ねローブの画像が得られた。これらのローブが最外周と最標高ローブは、最終的に合成し、ポリープの間で共肉組織との合併で、組織で覆われた一次および二次骨格セプタムの最上尾根に沿って積層されている。 3Dポリープ形状と関連したローブが十分に高温浸潤および包埋のいくつかのステップを経たサンゴ組織試料にもかかわらず、保存した。 additio黒色各試料のコントラストを最大にし、信号対雑音比を増加させるのに役立ったとスーダン染料のnが成功し、不透明なバックグラウンドをマスクする。 3次元直交平面図は、z...

イメージング技術の統合スイートは、カリブ海サンゴMontastraeaのannularis及びM.におけるポリープの形態および組織構造を決定するために適用されているfaveolata。蛍光、シリアルブロック面、及び二光子共焦点レーザー走査顕微鏡は、葉状構造、ポリープの壁、推定色素胞および藻密度および分布を同定した。

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

次の実験の全体的な目標は、厚さ1〜2ミリメートルのサンゴポリープを3Dで画像化して、微細構造、サンゴの色素とその局在を理解することです。これは、まずサンプルをワックスに埋め込み、次にミクロトームを使用してサンプルを1ミクロンのセクションに切断することで達成されます。次に、カスタム設計のシリアルブロックフェイス技術を使用して、サンゴのポリープを画像化し、3D画像を再構築します。複数の2D画像を使用して、サンゴ組織の構造的完全性を損なうことなく、サンゴ組織の微細な構造詳細を解像する技術の能力を示す結果が得られます。手順のデモンストレーション。今日は、私の研究グループの共同研究者であるMaunde Siva博士の第一人者です。プレフィルトレーションワックスを調製するには、ホットプレート上のガラスビーカーでフレークに3.6グラムのステアを溶かします。次に、400ミリグラムのスーダンを追加します。ワックスバックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために、よく混合し、赤い半透明の溶液が得られるまで待ちます。次に、81グラムのパラフィンを加えてよく混ぜます。続いて、15グラムの白い粒状のVIバーを追加し、同じビーカーで完全に溶かします。溶かしたら、再度混ぜて完全に混合したワックス溶液を得ます。次に、混合物をガラス瓶に加え、蓋でゆるく閉じます。ガラス瓶を摂氏60度の対流式オーブンに入れて、材料を液体状態に保ち、すべての浸透が行われるようにします。この溶液は200ミリリットルにすることができ、2つの100ミリリットルボトルに分割することができます。1つは浸透用、もう1つはカリブ海のサンゴ礁形成サンゴのサンプルをAUから収集し、野外でパラホルムアルデヒドに固定しました。SBFI用のサンゴ組織を埋め込むには、まず野外で採取したサンゴポリープを洗浄し、パラホルムアルデヒドで摂氏4度で保存します。その後、画像化する準備ができたら、PB S3で毎回5分間洗浄します。ポリープをex Cal 2溶液で24時間、またはポリープに炭酸カルシウムが全くなくなるまで脱灰します。いくつかの脱灰サンゴポリープを、25、50、75、および100%エタノールシリーズの1つのブロックとしてインキュベートし、その後に1つのxキシレンをインキュベートします。各セッションで30分間代用して、サンプルを脱水します。次に、加工したポリープを100%キシレンに入れます。摂氏65度のオーブンで30分間代用します。その後、新鮮な溶液と交換し、さらに30分間インキュベートします。上部を下に向けて、表面をできるだけ平らにしてポリープを向けます。2対1、1対1、1対2の解決策を作成します。キシレン代替品およびプレろ過ワックス。50ミリリットルのファルコンチューブで、これらの3つの増加する濃度のプレフィルトレーションワックスでサンゴポリープをインキュベートし、続いて100%プレフィルトレーションワックスで毎回30分から1時間インキュベーションします。次に、サンプルを埋め込みワックスに移します。30分後に埋め込みワックスを取り外し、次に新しい埋め込みワックスと交換し、摂氏65度で最低4時間インキュベーションを続けます。その後、ブロックを撮影します。これは、ワックスに埋め込まれると、埋め込まれた赤いワックスが不透明であるため、サンプルの位置が見えなくなるために必要です。次に、予熱した新しいステンレス鋼の埋め込み型の周りに高融点ワックスの小さな滴を置き、冷まします。2番目のアリコートから少量の溶かしたばかりの寝具用ワックスを注ぎ、白いワックスドットの上に下向きのサンゴポリープをすばやく配置します。次に、プラスチック製のサンプルホルダーをステンレス製のトレイに置き、ワックスがプラスチック金型の表面に来るように、さらに埋め込みワックスを注ぎます。次に、セットアップ全体を摂氏65度のオーブンから取り出し、ワックスが完全に固まるまでベンチまたは涼しい表面で冷まします。その後、乾燥させたブロックを摂氏4度の冷蔵庫に入れ、光から保護して長期保存し、ブロックを切断します。まず、トリミングして1ミクロンの切片を切り取ります。ミクロトームを使用して、サンプルを含む滑らかなブロック面の画像をキャプチャします。いつも。切片を取り除くと、白いワックスが消え始めるとサンプルが表示されます。次に、適性のある蛍光フィルターを使用してモノクロカメラで画像をキャプチャーし、各サンプルから3〜4個の脱灰コアである発色団またはサンゴポリープ画像の自家蛍光をピックアップします。2光子蛍光イメージングを行うには、洗浄したサンゴポリープのコアを4%パラホルムアルデヒドに逆さまに、780ナノメートルの2光子レーザーを使用して、10倍対物レンズを使用して2つの異なる倍率で3〜4ポリープの画像画像を使用して、覆われたガラス底皿に逆さまに置きます。次に、タイルスキャンモードを使用して、XYの焦点面ごとに約25〜100枚の画像を10ミクロンまたは20ミクロン間隔で収集します。次に、10ミクロンまたは20ミクロンの間隔でZ軸を介して50〜100枚の画像を収集します。これは、サンゴポリープごとに合計で約5,000〜10,000枚の画像になります。その画像の後に、コアとサンゴの種を表す3〜4つのポリープ領域。次に、すべての画像を生データ形式でシステムのハードディスクに保存します。この手順では、正方形のトリミングツールを使用して 1 つのポリープに焦点を絞って 2D データをトリミングしてファイル サイズを縮小し、1 つの TIF ファイルとしてコンパイルします。取得ソフトウェアで。SBFIデータのアセンブルファイル、またはボリュームアルゴリズムプロジェクトのEMERISサーパスプログラムモジュールで2つの光子光学セクションのタイル化された複数のZスタックを開き、SBFIデータを3Dでレンダリングします。シャドウ投影を使用して、ボクセルがしきい値である ISOSURFACE モードを作成し、ソリッド サーフェス パターンを作成します。XY xzおよびYZ直交モードでクリッピングプレーンアルゴリズムを使用して3D投影を視覚化し、サンゴの3D構造と形状を明らかにします。次に、キーフレームアニメーションモジュールを使用してプロジェクションをアニメーション化します。同じerrisプログラムで、5%の圧縮率でビデオファイルを生成し、ボリューム3Dおよび等値面モダリティを使用してVI形式でムービークリップを生成します。これは、M Anis と M fa Lata のサンゴポリープの 2 つの光子蛍光 3D 画像です。これらの2つの画像は、450〜700ナノメートルで収集された光信号で2つの光子レーザーの780ナノメートル励起を使用して、成分のスペクトル分離なしでキャプチャされ、これらの2つの画像は同じ励起で収集されましたが、2つの光マルチプライドメインチューブ検出器を同時に使用して2つのコンポーネントからデータを収集しました。 1つは500〜550ナノメートル、もう1つは650〜720ナノメートルです。これらは深度コーティングされた画像です。赤は 2D で最も浅いコンポーネントで、青は最も深いコンポーネントです。はい。この手順を試行する際には、赤いワックスに埋め込まれたサンプルを適切に準備することを覚えておくことが重要です。シリアルブロックフェイスイメージングと2フィートオン蛍光顕微鏡の組み合わせにより、さまざまなレンズスケールでサンゴの色素沈着と細胞構造の分析が可能になります。このビデオを見た後、サンゴ礁形成サンゴとそのスペクトル特性を3次元で扱い、画像化する方法を十分に理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Environment

環境

表在性の組織画像データとヘモグロビン濃度、メラニン濃度、酸素飽和度などの組織生理学的パラメータを同時登録できるマルチモーダルマイクロ内視鏡の組み立てと使用について説明しています。この手法は、組織の構造と灌流の評価に役立ち、研究者の個々のニーズに合わせて最適化できます。...

マルチモーダルイメージングおよび非侵襲のための分光繊維束Microendoscopyプラットフォーム、<em&gt;インビボ</em&gt;組織分析

私たちは、チューブワーム、Hydroides...

マリンTubewormでライブ光学および電子顕微鏡技術を用いた石灰化イベントのキャラクタリゼーション

サンゴは、人間と海洋生物の両方にとって重要な生物多様性生態系を作り出します。しかし、多くのサンゴ細胞の可能性と機能をまだ理解していません。ここでは、石のサンゴ細胞集団の単離、標識、分離のために開発されたプロトコルを紹介する。...

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

ここでは、生きたマウス眼球表面イメージング用の多光子顕微鏡プラットフォームを紹介します。蛍光トランスジェニックマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維および毛細血管を眼表面内で可視化します。コラーゲン構造に由来する非線形第二高調波生成信号は、間質アーキテクチャにラベルフリーイメージングを提供します。...

マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

ポリープ救済は、急性ストレスによって誘発されるプロセスであり、サンゴポリープがコロニーに接続している組織を消化し、そこから剥離して個体として生きる。本プロトコルは、ハイパー生理食塩水またはカルシウムフリー海水処理を用いた救済によってサンゴのマイクロプロパゲーションを誘導する方法を記載している。...

サンゴのコロニーでポリープ救済を誘導して、実験室での実験的使用のための個別化されたマイクロ増殖物を得る

コーラルアークと呼ばれる係留された水中測地線構造は、沖合を含む以前は機能しなかった地域でサンゴ礁コミュニティを構築、監視、および混乱させるために使用できる、モジュール式でスケーラブルで垂直方向に調整可能な研究プラットフォームを提供します。...

サンゴ礁の箱舟:サンゴ礁のコミュニティを組み立てるための その場 のメソコスムとツールキット

ここでは、ガスクロマトグラフィー質量分析のために、サンゴのホロビオントからの極性および半極性代謝産物の抽出と調製、ならびに分離されたサンゴの宿主組織とSymbiodiniaceae細胞分画を紹介します。...

ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づくハードコーラル試料のターゲットメタボロミクス

ここでは、水中写真測量データを収集および処理するためのプロトコルを示します。これには、大幅に簡素化され、完全に自動化された画像処理パイプラインが含まれており、ジオリファレンスされ、時系列に整合した出力が生成され、生態学的データの抽出、分析、およびアプリケーションの準備が整います。...

Reefshape:底生生物の生息地モニタリングのための時系列水中写真測量データの効率的な収集と自動処理のためのシステム

このプロトコルは、サンゴ礁コミュニティの構造的複雑さ、コミュニティ構成、および人口統計の指標を抽出するために使用される4段階の大面積イメージング調査方法論をカバーしています。収集された画像の品質およびソース画像への統合アクセスは、プロトコルの各ステップ内で優先順位が付けられます。...

大面積イメージングによる水中環境の構造・組成・変化の測定

ラベルフリーの光学イメージングモダリティを組み合わせたマルチモーダルプラットフォームを利用して、細胞のダイナミクスと代謝を視覚化および定量化するためのプロトコルを開発しました。多光子蛍光、第2高調波発生、および誘導ラマン散乱顕微鏡によるイメージングを通じて、細胞および分子環境の全体像を生成することができます。...

細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

骨再生をさまざまな階層レベルで評価するためのプロトコルを提案します。このマルチモーダル手法により、異なる長さスケールでの構造解析が可能となり、試料準備の課題に効果的に対処できます。また、骨再生促進におけるバイオマテリアルの効果を評価する信頼性の高いワークフローも提供しています。...

骨再生と足場性能を評価するマルチモーダルアプローチ

学ぶマルチモーダル光学顕微鏡法でカリビアンリーフビルドサンゴのポリープ組織形態と構造を明らかにする方法。蛍光顕微鏡とシリアルブロックフェイスイメージングを用いて、色素細胞と共生藻類の分布を三次元で可視化し、サンゴ礁保全に貢献する。

マルチモーダル光学顕微鏡法カリビアン·リーフビルサンゴにポリープの組織形態と構造を明らかに

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