角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

次の実験の全体的な目標は、積層造形技術とエレクトロスピニングの使用を組み合わせて、組織工学の足場に3D空間の複雑さを導入することです。これは、マイクロステレオリソグラフィーと呼ばれる層ごとの光硬化技術を使用して、ポリエチレングリコール、D acrl、またはPEG DAで作られた非分解性テンプレートを作成することによって達成されます。第二のステップとして。

テンプレートは金属基板に接着され、エレクトロスピニングを使用して、下にある形態を模倣した生分解性膜が作製されます。次に、エレクトロスピンメンブレンのパッケージング手順と劣化について検討します。保管されたメンブレンは、温度と湿度を制御することにより、早期の劣化を回避します。

最後のステップは、生分解性メンブレンを3D損傷角膜モデルに配置して、角膜再生デバイスとしての可能性を研究することです。その結果、アディティブ・マニュファクチャリング技術とエレクトロスピニングを使用して、天然の幹細胞ニッチをある程度模倣したマイクロポケットを含む複雑な膜を作成することの多様性が示されています。この手法の主な利点は、その汎用性です。

非生分解性の型は、幅広い製造技術を使用して新たに作成できるため、この方法は製造と組織再生の両方の分野で関心があり、幹細胞の挙動と幹細胞のニッチに関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。マイクロファブリケーションされた足場を作るこの方法は、角膜の再生についての洞察を提供することができます。また、皮膚や口腔粘膜などの幹細胞ニッチを持つ他の上皮組織に適用したり、さまざまな組織のエンジニアリングのための他の3D機能や足場を提供したりすることもできます。

オルテガリーダーとトーマス・パターソンの両方が手順を実演します。この手順は、最初のレイヤーである L one を作成することから開始します。これは、1.2センチメートルの黒い円に適した描画プログラムを使用して、構造のベースになります。

次に、L 2を作成します。2 番目のレイヤーには、別の 1.2 センチメートルの黒い円を描きますが、0.5 x 0.35 ミリメートルの白い馬蹄形の構造物が 6 つから 8 つ含まれています。小さな白い馬蹄形を黒い円の構造内に分散させます。

L oneとL twoをJPEG形式で保存して、マイクロステレオリソグラフィー用にセットアップします。まず、システムの光学系を調整し、慎重に清掃します。300マイクロリットルのポリエチレングリコールジacrl、またはPEG D混合物を12ウェル組織培養プレートのウェルに入れます。

ウェルは、テフロンまたは他の焦げ付き防止材料で事前にコーティングされているか、構造を簡単に取り外す必要があります。硬化後、青色レーザーのスイッチを入れ、ALP threeの基本ソフトにL oneをアップロードします。このソフトウェアは、PCとデジタルマイクロミラーデバイス間のリンクを提供するUSPインターフェイスです。

最初の層に60秒間照射します。井戸にペグダの250マイクロリットルを追加します。L2をアップロード、L2を60秒間照射します。

未硬化のポリマーを取り除き、イソプロパノールでリングを一晩洗う エレクトロスピニングの前日に、電気メッキされた12センチメートル×20センチメートルのアルミニウムシートにPEG DAリングを分散させることにより、静的エレクトロスピニングコレクターを作成します。導電性カーボンテープを使用してリングを取り付けます。ポリラクチドcoグリコまたはPLGA溶液を調製し、翌日の使用前に一晩攪拌します。

径0.8センチメートルの鈍い針が付いた5ミリリットルの注射器を4つ、シリンジポンプに置きます。1本のシリンジの代わりに4本のシリンジを使用します。より迅速な電気紡糸を確保するために、各シリンジにPLGA溶液の2.5ミリリットルをロードします。

この手順を成功させるには、ラロピニン変数をできるだけ一定に保つようにすることが重要です。針とコレクターの間の距離を15センチメートル残します。1時間30分30分のエレクトロスピニングエレクトロスピンのために、毎分30マイクロリットルの流量と12〜15キロボルトの範囲の電圧を設定します。

エレクトロスピニングが完了したら、PEG daリングを支えるコレクターからPLGAエレクトロスポンジシートを慎重にはがします。PEG DAリングは、エレクトロスピニングのテンプレートとして再利用できます。円形の穴あけパンチを使用して、エレクトロスポン足場を直径22mmの円にカットします。

リング構造を中央に配置したままにして、PLGAメンブレンを長期保存用に準備します。それぞれをプラスチック製のシャーレなどの小さな容器に取り付け、医療グレードのバッグに入れます。医療グレードのバッグの中に乾燥剤を3袋入れます。

バッグに市販の6スポット湿度インジケーターカードを追加します。これにより、保管期間中の水分の蓄積が検出されます。真空ヒートシール機を使用して、バッグを掃除機で密封します。

その後、PLGA膜は外部企業に送られ、保管前にガンマ線または放射線が供給されます。この実験では、ウサギが消費用に飼育されている農場から得られたウサギの目からウサギのリンバルナスが分離されます。まず、3%消毒液を使用してウサギの目を消毒します。

次に、角膜の周りの余分な組織を取り除き、目をきれいにします。辺縁部は、透明な角膜と白い強膜の間の薄い円形の領域として識別できます。辺縁部を角膜の残りの部分から分離します。

輪部を約1.5cmの長さに切り、輪部を1.5%消毒液で1分間消毒します。消毒後、メスの刃を使用して、輪部を細かく切ります。ティッシュの小片をDMEMとglut max培地に、摂氏37度、二酸化炭素5%、または使用前に最大1時間

この手順を開始するには、セルスクレーパーを使用して、リング膜を15マイクロリットルのフィブリリン接着剤でコーティングします。解剖顕微鏡下で作業しながら、フィブリリンを均等に分配します。25ゲージの針を使用して、リンバル外植片をPLGAマイクロポケットに直接配置します。

組織の説明でリングを、事前に準備した露出した角膜に置きます。.エクスプランを上に向けて、気液界面条件で、PLGAリングはすぐに濡れ、角膜モデルの形状を採用します。加湿インキュベーターで臓器培養モデルを摂氏37度で4週間維持し、2日ごとに培地を5%二酸化炭素交換します。

マイクロステレオリソグラフィーは、さまざまなサイズのPEG DAリングの製作と、マイクロフィーチャーの同時組み込みを可能にします。リングは再現性よく製作・再利用でき、エレクトロスピニングコレクターとして使用できる金属シートに簡単に取り付けることができます。この例では、リングに馬蹄形のマイクロ特徴が含まれています。

その後、エレクトロスピニングはPLGAレプリカを製造し、PLGA膜の真空パッキンは、意図的に湿った条件下で摂氏37度でも長期保存を大幅に改善します。使用されるバッグの種類は、膜の安定性にも影響を与え、走査型電子顕微鏡と3つのデスカントの検査では、ファイバーの完全性や無傷のファイバーの湿度に変化は見られません。辺縁部インプラントからの細胞増殖、または作りたての生分解性PLGAリングとマイナス20°Cでの6ヶ月間の保管後のリングの両方によって支えられます。

PLGAメンブレンを3D損傷角膜モデルに載せたところ、4週間後に細胞移植が達成されました。H画像とe画像は、ニッチに配置された外植片から出てくる細胞によって形成される新しい多層上皮を示しています。ネガティブコントロールは、追加の細胞がない場合に新しい上皮の形成の欠如を確認しました。

陽性対照として使用された新鮮なウサギの角膜で観察された従来の角膜上皮と比較して。免疫細胞化学は、インプラントから成長する細胞が角膜分化マーカーであるサイトケラチン3に陽性であったため、角膜上皮細胞であることを示しました。非生分解性テンプレートを含むエレクトロスピニングコレクターは再利用可能であるため、プロトコールが最適化されると、足場の製造は2時間で行うことができます。

この技術により、組織工学の分野の研究者は、細胞の挙動を研究するための微細な特徴を含む複雑な組織工学膜を製造する新しい方法を探求することができます。このビデオを見れば、アディティブ・マニュファクチャリング技術やモデリングなどの類似のアプローチを使用して非分解性のマイクロファブリケーション・テンプレートを作成する方法や、エレクトロ・スピニングを使用してスキャフォールドを複雑にする方法を十分に理解できるはずです。