Name: 角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶマイクロ光造形とエレクトロスピニングを組み合わせた角膜再生用PLGA膜の製造法。幹細胞ニッチを模した微細構造を持つ生分解性スカフォールドの作製と細胞挙動解析への応用を解説する。

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私たちは、インドのウェルカム・トラスト・アフォーダブル・ヘルスケアからの資金提供と、イリダ・オルテガのEPSRCランドスケープ・フェローシップ、そしてエレクトロスピニング・カンパニー・リミテッドからの寄付に感謝します。

倫理に関する声明：本研究​​で用いた目が動物研究上の開放性に関する宣言に従って使用した。 Micropockets装備PLGA生分解性膜の作製1。 <ol><li>リング足場はマイクロ光とエレクトロスピニング技術31の組み合わせによって作成された。本質的には、プロセスは、マイクロ光と、（ii）基礎となるPEGDA構造の再生のためのテンプレートの上に電界紡糸（この場合、微細加工されたリング）によってPEGDAテンプレート2部（i）の作成に要約することができる。これらの2つのステップは（ 図1および2）以下に詳細に説明する。 <ol><li>マイクロ光によるPEGDAテンプレートの作製（microSL） <ol><li>第一の層（L1）構造のベースと馬蹄Morphologiの6 micropocketsを提示する第二の層（L2）であると、2層モデルを用いて環を作製300-500ミクロンのサイズの範囲におけるES。 PEGDAリングの製造は、最近、このグループ22で説明した。 <ol><li>任意の適切な描画プログラムを使用して1.2センチメートル黒い丸を描くことによってL1を作成する。 </li><li>同じように、L2を作成したが8白0.5×0.35ミリメートル馬蹄形の構造が挙げ​​られる。黒丸構造内の小さな白い馬蹄形状を配布します。 </li><li> JPEG形式でL1とL2を保存します。 </li></ol></li><li>暗色ガラスバイアル中で、20分間マグネチックスターラー上、カンファーキノン、光開始剤w / wの1％ポリエチレングリコールジアクリレート（PEGDAはMn = 250グラム/モル）を混合する。 </li><li>セットアップ望遠レンズ構成を使用してマイクロ光のレーザ光を展開してから、コンピュータプログラム可能なデジタルマルチミラーデバイス（UV対応のDMDスターターキット）の上に投影する。注：DMDを10cm、焦点距離チューブレンズを介してミラーの上に（この場合はリング）のイメージを反映している。画像は、銀COAによって指示されるテッドは、光硬化性ポリマー（PEGDA）を含むバイアルに反映しています。 </li><li>調整し、慎重に設定するマイクロ光の光学部品をクリーニングします。 </li><li> 12ウェル組織培養プレートのウェルにPEGDA液を300μlを入れてください。ウェルは、硬化後の構造を容易に除去するためのテフロンまたは他の非粘着性材料でプレコーティングされていることを確認してください。 </li><li>青色レーザー（MBL-III 473nmで、150 MW）に切り替えて、以前にPCにインストールされALP3-基本ソフトウェアにL1をアップロードします。 60秒間の第一層を照射する。注：ALP3-基本は、PCやデジタルマイクロミラーデバイス間のリンクを提供し、USBインターフェースです。 </li><li> 、ウェルにPEGDAのより250μlを加え、上記のようL2をアップロードして、60秒間、L2を照射。 </li><li>未硬化ポリマーを取り出し、イソプロパノール、O / Nと共に環を洗う。 </li></ol></li><li>エレクトロスピニングを使用して、生分解性PLGA膜の作製 NOTE：PEGDAリングがテンプレートとして使用したsがその上PLGAはそれは、これらのテンプレートの上にスピンさとしてPLGAは、基礎となる地形を再現して電界紡糸した。紡糸した後、PLGAポリマーのシートは、集電体から剥離した。最後のPLGA膜は、金属製の集電体に付着したままにしたPEGDAリングが含まれていませんでした。 <ol><li>静的なエレクトロスピニングコレクタを作成するための電気めっきアルミニウムシート上のPEGDAリング（12センチ×20センチメートル）を配布します。 </li><li>導電性カーボンテープを用いてリングを取り付けます。注：一旦形成これらの環は、エレクトロスピニングのための鋳型として再使用することができる。 </li><li>紡糸用ポリマー溶液を調製します。濃度はw / wの20％のジクロロメタン（DCM）：PLGA（グリコリド（48モル％）44 /モル50:50 DL-ラクチド（52モル％））を溶解する。 </li><li> O / N使用前にかき混ぜる。 </li><li>シリンジポンプに（エンド、0.8センチメートル内径の針を平滑）4インスリン注射器を置きます。注：四注射器は、単一の注射器での作業よりも迅速エレクトロスピニングを確実にした。 </li><li>各シリンジにPLGA溶液2.5mlのをロードします。 </li><li> 12〜15 kVの範囲を30μl/分の流量と電圧を使用して、エレクトロスピニング。針さ15cmのコレクタとの間の距離のままにしておきます。 </li><li>エレクトロスピニング1時間30分間、最後に慎重にPEGDAリングをサポートするコレクタからのPLGA電界紡糸シートをはがします。 </li><li>円形の穴パンチを使用し、中央に位置する環構造を残して直径22mmの円形にエレクトロ足場をカット。 </li></ol></li></ol></li></ol> PLGA微細加工膜の2。長期保管注：PLGAリングを作製し、認定外部企業によって滅菌した。サンプルは25〜40 kGyでの外部用量範囲で照射した。 <ol><li>小さな容器（プラスチックシャーレ）中で膜をマウントし、医療グレードの袋の中に入れてください。 </li><li>乾燥剤のための小さなフィルターバッグを作成するためにろ紙を使用してください。 TO、バッグを作成し、ろ紙（125ミリメートル径）倍と半分になり、半円をカット。その後、テープを使用して一緒に端をシールする。 <ol><li>それぞれ、シリカオレンジ、コバルト（II）、塩化銅（II）硫酸塩1gを3つのフィルタ紙袋を埋める。 </li><li>エレクトロ膜と一緒に医療グレードの袋の中に乾燥剤の3つの袋を置く。 </li></ol></li><li>貯蔵期間中の任意の水分の蓄積を検出するためにバッグに市販の6点の湿度インジケータカードを追加する。 </li><li>真空袋を密封する真空ヒートシール機を使用してください。 </li><li> γ線照射のために外部の会社にリング膜を送信します。 </li><li>店舗5％CO 2を含むインキュベーター内に湿潤環境で37℃まで-20℃から広範囲の温度でPLGA膜をγは、照射した。 </li><li>ポストストレージは、湿度レベルは30％の下にあることを確認するために湿度インジケータを調べます。 </li><li> Uそれ走査型電子顕微鏡（SEM）繊維の完全性を評価した。 </li></ol>縁外植片の3分離ウサギ縁外植片を（ウサギの消費のために飼育されている農場から得た）ウサギの眼から単離した。 <ol><li>消毒液（10％）を使用して、ウサギの眼を消毒。 </li><li>角膜の周囲の余分な組織を除去することで、目をきれいにします。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して角膜の残りから（角膜（透明）と強膜（白）の間の薄い円形の領域として識別される）角膜縁領域に分離します。 </li><li>解剖顕微鏡下でセグメント（長い約1.5センチ）にカット。 </li><li> 1分間、1.5％の消毒液での輪部のセグメントを駆除。 </li><li>外科用メスの刃で小片（100〜500ミクロン）に輪部のセグメントをカットします。 </li><li> Ham&#39;s F12（1：1）、10％ウシ胎児血清、1 U / mlのペン培養培地中の組織の小片（DMEM +グルタマックスを格納するicillin、100 mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシン、EGF、10 ng / mlで、37℃でのインスリンで5μg/ ml）および5％CO 2を使用するまで（せいぜい60分）。 </li></ol>輪部外植片からの細胞の伸長4。 ウサギ角膜縁の外植片を真空パックし、-20℃で6ヶ月間保存した両方たてスピンし、微細加工された膜や、膜上に置いた。 <ol><li>コー​​トフィブリン糊15μlのと環足場：フィブリンを分配するための、細胞スクレーパーを用いて（1〜2.5 U / mlの濃度でヒト血漿から18.75 mg / mlのトロンビンの濃度でヒト血漿からフィブリノーゲン1混合物）均等に。 </li><li> 25 G針と解剖顕微鏡を使用したPLGA micropocketsに直接組織外植片を置きます。 </li><li>外植片を切り離す避けるために、非常に静かに細胞培養培地を追加します。 <ol><li> 3日おきに（メディアレシピは3.7節で説明）とkメディアを変更加湿した37℃のインキュベーター中、5％CO 2中で2週間培養物中のチュー。 </li></ol></li><li> PBSで3回洗浄し、10分間、3.7％緩衝ホルムアルデヒドを有するサンプルを修正しました。 </li><li> RTで10分間、4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）またはヨウ化プロピジウム（PI）を1μg/ mlの中でのインキュベーションによって対比染色。 </li><li> PBS中で3回洗浄し、ホイルで覆われたサンプルを格納。 </li><li>画像543および800nm​​（二光子）の波長で蛍光顕微鏡を用いた試料。 </li></ol> 5。設定アップウサギ傷ついた角膜の3Dモデル<ol><li>クリーンし、上記のようにウサギの眼を消毒。 </li><li> 5分間、0.14％水酸化アンモニウムでそれらを浸漬することにより、ウサギの眼に巻か。 </li><li> PBS中で目をすすぎ、硬節ナイフで上皮を削り取る。 </li><li>切り取り、残りの組織を除去する角膜 - 強膜ボタンを隔離。 </li><li>角膜の上皮側を置きダウンへ無菌カップとDMEM中で行われた0.5％の寒天を埋める。 </li><li>一度設定して、小さなペトリ皿に、角膜の上皮側を上に入れて、輪部エリアまで培養培地（上記のレシピ）を追加します。注：角膜全体をカバーしないでください。気液界面での器官培養を続ける。 </li></ol>角膜縁の外植片とウサギ角膜の3次元モデルにおけるリング足場を含める6。離<ol><li>コー​​トはフィブリン糊15μlのと環膜：上記細胞スクレーパー.USE（1〜2.5 U / mlの濃度で18.75 mg / mlのトロンビンの濃度でフィブリノゲンの1の混合物）に記載されているよう。 </li><li> 25 G針と解剖顕微鏡を使用したPLGA micropocketsに直接組織外植片を置きます。 </li><li>上に向け外植片とし、気液界面の状態で裸に角膜上の組織外植片とリングを置きます。 （これらの条件は、先22に記載されている）。 </li><li>のための器官培養モデルを維持37℃の加湿インキュベーター中で4週間、5％CO 2、2日毎に培地を交換。 </li></ol>角膜再生の7評価と細胞の維持幹<ol><li> 4週間後、3.7％ホルムアルデヒドを使用して角膜を修正。 </li><li> 6μmのパラフィン切片を作製するために、従来の組織学のために角膜を処理します。 </li><li>ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で染色する。 </li><li>免疫細胞化学のために、キシレン（3分）で切片を脱蝋し、100％エタノール（1分）、70％エタノール（1分）、蒸留水（2分間）中で再水和する。 </li><li>小さな領域を区切ると抗体の過度の使用を避けるために、ダコペンを使用してセクションを描く。 <ol><li> 20分（37℃）0.05％トリプシン（100μL）で描かれた領域を扱います。 </li></ol></li><li> PBSで徹底的に洗浄し、1時間、10％ヤギの血清（ブロッキング）を100μlを追加。 </li><li>マウスモノクローナル抗体cytokera100μlのサンプルをインキュベートスズ3（CK3）と4℃で1％のヤギの血清でO / NでのP63を100μl。 </li><li> PBSで洗浄し、ビオチン化二次抗マウス抗体（1：1％ヤギ血清1000）100μlで扱うRTで1時間。 </li><li> RTで30分間：FITC-ストレプトアビジンを100μl（1％ヤギ血清中の100 1）を追加します。 </li><li>上記のようにDAPIでサンプルを扱う。 </li><li>画像は800nm​​（二光子）および488nmの波長で蛍光顕微鏡を用いた試料。 </li></ol>

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<li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

この研究は、使用前にその中のマイクロ構造を含む電界紡糸膜の製造のための（a）の手法と、（b）真空パックにより、臨床使用のためのこのような膜を製造する方法は、ガンマ線照射した後、ストレージを記述する。この特定の用途では、輪部幹細胞ニッチの物理的特徴を模倣micropocketsを含有PLGA膜を開発した。本研究の目的は、組織再生への幹細胞ニッチの寄与の研究のためのマイクロ構造を含む足場を設計し、製造するために必要な知識を読者に提供するために、メソッドを記述すると、（ii）より良い理解を読者に提供するために、（i）は長時間エレクトロ足場を保存する方法の。 臨床応用の観点からは、リング膜の貯蔵は極めて重要である。本研究では、リングの劣化が6ヶ月の期間にわたって研究した。の分解膜は、単にプロセスが停止している水分を含まない膜を維持することによってように加水分解によって駆動される。ブラックウッドらは、PGAとPLAの比率を変えることにより、膜の劣化が32を変化させることを報告した。この研究はまた、PGAの量を増加させることによって、エレクトロスピニングされた膜の分解速度は、インビボ 22 に増加することを示した。ここでは、真空は、いくつかの乾燥剤と一緒に膜を充填し、それらを照射し、6ヶ月間低温でそれらを格納するとともに、繊維の完全性および分解に変化がないことが示されている。現在では、6ヶ月まで私たちは1年間のmicropocketsが、ストレージ·データを含むこれらの膜を研究してきたように-20℃でプレーンなエレクトロ膜上で報告されているされている22℃と今は-20℃での彼らの記憶のための未発表データを持っている劣化の兆候なしで2年間。長期保存のためには-20℃で、乾燥に保管することが推奨される6、Cが、（おそらくはるかに長い）少なくとも6ヶ月間であっても、インドでRTでそれらを格納することができる。湿度インジケータを含めることは、パッケージングは​​、彼らが目的に適合されるであろう場合には、乾燥した膜を維持していることを確認する簡単な手段を提供します。 micropockets内縁の外植片を配置するときの3D角膜モデルにこれらのリングからの細胞の移動が示された。このグループは最近、無地のPLGA膜（環構造のない膜）24上に外植片を配置することにより、in vitroでのウサギ角膜モデルへの細胞の移動を報告した。私たちが今、特にマイクロフィーチャー内の組織外植片を見つけることができたように、本微細加工された足場のセル転送を使用すると、さらに一歩とられている。ニッチ内で直接外植片を配置する能力はまた、外科医が最初の輪部幹細胞を拡大するクリーンルームの必要性を回避手術室で直接膜を使用することができます。 WORのこの作品もののkは角膜疾患デバイスの開発が注目されている、この微細加工技術は、多くの他の用途のための装置を開発するために適用することができる。今後の課題は、皮膚や骨などの他の組織の再生のための構築物の作製を検討します。 PEGDA微細構造の設計および最初の製造は時間がかかることながら、一旦構造が劣化することなく、何回も再使用することができる製作。したがって、エレクトロスピニングによるPLGA微小構造の生分解性膜のその後の製造は、コレクタの組み立て後（ &#39;構造化されていない&#39;）無地膜の製造に匹敵する速度で行うことができる。この研究で私たちは金型を製造するためのマイクロ光を使用しているが、このような三次元印刷または射出成形のような他の製造方法もまた使用することができる。したがって、基礎となる金型はPEの代わりに他のポリマーまたは金属から作ることができるGDA。このように、この技術は、非常に汎用性があり、研究者は簡単に自分たちのニーズや設備に合わせて方法を適合させることができる。 本研究で用いた社内マイクロ光のセットアップが30μmの下の機能を有する構築物の製造を許可しません。これは、ここで説明する角膜用途に制限はありませんが、他のモデルの設計において極めて重要である可能性があります。その場合、そのような2光子重合（2PP）のような他の技術は、しかしながら、電界紡糸法（これは、現在、私たちのグループによって研究されている）は、サブミクロンスケールの構造の再生を許可しない場合が興味深いかもしれない。 製造プロセス中の重要なステップは、時間と光開始剤の量を調整することによって制御することができるPEGDAテンプレートの過硬化を回避は、（i）である。 （ii）の温度や湿度などの電界紡糸条件を制御する。 （ⅲ）適切electrospuの保存真空包装し、乾燥剤を使用して、n個のリング膜。 要約すると、膜の微小特徴の中輪部組織外植片を配置することによって、私たちは、ウサギ負傷角膜と角膜のその後の再上皮化にニッチ分野、セル転送上の外植片からの細胞の成長を示している。異なる温度で保存された膜の劣化も研究されており、膜の長期間の貯蔵を可能にするパッケージ化プロトコルが開発され、後者は、臨床使用のための膜の開発に不可欠である。

角膜、眼球の無血管中央外側のほとんどの組織は、ビジョン1に関与する最も重要な組織の一つである。角膜の機能を維持する細胞のいくつかの種類があります。角膜の一番上の最も外側の層は厚さが2で約5-7層であることが可能である上皮細胞で構成されます。この層は、角膜3内に細菌の侵入を防ぎ、酸素4を入力することができます。これは、角膜輪部5,6として知られている角膜の周辺領域で（120〜150ミクロンのサイズを有する）ニッチまたは陰窩における角膜上皮の嘘の幹細胞が報告されている。幹細胞が分裂したように、また一過性増幅細胞として知ら娘細胞がニッチから移動し、などの部門は、細胞が求心内側に移動し、上向きに中央角膜地域7,8で最終分化細胞をもたらし続けています。これらの細胞は、日常的に被検眼Eの点滅で払拭されている9の下に新しい細胞をxposing。 上皮幹細胞の位置であることに加えて、角膜輪部も角膜領域10から離れた結膜血管化を維持する役割を果たしている。角膜輪部の損傷は、熱的/化学的火傷、放射線、また遺伝病10によって引き起こされる可能性があります。この場合、角膜縁バリアは、結膜細胞が角膜に移動することを可能にする領域を血管化、場合によっては痛みや失明の原因と分解される。条件は輪部幹細胞欠損（LSCD）10としても知られています。 別の天然の基質は、角膜再生を補助するための可能な幹細胞担体として報告されている。例えば、コラーゲンベースの膜はドラヴィダら 11及びラマおよび共同研究者12によって、112人の患者を用いた研究において、フィブリンの使用を報告し使用した。本治療が最も一般的に使用される方法にその表面13,14上の組織バンクや文化縁上皮細胞からのヒト羊膜を使用することです。単層が形成されると、羊膜は外科的に前にこの細胞移植14へ、そこから削除されたすべての結膜細胞および瘢痕組織を持って破損して角膜にアップセル側に接着されている。羊膜上皮15,16を再生するために無欠陥領域に付着した上皮細胞を残して数週間から数ヶ月以内に低下します。この技術は、しかし、臨床的にその広範な取り込みを制限するいくつかの実際的な問題が残っているのビジョンを復元することに成功しています。羊膜のように、患者に細胞移植のために使用される前に良好な組織バンキング手順を使用してスクリーニングを受ける必要があるヒト組織である。このスクリーニングは、疾患の伝播のリスクを低下させるが、完全にそれ17を排除することはできません。これに加えて、Pの変動が報告されている間ドナー変動18,19と異なる処理方法19,20による羊膜のerformance。疾病伝播の小さなリスクと並んで、すべては利用できない、よく実行する組織バンクへのアクセスを、持っている外科センターの要件があります。 羊膜は比較的成功しているが、角膜疾患の治療のための新たな合成生分解性細胞担体の選択肢の開発が必要である。合成担体は、手順を銀行ならびに疾病伝播およびインタードナー変動の小さなリスクを排除する必要性を克服する。この意味で、ポリエチレングリコール21,22及びPLGA 23,24のような材料が検討されている。 人間の羊膜への合成代替手段を開発する際に、うまくいけば、培養細胞の生存を助けるためにそこに望ましい特徴を設計する可能性もある。株式会社細胞の挙動の具体的な制御のための生体材料·デバイス内の微小特徴のlusionは、関心のある新興分野である。多くの著者は、人工幹細胞ニッチ25-30の開発に向けた作業を報告している。このグループは最近、縁上皮細胞22と縁上皮細胞31をサポートするための微細加工されたポケットを含むエレクトロ生分解性膜の製造のための方法論を送達するための微細加工されたPEGDAフィブロネクチンbiofunctionalized人工角膜輪部の作成 ​​を報告している。 この研究の目的は、幹細胞において微小環境が体内に存在する程度に模​​倣する微小特徴を含む生体材料デバイスの開発のための新たな製造技術を開発することである。私たちは、のGreAを示し、生分解性の微細構造膜の製造を可能にするマイクロ光とエレクトロスピニングを組み合わせた技術を開発した組織再生用途のためのt潜在。 なお、この作業では、この技術は、角膜の再生のためのリングの製造に適用したが、技術は、上皮組織の広範囲の再生、 例えば 、皮膚、口腔のためのデバイスの製造に適用できることに留意することが重要である粘膜、腸、呼吸器、および膀胱上皮。具体的には、この研究でわれわれは、角膜に細胞を送達するために、羊膜と類似の様式で機能する合成の生分解性膜を開発した。この膜は、約300ミクロン（（）が150μmの周りフォークトのPallisadesの輪部腺窩よりも大きい）のmicropocketsが含まれています。最後に、これらの膜は、故障の兆候を示すことなく、6ヶ月以上のために-20℃で保存することを可能にするパッケージ化プロトコルを確立している。

<table><tbody><tr><td>ポリ(乳酸-co-グリコール酸)</td><td>Purac</td><td>PDLG5004</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Sigma AldrichまたはFisher</td><td>270997 Or D/1850/17</td><td>>99.8%は50-150 ppmのアミレン安定剤を含んで</td></tr>います <tr><td>デジタルマイクロミラーデバイス(DMD)ディスカバリー1100コントローラーボード&スターターキット</td><td>Texas Instruments</td><td>1076N732 (UV)</td><td></td></tr><tr><td>473 nm レーザー</td><td>レーザー 2000</td><td>MBL-III</td><td>150 mW</td></tr><tr><td>ポリ (エチレングリコール) ジアクリレート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>475629</td><td>Mn = 250 g/mol, 500 ml</td></tr><tr><td>DEMEM + Glutamax</td><td>Fisher</td><td>12077549</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Labtech biosera</td><td>LMH1236/500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Labtech biosera</td><td>FB-1090/50</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&D</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Σ Aldrich</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン</td><td>Σ Aldrich</td><td>A2942-100ml</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>Aldrich P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Σ Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T9326</td><td></td></tr><tr><td>フィブリノーゲン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>p63</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P3737</td><td></td></tr><tr><td>CK3</td><td>メルク ミリポア</td><td>CLB218</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>SLS</td><td>HHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>HT110232-1L</td><td></td></tr><tr><td>医療グレード バッグ (PET/ホイル/LDPE) 剥がせるポーチ</td><td>Riverside Medical Ltd. ダービー、英国</td><td>ホイルラミネート PET/ホイル/LDPE、(12,7,50)</td><td></td></tr><tr><td>ガンマ線照射 (滅菌)</td><td>応用滅菌技術 (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - 25-40 KGy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリカゲルオレンジ</td>の外部線量範囲 <td>Sigma Aldrich</td><td>10087</td><td></td></tr><tr><td>塩化コバルト (II) Sigma</td><td>Aldrich</td><td>232696</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅 (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1297</td><td></td></tr><tr><td>6スポット湿度インジケーターカード</td><td>SCC, USA</td><td>6HIC200</td><td></td></tr><tr><td>真空ヒートシール機</td><td>Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td><td>VS518</td><td></td></tr><tr><td>Andrew James 真空シーラーロール 28 cm x 40 メートルロール</td><td>Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td><td>BR2805</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡(SEM)</td><td>Philips/FEIXL-20 SEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss LSM 510 META</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videne 消毒液</td><td>Ecolab, Swindon, UK</td><td></td><td>3%</td></tr></tbody></table>

角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

角膜の問題は、世界中の生活の質を著しく低下させる何百万人もの人に影響を与える。角膜疾患は、無虹彩症またはスティーブンジョンソン症候群などの病気によって、ならびに、化学火傷または放射線などの外部要因によって引き起こされ得る。現在の治療は、（i）角膜移植片の使用及び（ii）幹細胞の使用は、研究室で展開され、キャリア（ 例えば 、羊膜）上で配信されます。これらの治療は、比較的成功しているが、残念ながら彼らは3-5年後に失敗することができます。詳細に幹細胞が角膜に常駐生理環境を模倣することができる新しい角膜生体材料デバイスを設計および製造する必要がある。輪部幹細胞は、フォークトのパリセーズとして知られている特定のニッチに輪部（角膜と強膜との間の円形領域）に位置しています。本研究では、2つの最先端の製造技術（マイクロ光とelectrospinnを組み合わせた新しいプラットフォーム技術を開発しましたある程度角膜縁を模倣角膜膜の製造のために）る。当社の膜は、フォークトのパリセーズが目に同じような保護を細胞に提供することを目指した人工micropocketsが含まれています。

エレクトロ微細加工リングは、マイクロ光エレクトロスピニング（ 図1および2）の組み合わせを用いて製造した。異なるサイズのPEGDA環はマイクロ光（ 図3）を使用して製造した。この技術は、cmのオーダーと微小特徴の同時取り込みを製作構造を可能にする。この場合には、350〜500ミクロンのmicropocketsを含む1.2〜1.6センチメートル範囲の直径のリングが（ 図4）を作製した。 製造殺菌および将来の臨床用途のための材料のパッケージングの観点からは、医療グレードの袋に真空パックが大幅PLGA膜（ 図5）の長期貯蔵を達成する能力を改善することが見出された。厚さ0.12mmの医療グレードのバッグ（PET /箔/ LDPE）の使用は、より長い貯蔵寿命を達成することができた。これはmembrを送信することによって調べたインドや膜における当社の共同研究者にanesは意図的に湿った条件（湿った培養器）で、室温で、37℃で、-20℃ヶ月間保存した。 図5は、での保存の意図的挑発的な条件を使用していることを示している37℃の湿った条件の下で、膜は非真空パックの条件で約1ヶ月間だけ安定していたが、真空パックされた条件（ 図5および表1）の下で3ヶ月保存を実現しました。 表1は、一つでも使用される袋の選択に注意を払った場合に水膨潤性の取り込みおよび繊維を助長するように選択条件下で達成することができる貯蔵条件の改善を実証する。 リングは、異なる条件での角膜縁の外植片からの細胞伸長（i）は6ヶ月（ 図6）のために保存作りたて及び（ii）のリングをリング支持した。細胞の移動は、4週間後に達成されたときのPL3D負傷モデルにPLGA膜をacing。細胞は、以前に剥皮角膜上で新しい上皮（ 図7）を作成した膜上に置かれた組織外植片から成長した。および陰性対照（負傷した角膜）正（無処理角膜）も、同じ時間の期間、培養で維持された。陰性対照は、任意の追加の細胞の不在下で新上皮の形成の欠如を確認した。免疫細胞は、彼らが角膜分化マーカーCK3（ 図7E）が陽性であったので、外植片から成長する細胞が角膜上皮細胞であることを示した。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500"> マイクロ光の図1の回路図は、PEGDAリングの作成 ​​のために設定します。 her.withinページの「常に "=&gt; <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500"> テンプレートとしてPEGDA微細加工のリングを使用してプロセスをエレクトロスピニングの図2の回路図。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500"> 図3（A）微細加工されたPLGA膜の紡糸用の静的集光器（PEGDA環を有する電気めっきアルミニウム板）の一例を示す図である（B）および（E）静的コレクタから剥離する異なる電界紡糸マットを示す。（C）に示すよう下にある表面の製造にマイクロ光を用いた汎用性を強調し、異なるサイズのPEGDAテンプレート。（D）は、PLGAマイクロ加工レプリカを示している。/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500"> 馬蹄微細形状（A）を有するPEGDAリングの図4のSEM画像;微細加工されたポケット（B）の高倍率SEM像。馬蹄微細形状（C）を有するPLGAリングの位相差画像。微細加工されたポケット（D）の高倍率位相差画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500"> 図5真空のストレージ上の温度と時間の影響と非真空6ヶ月の間に、微細加工リングでPLGA（50:50）膜（44キロ/モル）を充填した。膜の完全性は、完全に無傷の繊維として採点した（+++）、いくつかの繊維の膨潤（+ +）、繊維マージ（+）または無し無傷の繊維（ - ）。 SEM画像と3乾燥剤（シリカゲルオレンジ、塩化コバルト（II）、および硫酸銅（II））は繊維の完全性や湿度の変化を全く示さない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500"> 新たに作製した生分解性のPLGAリング（A、B）に、-20℃で6ヶ月保存後のリング上縁の外植片からLECの増殖を示す図6の蛍光画像°C（C、D）。画像（A）及び（B）は DAPI（青）及びヨウ化プロピジウム（赤）で染色された細胞に対応する。画像bは、微細加工されたポケットの上に配置され、外植片の共焦点zスタックからの直交図である。画像（C）と（D）は P63（緑）に陽性染色を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500"> 図7（A）（B）以前にフィブリン糊をコーティングした足場上に位置するリング足場及び組織外植片をウサギ角膜負傷モデルを示し、（C）は、正および負の対照である。ポジティブコントロールは、新鮮なラビです 。トン角膜および陰性対照上皮が故意に（ネガティブコントロールは4週間培養でもあった）を除去した角膜（D）は 、培養中の4週間後の組織工学角膜のH＆E画像である。図で、（E）ニッチ上に配置された外植片から出てくる細胞によって形成された新しい多層上皮を示し縁外植片からの細胞成長を示す免疫細胞化学的画像である。核はDAPI（青色）で染色し、細胞はサイトケラチン3、角膜分化マーカー（緑）のための陽性染色を示しています。されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA（50:50） </td> X; 37℃しっとりで保管膜のための "&gt;ファイバ·インテグリティ</tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> 0日目</td><td style="width:64px;"> 1ヶ月目</td><td style="width:64px;"> 2ヶ月目</td><td style="width:64px;"> 3ヶ月目</td><td style="width:64px;"> 4ヶ月</td><td style="width:64px;"> 5ヶ月目</td><td style="width:64px;"> 6ヶ月</td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;">非真空パックされた</td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;">真空（バッグA）（PE、PAコンポジット）厚さ：0.14ミリメートル</td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64pxの; "&gt; - <td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;">真空（バッグB）（PET /箔/ LDPE）厚さ：0.75ミリメートル</td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> PLGAの整合性に真空と異なる保存袋の表1の影響（50:50）膜（44キロ/モル）は、ストレージの6ヶ月以上を調査した。膜の完全性は、いくつかの繊維が腫れ、完全に無傷の繊維（+++）としてスコア化した（+ +）、繊維マージ（+）または無し無傷の繊維（ - ）。

私たちは、細胞の挙動を研究する中でエレクトロスピニング膜内micropocketsを製造するための技術を報告している。具体的には、マイクロ光の組み合わせを記述し、微小特徴を備えたPLGA（ポリ（ラクチド - コ - グリコリド））角膜の生体材料デバイスの製造のためのエレクトロスピニング。

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

次の実験の全体的な目標は、積層造形技術とエレクトロスピニングの使用を組み合わせて、組織工学の足場に3D空間の複雑さを導入することです。これは、マイクロステレオリソグラフィーと呼ばれる層ごとの光硬化技術を使用して、ポリエチレングリコール、D acrl、またはPEG DAで作られた非分解性テンプレートを作成することによって達成されます。第二のステップとして。テンプレートは金属基板に接着され、エレクトロスピニングを使用して、下にある形態を模倣した生分解性膜が作製されます。次に、エレクトロスピンメンブレンのパッケージング手順と劣化について検討します。保管されたメンブレンは、温度と湿度を制御することにより、早期の劣化を回避します。最後のステップは、生分解性メンブレンを3D損傷角膜モデルに配置して、角膜再生デバイスとしての可能性を研究することです。その結果、アディティブ・マニュファクチャリング技術とエレクトロスピニングを使用して、天然の幹細胞ニッチをある程度模倣したマイクロポケットを含む複雑な膜を作成することの多様性が示されています。この手法の主な利点は、その汎用性です。非生分解性の型は、幅広い製造技術を使用して新たに作成できるため、この方法は製造と組織再生の両方の分野で関心があり、幹細胞の挙動と幹細胞のニッチに関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。マイクロファブリケーションされた足場を作るこの方法は、角膜の再生についての洞察を提供することができます。また、皮膚や口腔粘膜などの幹細胞ニッチを持つ他の上皮組織に適用したり、さまざまな組織のエンジニアリングのための他の3D機能や足場を提供したりすることもできます。オルテガリーダーとトーマス・パターソンの両方が手順を実演します。この手順は、最初のレイヤーである L one を作成することから開始します。これは、1.2センチメートルの黒い円に適した描画プログラムを使用して、構造のベースになります。次に、L 2を作成します。2 番目のレイヤーには、別の 1.2 センチメートルの黒い円を描きますが、0.5 x 0.35 ミリメートルの白い馬蹄形の構造物が 6 つから 8 つ含まれています。小さな白い馬蹄形を黒い円の構造内に分散させます。L oneとL twoをJPEG形式で保存して、マイクロステレオリソグラフィー用にセットアップします。まず、システムの光学系を調整し、慎重に清掃します。300マイクロリットルのポリエチレングリコールジacrl、またはPEG D混合物を12ウェル組織培養プレートのウェルに入れます。ウェルは、テフロンまたは他の焦げ付き防止材料で事前にコーティングされているか、構造を簡単に取り外す必要があります。硬化後、青色レーザーのスイッチを入れ、ALP threeの基本ソフトにL oneをアップロードします。このソフトウェアは、PCとデジタルマイクロミラーデバイス間のリンクを提供するUSPインターフェイスです。最初の層に60秒間照射します。井戸にペグダの250マイクロリットルを追加します。L2をアップロード、L2を60秒間照射します。未硬化のポリマーを取り除き、イソプロパノールでリングを一晩洗う エレクトロスピニングの前日に、電気メッキされた12センチメートル×20センチメートルのアルミニウムシートにPEG DAリングを分散させることにより、静的エレクトロスピニングコレクターを作成します。導電性カーボンテープを使用してリングを取り付けます。ポリラクチドcoグリコまたはPLGA溶液を調製し、翌日の使用前に一晩攪拌します。内径0.8センチメートルの鈍い針が付いた5ミリリットルの注射器を4つ、シリンジポンプに置きます。1本のシリンジの代わりに4本のシリンジを使用します。より迅速な電気紡糸を確保するために、各シリンジにPLGA溶液の2.5ミリリットルをロードします。この手順を成功させるには、ラロピニン変数をできるだけ一定に保つようにすることが重要です。針とコレクターの間の距離を15センチメートル残します。1時間30分30分のエレクトロスピニングエレクトロスピンのために、毎分30マイクロリットルの流量と12〜15キロボルトの範囲の電圧を設定します。エレクトロスピニングが完了したら、PEG daリングを支えるコレクターからPLGAエレクトロスポンジシートを慎重にはがします。PEG DAリングは、エレクトロスピニングのテンプレートとして再利用できます。円形の穴あけパンチを使用して、エレクトロスポン足場を直径22mmの円にカットします。リング構造を中央に配置したままにして、PLGAメンブレンを長期保存用に準備します。それぞれをプラスチック製のシャーレなどの小さな容器に取り付け、医療グレードのバッグに入れます。医療グレードのバッグの中に乾燥剤を3袋入れます。バッグに市販の6スポット湿度インジケーターカードを追加します。これにより、保管期間中の水分の蓄積が検出されます。真空ヒートシール機を使用して、バッグを掃除機で密封します。その後、PLGA膜は外部企業に送られ、保管前にガンマ線または放射線が供給されます。この実験では、ウサギが消費用に飼育されている農場から得られたウサギの目からウサギのリンバルナスが分離されます。まず、3%消毒液を使用してウサギの目を消毒します。次に、角膜の周りの余分な組織を取り除き、目をきれいにします。辺縁部は、透明な角膜と白い強膜の間の薄い円形の領域として識別できます。辺縁部を角膜の残りの部分から分離します。輪部を約1.5cmの長さに切り、輪部を1.5%消毒液で1分間消毒します。消毒後、メスの刃を使用して、輪部を細かく切ります。ティッシュの小片をDMEMとglut max培地に、摂氏37度、二酸化炭素5%、または使用前に最大1時間保存してください。この手順を開始するには、セルスクレーパーを使用して、リング膜を15マイクロリットルのフィブリリン接着剤でコーティングします。解剖顕微鏡下で作業しながら、フィブリリンを均等に分配します。25ゲージの針を使用して、リンバル外植片をPLGAマイクロポケットに直接配置します。組織の説明でリングを、事前に準備した露出した角膜に置きます。.エクスプランを上に向けて、気液界面条件で、PLGAリングはすぐに濡れ、角膜モデルの形状を採用します。加湿インキュベーターで臓器培養モデルを摂氏37度で4週間維持し、2日ごとに培地を5%二酸化炭素交換します。マイクロステレオリソグラフィーは、さまざまなサイズのPEG DAリングの製作と、マイクロフィーチャーの同時組み込みを可能にします。リングは再現性よく製作・再利用でき、エレクトロスピニングコレクターとして使用できる金属シートに簡単に取り付けることができます。この例では、リングに馬蹄形のマイクロ特徴が含まれています。その後、エレクトロスピニングはPLGAレプリカを製造し、PLGA膜の真空パッキンは、意図的に湿った条件下で摂氏37度でも長期保存を大幅に改善します。使用されるバッグの種類は、膜の安定性にも影響を与え、走査型電子顕微鏡と3つのデスカントの検査では、ファイバーの完全性や無傷のファイバーの湿度に変化は見られません。辺縁部インプラントからの細胞増殖、または作りたての生分解性PLGAリングとマイナス20°Cでの6ヶ月間の保管後のリングの両方によって支えられます。PLGAメンブレンを3D損傷角膜モデルに載せたところ、4週間後に細胞移植が達成されました。H画像とe画像は、ニッチに配置された外植片から出てくる細胞によって形成される新しい多層上皮を示しています。ネガティブコントロールは、追加の細胞がない場合に新しい上皮の形成の欠如を確認しました。陽性対照として使用された新鮮なウサギの角膜で観察された従来の角膜上皮と比較して。免疫細胞化学は、インプラントから成長する細胞が角膜分化マーカーであるサイトケラチン3に陽性であったため、角膜上皮細胞であることを示しました。非生分解性テンプレートを含むエレクトロスピニングコレクターは再利用可能であるため、プロトコールが最適化されると、足場の製造は2時間で行うことができます。この技術により、組織工学の分野の研究者は、細胞の挙動を研究するための微細な特徴を含む複雑な組織工学膜を製造する新しい方法を探求することができます。このビデオを見れば、アディティブ・マニュファクチャリング技術やモデリングなどの類似のアプローチを使用して非分解性のマイクロファブリケーション・テンプレートを作成する方法や、エレクトロ・スピニングを使用してスキャフォールドを複雑にする方法を十分に理解できるはずです。

combination-microstereolithography-electrospinning-to-produce

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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レーザーカットステンシルを用いたシンプルリソグラフィフリーシングルセルマイクロパターニング

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操作された線維芽細胞増殖因子によって刺激された加速治癒を伴うデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデル1

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高度な In vivo イメージングのための微細構造イメージングウィンドウに統合された埋め込み型光学系の微細加工

学ぶマイクロ光造形とエレクトロスピニングを組み合わせた角膜再生用PLGA膜の製造法。幹細胞ニッチを模した微細構造を持つ生分解性スカフォールドの作製と細胞挙動解析への応用を解説する。

角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

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