Name: オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶオリゴデンドロサイト系細胞の増殖と分化のダイナミクスを、生体に近い環境で維持する器官型スライス培養法。この方法では新生マウスの前脳と小脳のスライスを用いて、組織構造を保ちながら細胞の動態を可視化し、薬理的・遺伝的操作の影響を評価できます。

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この研究は、全米多発性硬化症協会（RG4179からA.N.へ)、国立衛生研究所（NIH R01NS073425およびR01NS074870からA.N.へ）および国立科学財団）からの助成金によって資金提供されました。 Frank Kirchhoff博士(ザールラント大学、ホンブルク、ドイツ)にPLPDsRedトランスジェニックマウスを提供していただいたことに感謝します。トランスジェニックマウスコロニーの維持に協力してくれたYoufen Sunに感謝します。

注：すべての動物の手順は、ガイドラインに従っているとコネチカット大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されている。 注：それぞれ用いたYFPレポーター20（JAX＃006148）ライン：これらの実験のために、構成NG2cre 18（JAX番号008533）および誘導性NG2creER 16（JAX番号008538）トランスジェニックマウスは、Z / EG 19（JAX＃003920）またはgtRosa26交配画像NG2細胞とその子孫。画像成熟したオリゴデンドロサイトには、21を使用したトランスジェニックマウスをPLPDsRed。一貫性の生存のために、スライスは、アップ前脳と小脳の両方から生後10日目にマウスから単離することができる。 1スライスの準備<ol><li>培養フード中で、6ウェルプレート中で組織培養インサートを配置し、1mlのスライス培養培地（試薬セクションのレシピ）を加える。解剖の前に、5％CO 2を少なくとも2時間、37℃で細胞培養インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li> 70％エタノールですべてのツールと​​組織チョッパーを滅菌する。 </li><li>解剖の前の開始に少なくとも15分間、氷上で95％O 2、5％CO 2をバブル解剖バッファー（試薬セクションのレシピ）。 </li><li>承認された動物プロトコールに従って5〜10分間氷上に置くことにより仔マウスを麻酔。マウスは尾とつま先のピンチに応答しないことを確認することにより麻酔の適切な深さを確かめる。 </li><li>動物プロトコールに従って鋭いハサミを使って動物を首を切る。すぐに滅菌ツールを使用して、第一横切開に続いて矢状カットを行うことで、前脳および小脳の上の頭蓋骨を削除します。慎重に側に組織を圧延することにより、脳と小脳の腹側表面から脳神経をカットします。 </li><li>氷のように冷たい酸素添加解剖バッファーを含む滅菌35mmの皿に組織を置きます。 </li><li>カミソリの刃を使用して、小脳および前脳を切断。その後半ば矢状カットのthroを作る前脳および小脳ぐふ、半球を分離する。 </li><li>手動の組織チョッパーで前脳と小脳の300μmの厚さの冠状および矢状断面をカットします。注：手動の組織チョッパーをアガロース包埋を必要とせずに培養インキュベーション解剖からの迅速な処理を可能にする。以前に説明したように9ビブラトームを使用することもできる。 </li><li>氷の上に新鮮に泡立て冷たい解剖バッファーに分けスライスを転送します。 </li><li>各部を分離し、培養インサートで6ウェル皿をプレインキュベートするためにそれらを転送するために、小さな解剖や計量へらを使用してください。 </li><li>使い捨てトランスファーピペットまたはP 200ピペットチップを用いて培養インサートの表面から余分な解剖バッファを削除します。 2〜3前脳または三小脳スライスが1つの培養インサート上に配置することができる。 注：前脳文化と一貫性のある結果のためには、脳梁の前三分の一にまたがるスライスを取ることが理想的である（ 図1A）は、同じスライス内の両方の灰白質と白質の領域を研究するためである。各動物は、通常6前脳スライスと6小脳スライスが得られます。 </li><li>インキュベーター中で6ウェルプレートを置き、スライス固定されるまで一日おきに、次にスライス標本後にスライス培地1ml 1日とスライス培地を交換し。 </li><li>実験によっては、培養中の5-7日後にスライスを使用。最初の数日後に透明になるだけのスライスを使用し、不均一な不透明領域を有するものを捨てる​​。注：スライス内の不透明な領域は、目で表示され、位相差の下で暗い細胞の塊として表示されます。技術が習得された後、死んで不透明なスライスはスライス未満の1〜5％で、めったに起こらない。 </li></ol> 2 NG2細胞分裂のタイムラプスイメージングおよびオリゴデンドロサイト分化注：私たちはNG2creを使用NG2細胞の増殖および分化のタイムラプスイメージングを実行するには：ZEGマウス16NG2細胞およびそれらの子孫（ 図1C-E）でEGFPを発現する。この行のレポーター発現は、直ちに少なくとも4週間の期間にセクショニングの後のスライスでGFP +細胞のライブ画像を得るために十分に堅牢である。鮮明な画像を、培養の最初の3〜5日間で発生したスライスの初期間伐期間後に得られる。 <ol><li>実験の間、37℃で細胞培養インキュベーター内のスライスを維持し、時間の短い期間だけ除去（スライスあたり15分未満）、6ウェルプレートに蓋をしながら撮影を維持する。 </li><li>デジタルカメラを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて、10×対物レンズを用いて第1の時点の画像を取り込む。注記：ファーストタイムポイントは、実験によって異なりますし、後の切片を調製した日またはどの時点であってもよい。 </li><li>スライスの両方グレーと白質領域に時点1での複数の領域から画像をキャプチャします。目に注意してくださいE領域は、スライス内の特定のランドマークによって、後続のイメージングセッションのために使用することができ、回路図に画像の位置をマッピングすることによって画像化した。有用なランドマークは白質路のスライスおよび/または方向のエッジを含むことができる。画像各時点における各スライス上の四から八箇所。 </li><li> NG2細胞の分裂とオリゴデンドロサイト分化を調べる場合には、理想的には上の5-7日、4〜6時間の間隔で次の画像をキャプチャします。 </li><li>すべての地域の最終的な画像をキャプチャし、すぐにスライスを修正します。その後のスライスの上に別の1ミリリットルを追加し、カルチャーインサートの底まで（0.1M L-リジン0.01Mのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて4％PFA）固定液1ミリリットルを加える。それが膜から切り離すことができますように、スライスの上に直接固定液を噴出しないように注意してください。 30分間、組織を固定し、4章で説明したように発達段階特異的マーカーを用いた免疫組織化学を進める。 </li><li> 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液3×10 mを有する洗浄スライスインチ1-3日間、0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液中に4℃で必要に応じて、店舗のスライス24時間以内に染色を行う理想的に免疫染色が、前に。 4章で後述のように、オリゴデンドロサイト（ 図2D-F）に分化した細胞の割合を決定するために、免疫組織化学を続行します。 </li></ol>スライス培養で誘導レポータートランスジェニックマウスを使用したNG2細胞子孫の3運命のマッピング注：培養物中の特定の時点からNG2細胞の運命を追跡するために、誘導性NG2creER：YFPトランスジェニックマウスを使用することができる。 <ol><li>培養培地に、エタノールに溶解した100nMの4OHTを追加することによって、Cre組換えおよびレポーター発現を誘導する。注：レポーター陽性細胞は〜20〜25％YFP + NG2 + / NG2 +細胞の誘導効率で1〜2日以内に表示されますと、この時点ですべてのNG2細胞段階における細胞（ 図2A〜C）になります</li><li>スライスを修正し、洗う異なる時点での、さまざまな操作をした後に（セクション2.5および2.6に記載されている）。 </li></ol> 4。スライス免疫組織化学<ol><li>メスを用いて、インサートの外に取り付けられたスライスを有する膜をカット。 </li><li>膜をピックアップする際のスライスの組成を破壊しないように注意しながら、ピンセットのセットを用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有する24ウェルプレートの各ウェルにスライスを転送する。 </li><li> 1時間PBS中の5％正常ヤギ血清（NGS）および0.1％トリトン-X100を含有するブロッキング溶液で24ウェルプレートにスライスを転送する。 </li><li> 4℃で、PBS中の5％NGS中の一次抗体でO / N内のスライスをインキュベートする。 NG2細胞段階における細胞を同定するために、NG2およびPDGFRαに対する抗体を使用しています。分化したオリゴデンドロサイトを識別するための、大腸腺腫性ポリポーシス抗原に対する抗体を使用する（APC;クローンCC1）を。 </li><li> PBS 3×15分で二日目の洗浄スライス上で、その後二次antiboでインキュベート室温で1時間、PBS中の5％NGSで死ぬ。 PBS 3×15分でスライスを洗浄し、スライド上にマウントします。膜は客観的かつ組織との間にされないようにスライドが直面しているスライスアップと膜とのマウント。 </li></ol>

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<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している

中枢神経系の髄鞘形成は、効率的な神経細胞のコミュニケーションと軸索の生存22に不可欠である。 25 -ほとんどの脳領域16,23における居住人口を維持しながら、NG2細胞は、継続的に大人になってミエリンオリゴデンドロサイトを生成します。これらの細胞の分化を調節するいくつかの遺伝的および分子メカニズムを説明してきたが、多くは発見されていない。器官型スライス培養は、これらの解剖学的領域を維持することの彼らのユニークな特性のためのメカニズム、細胞外環境の容易な操作、堅牢髄鞘、すべての主要な細胞型の存在を調査するための便利なツールです。これらの特性は、NG2細胞、オリゴデンドロサイトおよび軸索11,26間の短期および長期的な相互作用の研究を促進する。さらに、細胞移植は、実行するのが比較的容易であり、領域依存dは調査するために使用することができ細胞の挙動17にifferences。さらに、薬理学的治療は、正常17,27,28にNG2細胞の増殖および/ ​​または分化に影響する分子機構および脱髄培養物15,2...

4 -中枢神経系のOrganoytpicスライス培養はsemiintactシステム1において、ニューロンおよびグリア細胞生物学を研究するために極めて有用であることが証明されている。 9 -これらの培養物を採用し、そのような細胞外環境の操作を繰り返し、長期生細胞イメージングのための容易なアクセスおよび電気生理学的記録5と、一次解離細胞培養の多くの利点を保持することは比較的簡単である。また、スライス培養は、3次元組織細胞構築、地域の神経接続を維持し、ほとんどの主要な細胞型がシステムに存在している。これらの特性は、これらの培養ユニークで便利なシステムは、セルラーと環境の相互作用を持つ単一細胞の挙動や生理学を調査することにします。 NG2細胞は増殖およびmを生成し続ける、哺乳動物の中枢神経系におけるグリア細胞の集団である胚および生後発育10の間にオリゴデンドロサイトをyelinating。それらは、広範囲に解離した初代細胞培養物において研究されており、蛍光タンパク質のNG2細胞特異的発現を有するトランスジェニックマウス系統の最近の開発は、急性スライス標本におけるインビボでの運命マッピングおよび電気生理学的記録に容易になった。でも、これらの研究で、少しはNG2細胞の増殖およびオリゴデンドロサイト分化の時間的なダイナミクスについてはほとんど知られていない。解離した細胞培養が広く薬理学的および遺伝的操作の相対的機能のために使用されるが、それは細胞の微小環境のコンテキストを維持することが望ましい場合に特に異なる脳領域におけるこれらの細胞の機能的な違いを問い合わせるには適していない。スライス培養は、細胞の薬理学的操作に適しているとオリゴデンドロサイトミエリン形成11,12を調査するために使用されている単純な代替物を提供する（LPC）をリゾレシチンまたは抗体誘発性脱髄13,14、および薬理学的治療15を介して再ミエリンの誘導後ウラル応答。 前脳および小脳の両方から採取した器官型スライス培養におけるNG2細胞増殖およびオリゴデンドロサイト分化の分析をライブイメージングし、固定組織（または後固定）を調査し、実行するための方法が記載されている。これは、分割後に単16 NG2細胞の細胞運命を研究するために、成長因子誘導されるNG2細胞増殖の17地域および年齢依存性の違いを発見するために使用できる強力な方法である。この比較的単純な技術はさらに、これらのグリア細胞の生理学および神経活動またはミエリン損傷への応答を調節する細胞内因性および/または環境のメカニズムを調査する、広くアクセス可能です。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Slice Culture Medium</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank'S Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0.4mM</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30074.03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">NaOHでpH 7.22に滴定し、ボトルトップフィルターでフィルターし、摂氏</td></tr><tr>4度で保存<td colspan="4">Dissection Buffer</td></tr><tr><td>NaCl Sigma-Aldrich</td><td></td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (無水)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>アデノシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">Filter ボトルトップフィルター付きで、摂氏4度で保存し、95%O25%CO2で酸素化します</td></tr><tr><td colspan="4">Other Reagents and Supplies</td></tr><tr><td>4-hydroxy tamoxifen (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0.1M</td></tr><tr><td>メタ過ヨウ素酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0.01M</td></tr><tr><td>ウサギ抗NG2抗体</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Mouse anti CC1 antibody</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>マウス抗Ki67抗体</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>マウス抗NeuN抗体</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>種特異的二次抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td></td><td></td><td>5%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr><tr><td>封入剤DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ミリセル培養メンブレンインサート付き 0.45&mu;m 細孔径</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2 ガスミックス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌 6 ウェルプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖(海馬)または計量ヘ</td><td></td><td></td><td></td>ラ</tr><tr><td>手動または自動ティッシュチョッパー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てトランスファーピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mmおよび60mmの滅菌ペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆位相顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>層流、フード</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>組織培養インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>倒立、蛍光、マイクロコープ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2を発現する細胞（polydendrocytes、オリゴデンドロサイト前駆細胞）は、中枢神経系における第四の主要なグリア細胞集団である。胚および生後発育の間、彼らは積極的に増殖し、ミエリンオリゴデンドロサイトを生成します。これらの細胞は、一般的に、一次解離し文化、ニューロン共培養において、および固定された組織で研究されてきた。新たに利用可能なトランスジェニックマウス系統は、培養系をスライス使用すると、前脳および小脳の両方の灰白質と白質領域においてオリゴデンドロサイト系譜細胞の増殖および分化を調査するために使用することができる。スライス培養は、生後初期のマウスから調製され、最大1ヶ月間培養物中で維持される。これらのスライスは、細胞の挙動および相互作用を調査するために、培養期間にわたって複数回撮像することができる。この方法は、NG2細胞分裂の可視化との詳細な分析を可能にしながら、オリゴデンドロサイト分化を導くステップ地域に依存可能にするカミカゼNG2細胞とオリゴデンドロサイトの機能異質。これは、密接にインビボで見出さことに似ている細胞環境において経時的にこれらの細胞に影響を与える内因性および外因性のシグナルを調査するために使用することができる強力な技術である。

ZEG、NG2creER：YFP及びPLPDsRedトランスジェニックマウス系統の代表的なデータの例は、P8 NG2creの前脳および小脳の両方からスライス培養を用いて得られたその下に示す。 NG2細胞は、前脳および小脳切片における日間（ 図1B-D、ビデオ1）の上に画像化することができ、これらの細胞の表現型は、固定およびNG2およびCC1抗体による免疫染色（ 図1E）後に決定することができる。リアルタイム画像に加えて、細胞増殖はまた、Ki67に（ 図1F）のような細胞増殖マーカーについて免疫組織化学的染色を用いて評価することができる。これらのデータは、個別のセル単位でNG2の細胞分裂後のオリゴデンドロサイト分化の時間的な動力学の詳細な分析を可能にする。 YFPマウス（ 図2）：NG2細胞の運命マッピングはNG2creERで4OHTでスライスにおけるCre組換えの誘導後に行うことができる。 YFPレポーター発現NG2 +の細胞は、foをした二日間の培養培地（ 図2A）...

前脳と小脳のスライス培養システムを使用してNG2細胞とオリゴデンドロサイトを研究する技術が説明されています。 この方法により、オリゴデンドロサイト系統内の細胞の増殖と分化のダイナミクスを調べることができ、組織の細胞構造を維持しながら細胞外環境を容易に操作できます。

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

この手順の全体的な目標は、in vivoで見られるものによく似た環境でオリゴデンドロサイト系統細胞の増殖と分化を調査することです。これは、最初に出生後初期のトランスジェニックマウスから4つの脳と小脳のスライス培養物を準備することによって達成されます。次に、スライス内の単一細胞を数時間から数日かけて画像化し、その増殖と分化の細胞ダイナミクスを視覚化します。イメージング後、細胞のポストホック免疫組織化学を使用して、さまざまな細胞特性を決定します。最終的に、結果は、正常な条件下で、および薬理学的または遺伝的操作後の細胞増殖と分化のダイナミクスを示すことができます。この手法は、解離炭、ニューロンの培養、リーガ細胞系細胞などの既存の方法に対する主な利点は、スライス培養により、組織細胞の構造を維持しながら無細胞環境を操作できることです。すべての動物の手順はガイドラインに従っており、解剖の少なくとも2時間前にコネチカット大学の施設の動物管理および使用委員会によって承認されています。組織培養インサートをそれぞれに6枚のウェルプレートで調製します。1ミリリットルのスライス培養培地をよく加え、解剖の少なくとも15分前にプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素の細胞培養インキュベーターに移します。解剖バッファーを氷の上に置き、95%の酸素、5%の二酸化炭素ガスで泡立て始めます。また、すべてのツールとティッシュチョッパーが70%エタノールで滅菌されていることを確認してください。組織を、氷冷酸素化解剖バッファーを含む滅菌済みの35ミリメートル皿に移します。次に、カミソリの刃を使用して、小脳と前脳を切断し、前脳と半球を隔てる前脳と小脳を矢状状に切り込みます。次に、手動チョッパーを使用して、4つの脳と小脳の冠状および矢状切片の厚さを300ミクロンにします。各動物は通常、6つの4つのブレインニンスライスと6つの小脳スライスを産みます。理想的には、同じスライス内の灰白質領域と白質領域の両方を研究するために、脳梁の前方の3分の1にまたがるスライスを取ります。分離したスライスを、バッファー内の氷上の新たに泡立たせた冷解剖バッファーに、小さな解剖または計量スパチュラを使用して移します。個々の切片を分離し、インキュベート済みに移します。培養インサートが入った6つのウェルディッシュ。1つの培養物に2〜3枚のスライスを置くことができます。培養物の表面から余分な解剖バッファーをピペットで取り除きます。プレートをインキュベーターに挿入し、固定されるまで移します。スライス培地は、スライス調製の1日後に交換し、その後、プロトコルに記載されているようにスライスが固定されるまで1日おきに交換する必要があります。実験にもよりますが、5〜7日後にスライスを使用してください。文化で。最初の数日で透明になるスライスのみを使用し、肉眼で不均一な不透明な領域があるスライスは破棄します。対照的に、これらの不透明な領域は暗い細胞の塊として現れます。正しく実行すれば、死んだ不透明領域はスライスの1〜5%以下に発生します。NG 2細胞の増殖と分化のタイムラプスイメージングを行うには、NG 2細胞でEGFPを発現するマウスの3〜5日齢のスライスを使用します。スライドが摂氏37度を下回らないように15分以上。イメージングセッションごとに、プレートを閉じたまま、倒立蛍光顕微鏡の10倍対物レンズを使用して、最初に画像をキャプチャします。文化のポイント。スライスの灰白質領域と白質領域の両方から、各スライスの 4 つから 8 つの位置を画像化します。また、スライスのエッジ、特定のセル、白質路の向きなど、移動の目的で有用なランドマークを画像化します。前回の時点画像は、NG細胞の2細胞分裂やオリゴデンドロサイトの分化のための再配置時の参考画像として活用できます。4〜6時間ごとに、理想的には5〜7日間、画像をキャプチャします。誘導マーカーNG2クレ、ER YFPを用いる場合は、100ナノモルの培地を用いてレポーター発現を誘導する。エタノールレポーター活性に溶解した4つのヒドロキシタモキシフェンは、1〜2日以内に現れるはずです。固定のために、培養物の底に1ミリリットルの固定剤を加える。スライスの上に別のミリリットルを挿入して追加します。固定剤を直接スライスに噴射すると、スライスが剥がれる可能性があります。ティッシュを摂氏4度で30分間固定し、次にメスを使用します。スライスを取り付けた状態でメンブレンを切り取ります。ピンセットを使用して、PBSを充填した24ウェルプレートの個々のウェルにスライスを慎重に移します。次に、スライスを、PBS中の5%正常ヤギ血清と0.1%トリットンX 100を含むブロッキング溶液を充填した2番目の24ウェルプレートに移します。それらをブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートします。ブロックしたら、スライスをPBSの一次抗体(5%NGS)を充填したプレートに移します。翌日、摂氏4度で一晩インキュベートします。スライスをPBSで洗います。次に、スライスを5%NGSのPBS中の二次抗体とインキュベートします。インキュベーションを室温で1時間放置します。これに続いて、前と同じようにPBSでさらに3回洗浄し、メンブレンがスライドに面してスライスをマウントし、対物レンズと組織の間に入らないようにします。オリゴデンドロサイトの分化の時間的動態を解析するために、P8 NGクリーグトランスジェニックマウスの前脳のスライス培養物からNG2細胞分裂の画像を複数日にわたって取得し、122時間にわたるタイムラプス配列を撮影した。分裂した細胞の表現型は、NG 2抗体とCC 1抗体で決定しました。細胞増殖は、細胞増殖マーカーの免疫組織化学染色を使用しても評価されました。NG 2 CRE YFPマウスのスライスにおけるCRE組換えの誘導後に、NG 2細胞のKI 67ベイトマッピングを行った。4つのヒドロキシタモキシフェンを追加した後2日。YFPレポーターはNGを発現する2つの陽性細胞を培養中に発見した。4日後、これらの細胞の一部がCC 1陽性のオリゴデンドロサイト細胞に分化した。成熟したオリゴデンドロサイトをP-L-P-D-Sの小脳スライス培養物でイメージングしました。これらの培養物には、赤マウスの有髄パーキンニューロンが存在していました。反復イメージングにより、これらのスライスにミエリン化DS赤色を発現するオリゴデンドロサイトの免疫組織化学を添加すると、ミエリン塩基性タンパク質の実質的な発現が示されました。最後に、より高い時間分解能のイメージングにより、遠位プロセスにいくつかの小さな動きを伴う安定したオリゴデンドロサイト細胞体が明らかになりました。このビデオを見れば、4つの脳と小脳の両方からスライス培養物を調製し、数日から数時間にわたって単一細胞を繰り返しイメージングし、ポストホー免疫組織化学を用いて画像細胞の運命を解析する方法を十分に理解できるはずです。イメージングに加えて、これらのスライスは、調製されたスライスでの誘導性クリーム組換えなどの運命マッピング技術を使用しながら、細胞環境の操作も可能にします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

これは、錐体ニューロンから電気記録を作成する目的のための器官培養における新皮質スライス標本を準備し、維持するためのプロトコルです。...

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

このビデオは、細胞傷害性CD8+ T細胞を介して脳細胞死を誘発するex vivo技術を示しています。脳スライスを取得すると、活性化されたオリゴデンドロサイト指向性CD8+...

オリゴデンドロサイト特異的CD8+ T細胞を介して神経細胞死を誘導するex vivo技術

出典:Kennedy, L. H., et.al. アデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた器官型脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトオルガネラの可視化とライブイメージング。J. Vis. Exp.

器官型脳スライス培養におけるオリゴデンドロサイト内のミトコンドリア運動の共焦点イメージング

炎症性脱髄障害の皮質病変における脱髄とニューロンのアポトーシスのメカニズムに対処するために、異なる動物モデルが使用されます。ここでは、オリゴデンドロサイト特異的なCD8+ T細胞を脳切片に使用して、オリゴデンドログリアとニューロンの死をもたらすex...

アンエクスビボモデル

ここでは、器官型スライス培養技術を用いて海馬の出生後の神経新生を研究するための技術が記載されている。この方法では、成人の神経新生のin vitro操作を可能にし、培養海馬への薬理学的薬剤の直接適用することができます。...

生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

切片海馬スライス培養 (一部は、OHSC) は、体内の状況を非常によくシミュレートする生体外モデルを表します。ここで述べる vibratome...

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

ミエリンオリゴデンドロ サイトは、迅速な活動電位伝搬と神経細胞の生存を促進します。ここで説明した、切片蛍光タンパク質のオリゴデンドロ サイト固有表現のプロトコルです以降のタイムラプス...

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マウス小脳・髄鞘形成と中枢神経系検査のメカニズムを調査するため適切な免疫組織化学的染色ミエリン鞘からスライス培養切片を準備する方法をご紹介します。...

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学ぶオリゴデンドロサイト系細胞の増殖と分化のダイナミクスを、生体に近い環境で維持する器官型スライス培養法。この方法では新生マウスの前脳と小脳のスライスを用いて、組織構造を保ちながら細胞の動態を可視化し、薬理的・遺伝的操作の影響を評価できます。

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

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