オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

この手順の全体的な目標は、in vivoで見られるものによく似た環境でオリゴデンドロサイト系統細胞の増殖と分化を調査することです。これは、最初に出生後初期のトランスジェニックマウスから4つの脳と小脳のスライス培養物を準備することによって達成されます。次に、スライス内の単一細胞を数時間から数日かけて画像化し、その増殖と分化の細胞ダイナミクスを視覚化します。

イメージング後、細胞のポストホック免疫組織化学を使用して、さまざまな細胞特性を決定します。最終的に、結果は、正常な条件下で、および薬理学的または遺伝的操作後の細胞増殖と分化のダイナミクスを示すことができます。この手法は、解離炭、ニューロンの培養、リーガ細胞系細胞などの既存の方法に対する主な利点は、スライス培養により、組織細胞の構造を維持しながら無細胞環境を操作できることです。

すべての動物の手順はガイドラインに従っており、解剖の少なくとも2時間前にコネチカット大学の施設の動物管理および使用委員会によって承認されています。組織培養インサートをそれぞれに6枚のウェルプレートで調製します。1ミリリットルのスライス培養培地をよく加え、解剖の少なくとも15分前にプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素の細胞培養インキュベーターに移します。

解剖バッファーを氷の上に置き、95%の酸素、5%の二酸化炭素ガスで泡立て始めます。また、すべてのツールとティッシュチョッパーが70%エタノールで滅菌されていることを確認してください。組織を、氷冷酸素化解剖バッファーを含む滅菌済みの35ミリメートル皿に移します。

次に、カミソリの刃を使用して、小脳と前脳を切断し、前脳と半球を隔てる前脳と小脳を矢状状に切り込みます。次に、手動チョッパーを使用して、4つの脳と小脳の冠状および矢状切片の厚さを300ミクロンにします。各動物は通常、6つの4つのブレインニンスライスと6つの小脳スライスを産みます。

理想的には、同じスライス内の灰白質領域と白質領域の両方を研究するために、脳梁の前方の3分の1にまたがるスライスを取ります。分離したスライスを、バッファー内の氷上の新たに泡立たせた冷解剖バッファーに、小さな解剖または計量スパチュラを使用して移します。個々の切片を分離し、インキュベート済みに移します。

培養インサートが入った6つのウェルディッシュ。1つの培養物に2〜3枚のスライスを置くことができます。培養物の表面から余分な解剖バッファーをピペットで取り除きます。

プレートをインキュベーターに挿入し、固定されるまで移します。スライス培地は、スライス調製の1日後に交換し、その後、プロトコルに記載されているようにスライスが固定されるまで1日おきに交換する必要があります。実験にもよりますが、5〜7日後にスライスを使用してください。

文化で。最初の数日で透明になるスライスのみを使用し、肉眼で不均一な不透明な領域があるスライスは破棄します。対照的に、これらの不透明な領域は暗い細胞の塊として現れます。

正しく実行すれば、死んだ不透明領域はスライスの1〜5%以下に発生します。NG 2細胞の増殖と分化のタイムラプスイメージングを行うには、NG 2細胞でEGFPを発現するマウスの3〜5日齢のスライスを使用します。スライドが摂氏37度を下回らないように15分以上

イメージングセッションごとに、プレートを閉じたまま、倒立蛍光顕微鏡の10倍対物レンズを使用して、最初に画像をキャプチャします。文化のポイント。スライスの灰白質領域と白質領域の両方から、各スライスの 4 つから 8 つの位置を画像化します。

また、スライスのエッジ、特定のセル、白質路の向きなど、移動の目的で有用なランドマークを画像化します。前回の時点画像は、NG細胞の2細胞分裂やオリゴデンドロサイトの分化のための再配置時の参考画像として活用できます。4〜6時間ごとに、理想的には5〜7日間、画像をキャプチャします。

誘導マーカーNG2クレ、ER YFPを用いる場合は、100ナノモルの培地を用いてレポーター発現を誘導する。エタノールレポーター活性に溶解した4つのヒドロキシタモキシフェンは、1〜2日以内に現れるはずです。固定のために、培養物の底に1ミリリットルの固定剤を加える。

スライスの上に別のミリリットルを挿入して追加します。固定剤を直接スライスに噴射すると、スライスが剥がれる可能性があります。ティッシュを摂氏4度で30分間固定し、次にメスを使用します。

スライスを取り付けた状態でメンブレンを切り取ります。ピンセットを使用して、PBSを充填した24ウェルプレートの個々のウェルにスライスを慎重に移します。次に、スライスを、PBS中の5%正常ヤギ血清と0.1%トリットンX 100を含むブロッキング溶液を充填した2番目の24ウェルプレートに移します。

それらをブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートします。ブロックしたら、スライスをPBSの一次抗体(5%NGS)を充填したプレートに移します。翌日、摂氏4度で一晩インキュベートします。

スライスをPBSで洗います。次に、スライスを5%NGSのPBS中の二次抗体とインキュベートします。インキュベーションを室温で1時間放置します。

これに続いて、前と同じようにPBSでさらに3回洗浄し、メンブレンがスライドに面してスライスをマウントし、対物レンズと組織の間に入らないようにします。オリゴデンドロサイトの分化の時間的動態を解析するために、P8 NGクリーグトランスジェニックマウスの前脳のスライス培養物からNG2細胞分裂の画像を複数日にわたって取得し、122時間にわたるタイムラプス配列を撮影した。分裂した細胞の表現型は、NG 2抗体とCC 1抗体で決定しました。

細胞増殖は、細胞増殖マーカーの免疫組織化学染色を使用しても評価されました。NG 2 CRE YFPマウスのスライスにおけるCRE組換えの誘導後に、NG 2細胞のKI 67ベイトマッピングを行った。4つのヒドロキシタモキシフェンを追加した後2日。

YFPレポーターはNGを発現する2つの陽性細胞を培養中に発見した。4日後、これらの細胞の一部がCC 1陽性のオリゴデンドロサイト細胞に分化した。成熟したオリゴデンドロサイトをP-L-P-D-Sの小脳スライス培養物でイメージングしました。

これらの培養物には、赤マウスの有髄パーキンニューロンが存在していました。反復イメージングにより、これらのスライスにミエリン化DS赤色を発現するオリゴデンドロサイトの免疫組織化学を添加すると、ミエリン塩基性タンパク質の実質的な発現が示されました。最後に、より高い時間分解能のイメージングにより、遠位プロセスにいくつかの小さな動きを伴う安定したオリゴデンドロサイト細胞体が明らかになりました。

このビデオを見れば、4つの脳と小脳の両方からスライス培養物を調製し、数日から数時間にわたって単一細胞を繰り返しイメージングし、ポストホー免疫組織化学を用いて画像細胞の運命を解析する方法を十分に理解できるはずです。イメージングに加えて、これらのスライスは、調製されたスライスでの誘導性クリーム組換えなどの運命マッピング技術を使用しながら、細胞環境の操作も可能にします。