Name: 組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶラット脳の高分解能メタボローム解析法。液体窒素凍結・メタノール・クロロホルム・水抽出後、変性タンパク質と有機溶媒を除去し凍結乾燥する。NMR分光法で詳細な代謝物プロファイルを取得し、神経化学疾患研究に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 and 7339) による支援に感謝の意を表します。

<ol><li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat%2Fmouse+model+of+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5(2008).</li>
<li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological%2C+electrophysiological%2C+neurological%2C+and+behavioral+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1(2012).</li>
<li>Papaioannou, V., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapaioannou%2C+V+%22Mouse+Phenotypes+A+Handbook+of+Mutation+Analysis%22">Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).</li>
<li>Yu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sodium+current+in+GABAergic+interneurons+in+a+mouse+model+of+severe+myoclonic+epilepsy+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.</a> Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).</li>
<li>Mallolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+the+EAAT2+promoter+is+associated+with+higher+glutamate+concentrations+and+higher+frequency+of+progressing+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).</li>
<li>Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrusio%2C+WE+%22Behavioral+Genetics+of+the+Mouse+Genetics+of+Behavioral+Phenotypes%22">Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes</a>. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fingerprints+of+altered+brain+growth%2C+osmoregulation+and+neurotransmission+in+a+Rett+syndrome+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model.</a> PLoS ONE. 2, e157(2007).</li>
<li>Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+drug+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in drug target discovery.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWishart%2C+DS+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+freezing+conditions+for+cerebral+metabolites+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats.</a> Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).</li>
<li>Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+isotopomer+analysis+in+the+rat+brain+in+vivo+automatic+quantitation+of+13C+NMR+spectra+using+LCModel%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel.</a> NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts+2+Line+width+and+spectral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution.</a> Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101(2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li>
<li>Pearson, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+GA+%22Shimming+an+NMR+magnet%22">Shimming an NMR magnet</a>. , University of Iowa. Iowa City. (1991).</li>
<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
<li>Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+study+of+regional+metabolism+after+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20, 633-640 (1989).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

NMR分光法は、非常に再現性および正確な方法で、溶液中の化学物質の濃度を測定するための効率的な方法である。しかし、高品質のデータを得るために、サンプル調製および分析に関する特定の規則を遵守する必要がある。観察されたシグナルの強度が検出閾値（特に弱い信号）に近づくない限り、NMR分光法による代謝産物濃度の測定では、生成もNMR信号の受信のいずれも、定量誤差を支配する。他のすべての場合生物学的変動、（ 等抽出効率、化合物の物理的および化学的安定性、ピペッティングエラー計量）試料調製技術において、および/ ​​または信号取得および処理パラメータの選択は、結果の精度と正確さを決定する。明らかに、組織の収穫の間に生じる任意の代謝の変化はまた、代謝物濃度に反映され得るエド。したがって、できるだけ速く組織の収穫を完了するために非常に重要であり、正確な場合に急速に代謝化合物の生体内濃度の凍結など漏斗のような特定の組織の凍結技法を適用することが重要である（特にグルコース、乳酸、ATPおよびその異化代謝産物、ADPおよびAMP）。 偶数ルーチン高分解能NMR分光計...

マウスモデルは、脳研究1において広く利用されている。遺伝子型-表現型相関は、他2-6一方でRNAおよび/ ​​またはタンパク質レベルでの遺伝子発現、及び形態学的、機能的、電気生理学的および/ ​​または行動的表現型を研究することによって、マウスおよびラットの脳において研究されてきた。しかし、完全な遺伝子型と表現型の連結機構を理解するためには、下流のタンパク質の発現、 すなわち分子事象を調査するために不可欠である。酵素が7を作用する際の生化学的基質の代謝。この要件は、過去10〜15年間で、生物学8,9の多くの支店での代謝研究のルネサンスに、つながった。古典的な代謝の研究は、多くの場合、特定の経路の詳細に焦点を当ててきたが、新たなメタボロミクスアプローチが検討中の組織のグローバルな代謝プロファイルのすべての包括的な調査を目指している。この概念の1つの結果は、特定の代謝経路および/または化合物のクラスの偏りを最小限にする分析ツールが明らかに必要である。しかし、古典的な生化学的アッセイは、アッセイを行う前に指定する必要がある特定の分析物の特定の化学反応に基づいている。対照的に、核磁気共鳴（NMR）分光法および質量分析（MS）（i）のような分光技術は、生化学的化合物の特定の分子（物理的）特性に基づいて、それぞれがスペクトル中の1つまたはいくつかの別個の信号が生じる一つの実験の過程で検出された。および（ii）実験ごとに異なる​​多数の化合物を検出する。 このように、各スペクトルは、代謝物の全範囲を組み合わせた情報が含まれています。事前選択は測定されるべき分析物の性質について説明する必要がないので、このような理由から、分光学的方法は、メタボロミクスのための適切なツールである8 </suP&gt;。彼らは大幅に予想外の代謝変化の検出を容易にするため、結果として、これらの技術は、自然探索の研究に役立つ。 NMR分光法およびMSは、多くの代謝物の分析のために交換可能に使用することができますが、それぞれの方法は、最近10日された特定の長所と短所を持っています。簡潔には、NMR分光法は、通常、粗抽出物から行うことができ、分析の前にサンプル化合物のクロマトグラフ分離を必要としない。対照的に、MSは、質量分析イメージングのような特定の最近の発展を除いて、ガスまたは液体クロマトグラフィー（GCまたはLC）分離で動作する。異なる糖の共振線路は、プロトン（1 H）NMRスペクトルにおいて有意に重なるので、そのような糖の分析のようないくつかの特殊なケースでは、LC分離は、同様にNMR分光法のための必需品となってもよい。 CHRのないそれにもかかわらず、1 H NMR分光法omatographic分離は最も人気のある、ほぼ普遍的に適用されたメタボロミクスNMR法のまま。一般的に、サンプル調製は、NMR分光法の場合よりもMSのためのより多くの時間がかかり、複雑である。マトリックス効果に起因する深刻な問題は、彼らが大幅に減衰された信号につながる可能性があり、MSに比べてNMR分光法であまり一般的である。代謝産物の定量は、いずれの方法で達成することができる。しかし、複数の標準化合物に起因代謝産物間のマトリックス効果及びイオン化効率の変動にMSのために必要とされる。適切な測定条件で、後者の方法は本質的に観察された核によって厳密に線形NMR応答を定量的おかげであるため、これとは対照的に、試料ごとに1つの標準は、NMR分光分析に必要とされる。 NMRの主な欠点は、その比較的低い感度である。 MSは、特定のLC-MSで、数桁NMRよりも敏感である。この理由のために、MSは、NMRのために好まれるべきである非常に低い濃度で存在する化合物の分析。一方、NMR実験の非破壊的性質は、MSを超える明確な利点である。このように、NMRは、1 H、リン31（31 P）、炭素13（13 C）、フッ素-19（19 F）などの異なるNMR活性核のために、 例えば 、同じサンプルを繰り返し実行することができるなど 、MS測定とは対照的にない物質がNMRによって消費されないように。 NMRおよびMSの両方が異なるモードで使用することができ、それぞれが特定の化学的特性を有する化合物の検出のために最適である。ほとんど全てのリン酸化された代謝物はまた、プロトンを含んでいますが、例えば、31 P NMRは、多くの場合、適度に集中し、リン酸化化合物の分析のための1 H-NMRより適しています。後者はしかし、それらの1 H NMRシグナルは、他の、非リン酸化化合物の1 H NMRシグナルによって不明瞭にすることができる明らかに31 P NMRスペクトルにバックグラウンド信号は発生しません。 13 C NMRの特別な場合は、ほぼ独占的に重要である一方、アナログ状況では、19 F NMR分析は、フッ素化化合物、 例えば 、フッ素化剤（内因性代謝からのない背景信号）のために好ましいことがあるかの13 Cの運命により13 C同位体（ 約 1％）の非常に低い天然存在度に、続いする必要がある外因性の代謝前駆体を標識した。多くの質量分析計は、陰イオンモードまたは陽イオンモードのいずれかで動作します。したがって、観察されるイオンは正または負に帯電しているかどうかを先に分析知ることが重要である。この方法は、低コストで重要な代謝物濃度の多数を生じるので、私たちはサンプル調製aのに必要な（i）の時間的に1 Hおよび31 P NMR分光法による脳組織のメタボロームを分析するためのプロトコルに焦点を当てるND（ⅱ）の努力は、代謝物の定量のために必要。全ての実験は、標準的な湿式化学実験室の装置および高分解能NMR分光機能を用いて行うことができる。さらなる要件は、以下のプロトコルの項に記載されている。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>動物用麻酔薬</td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>オーメダ</td><td>Isotec 3</td><td>利用可能な新しいモデル: Isotec 4</td></tr><tr><td>メス、はさみ、鉗子、クランプ</td><td>ハーバード大学 Apparatus フィッシャーサイエンティフィック</td><td>various 動物</td><td>用手術器具</td></tr><tr><td>凍結クランプツール</td><td>自作</td><td>n/a</td><td>冷却のための液体窒素で挿入されるアルミニウム版が付いているトング </td></tr><tr><td>デュ</td><td>ワーNalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>空気清</td>浄物 <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>空気清</td>浄物 <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>窒素蒸発器</td><td>Organomationの仲間</td><td>N-EVAP 111</td><td>自作装置によって取り替えることができる</td></tr><tr><td>モルタル</td><td>Σ-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>乳棒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>組織ホモジナイザー</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>ホモジナイザーシャフトに適合する試験管付き</td></tr><tr><td>電子スケール</td><td>ザルトリウス</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製遠心チューブ</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, 30 ml チューブ</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml チューブ; 遠心分離機ローターと互換性がある場合は「エッペンドルフ」チューブを交換する必要があります</td></tr><tr><td>ポリスチレンピペット</td><td>Costar コーニング</td><td>ストリップ</td><td>5 および 10 ml 容量</td></tr><tr><td>重水素化 重</td><td></td><td></td><td>水素化 431915 99.96%</td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99.96% 重水素塩化</td></tr><tr><td>重水素</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% 酸化</td></tr>重水素 二<tr><td>重水素</td>ナトリウム <td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% 酸化重水素</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>冷遠心分離機</td><td>ヘレウス</td><td>メガフージ 16R</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>ユーテック サイバネティクス</td><td>サイバースキャン</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>水酸化セシウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>NMRチューブ</td><td>ウィルマッド</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMRステム同軸インサート</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z278513</td><td>ウィルマッド</td></tr><tr><td>NMRピペット</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>研究</td><td>0.5から1,000までの容量のヒント付き &mu;l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>NMR分光計</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>プローブやその他のアクセサリーを含む</td></tr><tr><td>NMRソフトウェア</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>新しいバージョンが利用可能: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>水溶性標準化合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>様々な</td><td></td></tr><tr><td>リン脂質標準化合物</td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>various various </td><td>plasma alogensのさまざまなソースですが、 <70 - 80% 純度</td></tr>の<tr><td>メチレンジホスホネート</td><td>ΣΣ-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Σ-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

RNAおよびタンパク質レベルでの遺伝子発現の研究は、疾患の根底にある生物学的プロセスを探求するために長い間使用されてきました。最近では、ゲノミクスとプロテオミクスは、生物学的システムに存在する代謝物プールの包括的な定量分析によって補完されています。メタボロミクスと呼ばれるこの戦略は、代謝に関与する低分子補体のグローバルな特性評価を提供することを目指しています。ゲノムとプロテオームは細胞が実行できるタスクを定義しますが、メタボロームは実際の表現型の一部です。メタボロミクスで現在使用されている方法の中で、分光法は、特定の生化学的経路を事前に選択することなく多数の代謝物を同時に分析できるため、幅広い偏りのないアプローチを可能にするため、特に興味深いものです。ここでは、高分解能NMR分光法によるメタボローム分析のための最適化された実験プロトコルを紹介します。これは、組織代謝物の効率的な定量に最適な方法です。この方法の重要な強みは、(i)サンプルを精製したり代謝物を分離したりすることなく、粗抽出物を使用できることです。(ii)NMRの本質的な定量的性質により、NMRスペクトルで表されるすべての代謝産物を1つの参照化合物のみで定量できる。(iii)NMRの非破壊的な性質により、同じサンプルを複数の測定に繰り返し使用できること。NMRシグナルの線形応答により、カバーできる代謝物濃度のダイナミックレンジはかなりのものですが、非常に低い濃度で発生する代謝物は検出が難しい場合があります。最も存在量が少ない化合物については、高感度質量分析法が有利な場合がありますが、この手法ではNMR分光法よりも複雑なサンプル調製と定量手順が必要です。ここでは、ラットの脳分析に調整されたNMRプロトコルを紹介します。ただし、同じプロトコルをわずかな変更を加えて他の組織に適用することができます。

抽出溶液中に存在する：脳および他の組織抽出物の代謝NMRスペクトルにおける最高の解像度を得るためには、長い金属イオン（常磁性イオン、最も重要なこと）を削除するか、マスクするのが一般的となっている。これは、またはそのようなキレックス-100 20としてイオン交換樹脂を通過エキスを通過させることによって抽出物19へEDTAまたはCDTAなどのキレート剤を添加することのいずれかによって達成されている。 図1に示す結果は、脳抽出物を慎重に上記のプロトコールに従って調製する場合は、このステップは、1 H NMR分光分析に必要でないことを実証する。ここで、非常に狭いスペクトル線は、分析した全てのスペクトル領域について得られた。でも、非常に混雑した地域では、 たとえば 、グルタミン/グルタミン酸とミオ -イノシトールの /グリシン、&lt;0.01 ppmでの距離でのピークは400 MHzの（ 図1、下）でほぼ完全に分離可能である。その結果、定性、図...

哺乳類の脳の神経化学は、多くの神経疾患や全身疾患で変化しています。脳代謝産物の特徴的なプロファイルは、脳組織の粗抽出物に基づいて効率的に取得できます。そのために、高分解能NMR分光法を採用し、代謝物濃度の詳細な定量分析(メタボロミクス)を可能にしています。

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

この手順の全体的な目標は、ラット脳抽出物から高解像度の代謝物プロファイルを取得することです。これは、最初にラットの脳を採取し、これらを液体窒素で急速冷凍することによって達成されます。第2のステップは、メタノールクロロホルム水で組織を均質化することにより脳代謝産物を抽出し、続いて変性タンパク質と有機溶媒を除去することです。次に、水性サンプルを凍結乾燥し、すべてのサンプルを明確に定義された溶媒で再溶解します。最適なNMR分光分析のための最終ステップは、メタボロームNMR実験を慎重に設定し、最適化することです。最終的に、NMRスペクトルは明確に定義された実験条件下で必要であり、最適化されたデータ処理プロトコルを使用して評価されます。この方法は脳の代謝に関する洞察を提供しますが、腫瘍、肝臓、腎臓、その他の臓器などの他の軟組織にも適用できます。まず、あらかじめ調製した凍結した脳組織サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出します。次に、組織サンプルを液体窒素で部分的に満たされた乳鉢に直ちに移します。液体窒素コールドペーストルを使用して、凍結した脳組織を細かく砕き、組織の均質化に使用する試験管に簡単に収まります。この混合に続いて、凍結した脳組織の小片を250〜350ミリグラムの組織を完全に計量し、合計4ミリリットルの氷冷メタノールで満たされた試験管に移します。凍結した組織片を試験管に加えるたびに、すぐに組織ホモジナイザーでホモジナイザーを均質化します。凍結ラット脳サンプルの最後の部分を試験管に加えて均質化した後、ホモジネートを20ミリリットル以上のガラスバイアルに移します。スクリューキャップを閉じ、ホモジネートを氷上に15分間置きます。次に、4ミリリットルの氷冷クロロホルムをホモジネートに加え、完全にボルテックスします。終了したら、ホモジネートを氷上に15分間置きます。渦巻き込み後、ホモジネートに4ミリリットルの水を加え、ホモジネートを摂氏マイナス20度で一晩放置します。完全な相分離のためには、脳組織ホモジネート溶液を20ミリリットル以上のチューブ、クロロホルム耐性遠心分離管に移し、サンプルを13, 000G、摂氏4度で40分間遠心分離します。遠心分離後、パスターピペットを使用して、上相を適切な15ミリリットルのメタノール耐性チューブに移します。次に、新鮮なペーストピペットを使用して、下相を適切な、またはそれ以上のチューブ15ミリリットルのクロロホルム耐性チューブに移し、水メタノール相を氷上に保持しながら氷上に置きます。乾燥窒素の流れを抽出溶液に向けることにより、メタノールを蒸発させます。窒素が泡立ったら蒸発プロセスを終了します。抽出液の体積減少を引き起こさなくなりました。メタノールクロロホルム相のチューブを氷上に置いた後、乾燥窒素の流れを抽出溶液の表面に向けることにより、メタノールを蒸発させます。すべての溶媒が蒸発したら、チューブを閉じ、NMR分析の準備が整うまでサンプルを摂氏マイナス80度に保ちます。凍結乾燥用の水相を調製するには、水溶液サンプルを十分にすすいだ50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、遠心分離管を液体窒素中で回転させて抽出液を凍結し、チューブの内面が凍結した液体で徐々に覆われるようにします。すべての液体が凍結したら、チューブを穴の開いたスクリューキャップで覆い、蒸気を逃がし、チューブをワイドネックの真空フィルターボトルに入れます。ボトルを凍結乾燥機に取り付けた後、凍結乾燥を開始し、凍結乾燥プロセスを終了します。サンプルが完全に乾いたら、NMR分析に使用するまで、サンプルを閉じたチューブ内で摂氏マイナス80度に保ちます。リン脂質のリンNMR分析では、乾燥脂質を重水素化クロロホルムメタノールの5〜4対1の混合物と200ミリモルのCDTA水溶液の700マイクロリットルに溶解します。クロロホルム耐性チップを備えた直接変位マイクロピペットを使用して、サンプルをマイクロ遠心分離チューブに移します。この時点で、NMRプローブの温度調節を目的の目標値(通常は摂氏25度の遠心分離機)に設定します。摂氏 4 度と 11 、 000 G で 30 分間のリン脂質抽出溶液をサンプル中の固体残留物をスピンダウンします。終了したら、600マイクロリットルのスーパーナチンを外径5mmの高品質NMRチューブに移します。化学シフトの参照と定量のために、pH 7.0の20ミリモルメチレン二リン酸水溶液で満たされた適切な同軸インサートステムを調製します。このインサートをリン脂質抽出液で満たされたNMRチューブに入れます。次に、NMRチューブに適切なスピナーを装着し、NMR磁石に移します。サンプルが設定温度に調整されるまで待った後、サンプルを15〜20ヘルツで回転させます。軸上と軸外軸のシムコイル電流を調整し、NMRスペクトル取得パラメータを最適な値に設定することにより、サンプル全体の磁場を均一に慎重に最小化します。スペクトル取得が終了したら、最適化されたパラメータを使用して自由誘導崩壊を処理し、リン脂質共鳴の全範囲で最良の結果を得ることができます。少なくとも 2 つの異なるフィルタリング手順を使用して処理を繰り返します。最後に、非常に弱くて幅の広い信号を、化によって大きなオーバーラップなしにフィルタリングして、信号対雑音比を向上させます。この実験では、非常に混雑した領域でも分析されたすべてのスペクトル領域について、非常に狭いスペクトル線が得られました。0.01 P PP M 未満の距離のピークは、400 メガヘルツでほぼ完全に分離可能です。その結果、現在割り当てられていない多数の小さなピークの定性的および定量的分析は、200.milimolarの代わりに1000millimolarを選択することにより、将来のラインの絞り込みを想定できます。CDTAが望まれましたが、297ケルビンではなく277ケルビンを選択することにより、リン脂質シグナルの重ね合わせがラインを狭めました。ケルビンが望まれましたが、リン脂質シグナルの重ね合わせももたらしました。CDTA濃度が200ミリモルから50ミリモルに減少しても、線幅がわずかに増加するだけで、化学シフトにはほとんど変化がありません。ただし、50ミリモルCDTA抽出物の組織濃度は、200ミリモルCDTA抽出物の半分であることに注意してください。比較的細い線を説明すると、かなりの濃度範囲をカバーする多数の定量化可能なリン脂質が検出されました。スペクトル分解能は、特定のピークの部分的な分裂を日常的に検出するのに十分です。その結果、将来的には、さらなるリン脂質サブグループの定性的および定量的分析が想定されます。この手順を試みる際には、最適な代謝物分析を保証するために、各ステップを細心の注意を払って実行することを覚えておくことが重要です。

metabolomic-analysis-rat-brain-high-resolution-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

微生物のプランクトンコミュニティからの代謝物抽出のための方法が示されています。コミュニティ全体のサンプリングが特別に用意されたフィルター上にろ過することにより達成される。凍結乾燥後、水性の水溶性代謝物が抽出されます。このアプローチは、自然または実験的な微生物群集のトランスオミクス研究への環境メタボロミクスの応用が可能になります。...

核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度

我々は、神経内分泌機能と遅延の長期的、誇張された恐怖反応、PTSD患者の特性に永続的な変化を明らかにする心的外傷後ストレス障害（PTSD）のラットモデルを記述します。動物モデルとここで説明する方法は、機械論的であるが、末梢白血細胞におけるバイオマーカーと、患者で測定することができない脳核中のバイオマーカー、缶を相関させるために有用である。...

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

プログレッシブ植民地化の手順は、さらにホストの肝代謝への影響を評価するために記述されています。肝代謝が高分解能マジック角スピニング（人事MAS）無傷の生検のNMRプロファイリングによって評価されている間植民地化は、NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄を評価することにより、侵襲的、非監視されます。...

無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。...

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

出典: Blanc, J., et al. ウィスカ活性化中のラット樽皮質における7Tでの機能的磁気共鳴分光法J. Vis. 経験。...

ウィスカー刺激中のラットバレル皮質の機能的磁気共鳴分光法

小動物陽電子放出断層撮影法は、脳の2つの主要なエネルギー基質であるグルコースとケトンの評価を可能にします。本方法では、11種類のC-アセト酢酸と18種類のF-フルオロデオキシグルコースを各動物に順次注入し、磁気共鳴画像から決定される特定の脳領域におけるそれらの取り込みを定量的に測定します。...

ラットにおける局所脳エネルギー基質取り込みの定量的測定のためのデュアルトレーサーPET‐MRIプロトコル

(呼ばれる S1BF) 対応する体性感覚バレル フィールド皮質領域が正しく磁気共鳴イメージング (大胆な fMRI) 活性化、主要な血の酸素のレベルに応じた機能によるチェック後本研究の目的は乳酸含量を定量化するにはローカライズされたプロトン磁気共鳴分光法 (1H-MRS) 7 t...

7 機能的磁気共鳴分光ウィスカ アクティベーション中にラットのバレル皮質の T

我々は、新生ラット脳組織を処理して、神経終末におけるシナプス小胞分布の morphometric...

Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析

本プロトコルは、低用量のイソフルランを用いたラットから安定した安静状態機能的磁気共鳴画像法(rs−fMRI)データを得るための方法を、低用量デクスメデトミジンと組み合わせて説明する。...

ラットにおける安静状態機能磁気共鳴画像データの取得

この論文では、植物の代謝プロファイリングにおけるPSYCHEとSAPPHIRE-PSYCHEの使用を紹介し、サンプル調製と最適なPure Shift...

ピュアシフト核磁気共鳴:植物メタボロミクスのための新しいツール

動的陽電子放出断層撮影法(PET)データを取得し、時間枠に再構成することで、単一被験者レベルでの代謝脳接続性分析が可能になります。ラット脳の[18F]FDG動的PETデータを取得し、対象ボリュームの時間活動曲線を抽出して接続性マトリックスを取得する方法を説明します。...

単一被験者レベルでの2-デオキシ-2-[18F]フルオロ-D-グルコース動的陽電子放出断層撮影法を使用した代謝脳接続性の研究

学ぶラット脳の高分解能メタボローム解析法。液体窒素凍結・メタノール・クロロホルム・水抽出後、変性タンパク質と有機溶媒を除去し凍結乾燥する。NMR分光法で詳細な代謝物プロファイルを取得し、神経化学疾患研究に貢献する。

組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析

さらに動画を探す