Name: 質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学ぶSDS-PAGEと還元β脱離を用いたO結合型グリカンのゲル内抽出法。質量分析法による構造同定と定量が可能で、グライコミクス研究の効率化に貢献する革新的な手法です。

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この作業は、NHLBI/NIHからの助成金P01HL107151によって支援されました。また、著者らは、NIGMS/NIHからの助成金P41GM103490を通じて提供された機器への支援とアクセスに感謝します。

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<li>Kuster, B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O-labeling+of+N-glycosylation+sites+to+improve+the+identification+of+gel-separated+glycoproteins+using+peptide+mass+mapping+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching.</a> Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).</li>
<li>Aoki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+O-linked+glycans+expressed+during+Drosophila+melanogaster+development+reflects+stage-+and+tissue-specific+requirements+for+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).</li>
<li>Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+peeling+during+the+release+of+O-glycans+by+hydrazinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis.</a> Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).</li>
<li>Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+analysis+of+O-linked+oligosaccharides+from+glycoproteins+and+mucins+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis.</a> Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).</li>
<li>Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+glycosylation+in+human+saliva+reflects+blood+group+and+secretor+status%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status.</a> Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).</li>
<li>Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+O-linked+glycans+released+directly+from+glycoproteins+in+gels+using+in-gel+reductive+%CE%B2-elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination.</a> Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).</li>
<li>Anumula, K. R., Taylor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+procedure+for+preparation+of+partially+methylated+alditol+acetates+from+glycoprotein+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).</li>
<li>Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+developmental+elaboration+of+N-linked+glycan+complexity+in+the+Drosophila+melanogaster+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo.</a> J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).</li>
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<li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR%3A+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li>
<li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li>
<li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+mucin+MG1+%28MUC5B%29+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li>
<li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li>
<li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+%CE%B2-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

ゲル内還元的β除去と有機水抽出を組み合わせることで、SDS-PAGEによって他のタンパク質から分解された少量のムチン型糖タンパク質から採取された硫酸化および非硫酸化O結合型糖鎖を特徴付けるために取得できる構造データの感度と深さが向上します。この研究で提示された技術的アプローチの本質的な進歩は次のとおりです。(a)簡単な洗浄ステップによるゲル由来の汚染物質の容易な除去。(b)水-DCMの急速分配後の水相中のペルメチル化スルホグリカンの定量的回収。ここで説明するワークフローは、生体サンプル中の生理学的レベルで発現する糖タンパク質から放出される硫酸化糖鎖および非硫酸化糖鎖の検出感度を劇的に向上させます。 
ここで説明する方法は、標準的な分析方法に細心の注意を払って適用すると堅牢で再現性が高いですが、汚染源の可能性に関するいくつかの考慮事項を簡単に言及する価値があります。すべてのガラス製品が非常に清潔で、ほこりや洗剤が付着していないことを確認することが重要です。MSスペクトルに汚染物質のピークがあることに気付いたら、すべてのガラス器具を徹底的に洗浄し、最終乾燥前にMeOHですすいでください...

グリコシル化は、生物生理学、組織病 ​​理学、および細胞認識1-3に貢献し、必須タンパク質の翻訳後修飾である。分析糖鎖の主要な進歩にもかかわらず、特定のタンパク質上のグリカンの完全な多様性を特徴づけることは、特に主要な生物学的供給源から単離されたタンパク質に、極めて困難な課題である。それにもかかわらず、糖タンパク質グリカンの微小不均一性は、頻繁に他のタンパク質との機能的相互作用に影響を与えます。したがって、グリカン多様性の特徴付けは、細胞および組織のグリコシル4,5の生理的意義を理解するために不可欠である。組織の生理学および病態生理学、堅牢敏感な、包括的なglycomic分析技術の糖タンパク質のグリコシル化の寄与を理解するためにますます重要になってきた。プロテオーム解析では、タンパク質同定は、一般的LC-MSにより達成されるトリプシンペプチド6の/ MS分析。タンパク質消化は、7-9トリプシンなどのプロテアーゼによるゲル内消化後のSDS-PAGEによって分離精製されたタンパク質またはタンパク質を用いて行うことができる。 SDS-PAGEによるタンパク質混合物の予備濃縮は、タンパク質IDの深さと正確さを向上させます。糖タンパク質グリコシル化のglycomic分析のための類似の戦略の開発は、糖質科学の最前線に位置しています。 グリカンの2つの主要なクラスは、N-連結またはO-連結のいずれかを介してタンパク質主鎖に結合している。 N結合型グリカンは、アスパラギンに結合しているアスパラギン（Asn）のAsn-X-Ser / Thr / Cysをとして定義シークの一部として見出される残基は、（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である）、そしてペプチド- Nによる酵素消化により放出させることができる-glycanase（PNGアーゼFまたはA）、いずれの溶液中で、ゲル内、またはオンブロット10-12。 O結合型グリカンは主にセリン（セリ​​ン）またはトレオニン（スレオニン）残基に結合している。ただし、1つの酵素は、IDENされている糖タンパク質のO-結合グリカンを放出することが可能であり、それは唯一の最も単純なO結合型グリカンを放出する、非常に限られたグリカン特異性を有するtified。化学物質放出戦略は、糖タンパク質のO-結合グリカンの包括的放出のための選択の方法のままである。還元的または非還元的β脱離、またはヒドラジンのよく特徴付けられた化学物質放出技術であり、現在糖タンパク質13,14からのO結合グリカンを放出するための最も一般的に使用されるアプローチである。還元的β脱離は、SDS-PAGEによって分離された糖タンパク質のO-結合グリカンを放出するために使用されてきたが、従来のアプローチは、その後の分析のために15〜17 HPLC分離を必要とした。 多次元MS（MS n）の分析では、現在、ほとんどの生物学的情報源から見込額で単離した糖タンパク質から放出されたグリカンを特徴付けるための構造データの最も豊富なソースを提供します。 MSの深さベースの構造的特徴が大幅に先立って彼らの分析にリリースグリカンをpermethylatingによって促進される。完全メチル化は、イオン化を強化し、グリカン構造18,19の幅広い分子のシグナル応答を等化する傾向がある。また、過メチル化は、明確にすることにより構造の解明20-23を高め、独特の大衆を持つ端末および置換単糖部分をタグ付けします。例えば、酸性グリカンはMSにより非過メチル化種として検出することが一般的に困難である。酸性グリカンMS負イオンモードで検出することができるが、同じイオンモードの両方で、酸性および中性グリカンを検出することは不可能である。グリカンの完全メチル化の主要な利点は、完全メチル化のように、グリカンの単糖置換基上の遊離ヒドロキシル基（OH）の全てがそれらのように検出可能にメチル基（OCH 3またはOMeで）、このようにしてシアル化グリカンの電荷が中和されるでキャップされることであるニュートラル（アジアLO）グリカン。しかし、sulfoglycans上の硫酸残基のヒドロキシルイオン化を抑制し、感度を低下させるアニオン電荷の保持をもたらす、完全メチル化に耐性がある。この抑制は、現在、そのような硫酸化グリカン24-26の高い存在を運ぶムチン、など非常に複雑な糖タンパク質の包括的なglycomic分析を防ぎます。 浄化硫酸化グリカン上の最近の報告では、逆相精製するクロマトグラフィーおよびMALDI分析の前に別々の過メチル化グリカン、充電に使用。この方法では、我々は、有機相分配よりもあまり厳密であることがわかってきた溶出のための異なる移動相を使用した硫酸化および非硫酸化グリカンの完全な分離に依存している。したがって、sulfoglycansの検出および濃縮のために適した新しい技術がここに提示されている。これらの技術は、水以下の水相中の硫酸化糖鎖の定量的回収を可能に：DCM（ジクロロメタン）日常グリカン過メチル化反応27の最後に行われ、抽出、。また、MS 2フラグメンテーションパターンを簡素化しながら、重要なことは、完全メチル化非硫酸化グリカンの混合物からの完全メチルsulfoglycansのこの堅牢な分離は、付随的に帯電した種のために豊かにします。改善されたゲル内O-結合グリカン分析のための総合的なプロトコルも提示されている。改良されたプロトコルがグリカンの回復を高め、過メチル化グリカンのMS n分析を通じて得られる構造情報を増加させ、生物学的な供給源から単離さ不可欠糖タンパク質に適用sulfoglycomic分析の感度を向上させます。 このプロトコルは、全体の糖タンパク質抽出物のO結合型グリカン分析のために、またはSDS-PAGEにより分離し、目的の特定の糖タンパク質のことを意図しており、3つの実験の手順で構成されている。 A）は、ゲルクリーンアップ、B）は、ゲル内還元的β脱離、およびC）糖鎖permethy設置と。目標は、生物学的に関心のある主要な供給源から採取された糖タンパク質のための総合的なO結合型glycomicデータ（ 図1）を得ることである。 SDS-PAGEによって分離された糖タンパク質を染色することによって視覚化され、目的のバンドを切り出し、得られたゲルのバンドを小片にスライスされる。ゲル片を脱染色し、ゲルの汚染物質（ 図2A）を除去し、酢酸エチルでの洗浄に供される。グリカン放出は、ゲル内還元的β脱離（ 図2B）によって達成され、遊離されたグリカンを完全メチル化されている。水性有機抽出後に過メチル化を定量的に離れて非硫酸ニュートラルグリカン（ 図2C）からのアニオン性硫酸化グリカンを仕切る。水性 - 有機溶​​媒抽出に結合されたゲル内還元的β脱離は、SDS-PAGEで分離した糖タンパク質の少量から放出されたO結合型グリカンとsulfoglycansの特徴付けを可能にします。戦略的な概要はsummariです図1および詳細におけるZEDは、 図2に示されている。また、脱染色し、洗浄し、ゲル片の部分は、通常のLC-MS / MSプロテオミクス技術によるタンパク質のIDのために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>水、脱イオン水</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>270733-4L</td><td>CHROMASOLV、HPLC</td></tr><tr><td>酢酸、Glacial</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td>認定ACS&ge;99.7% w/w</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34860-4L-R</td><td>CHROMASOLV、HPLC、&GE;99.9%</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Fluka</td><td>09830-500G</td><td>BioUltra、&ge;99.5%(T)、ステップ1</td></tr>アセ<tr><td>トニトリル</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34998-4L</td><td>CHROMASOLV Plus、HPLC用、&ge;99.9%、ステップ1</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>Fluka</td><td>34972-1L-R</td><td>LC-MS CHROMASOLV、ステップ1</td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム</td><td>Aldrich</td><td>213462-25G</td><td>ReagentPlus、99%、ステップ2</td></tr><tr><td>ヨードメタン</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>289566-100G</td><td>ReagentPlus、99.5%、&nbsp;ステップ6.&nbsp;4°Cで保管します。使用までC.&nbsp;室温で置いてからご使用ください。</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液、50% w / wフィ</td><td></td><td>ッシャーSS254-1</td><td>認定、ステップ6</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド、無水シ</td><td>グマ-アルドリッチ&nbsp;</td><td>276855-1L</td><td>無水、&ge;99.9%、ステップ6</td></tr>メタ<tr><td>ノール、無水</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>322415-100ML</td><td>無水、99.8%、ステップ6</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34856-4L</td><td>クロマゾール&reg;、HPLC用、&ge;99.8%、安定剤としてアミレンを含有、Step 7</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8水素形態水素100-200&nbsp;メッシュ</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>217506-500G</td><td>Step 3</td></tr><tr><td>AG 50W-X8 樹脂&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Step 3</td></tr><tr><td>BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg 固相抽出カラム、PP、オクタデシル (C18) 逆相</td><td>JT Baker</td><td>JT-7020-01</td><td>Step 5 and 8</td></tr><tr><td>7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>Step 1</td></tr><tr><td>Bio-Safe Coomassie Stain&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0786</td><td>G-250、質量</td></tr><tr><td>分析用ステップ1シルバーステインキット</td><td>Pierce</td><td>24600</td><td>ステップ1</td></tr><tr><td>オリゴ糖キット(マルトトリオース、Dp3:R474140)</td><td>Supelco&nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>オリゴ糖キット(マルトテトラオース、DP4:R474135)</td><td>Supelco&nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット、ガラス、ショートチップ</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>使用前に洗浄</td></tr><tr><td>PYREX 13 x 100 mm 使い捨て丸底ねじ込み培養チューブ</td><td>コーニング</td><td>99447-13</td><td>使用前に洗浄</td></tr><tr><td>PYREX 16 x 125 mm 使い捨て丸底ねじ込み培養チューブ</td><td>コーニング</td><td>99447-16</td><td>使用前に洗浄</td></tr><tr><td>フェノールキャップ/クロージャー、PTFE面ゴムライナー付き</td><td>Kimble</td><td>45066C-13</td><td>使用前に洗浄</td></tr><tr><td>フェノールキャップ/クロージャー PTFE面ゴムライナー付き</td><td>Kimble</td><td>45066C-15</td><td>使用前に洗浄</td></tr><tr><td>ハミルトンHPLCシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81265</td><td>ボリューム500&nbsp;&mu;l、針サイズ22 G</td></tr><tr><td>ハミルトンHPLCシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81165</td><td>ボリューム250&nbsp;&mu;l、針サイズ22 G</td></tr><tr><td>ハミルトンHPLCシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81065</td><td>ボリューム100&nbsp;&mu;l、針サイズ22s G</td></tr><tr><td>Hamilton HPLCシリンジ</td><td>HAMILTON</td><td>80965</td><td>ボリューム50&nbsp;&mu;l、針サイズ22s G</td></tr><tr><td>Hamilton較正シリンジ</td><td>HAMILTON</td><td>80300</td><td>ボリューム10&nbsp;&mu;l、針サイズ26s G</td></tr><tr><td>ペトリ皿ガラス 100 mm x 15mm</td><td>GSC INTERNATIONAL INC</td><td>1500-4</td><td>使用前に洗浄、ステップ1</td></tr><tr><td>Bard-Parker Surgical Blades</td><td>Fisher</td><td>371310</td><td>ステップ1</td></tr><tr><td>Reacti-Therm加熱/攪拌モジュール</td><td>ピアス</td><td>18870</td><td>ステップ1、4、7</td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td>Fisher</td><td>125D</td><td>ステップ2</td></tr><tr><td>パイレックスファイバーグラスウールホウケイ酸ポアサイズ8&nbsp;&mu;m</td><td>Aldrich</td><td>CLS3950</td><td>Step 3</td></tr><tr><td>溶融シリカカッターチューブカッター</td><td>alltech</td><td>3194</td><td>Step 3</td></tr><tr><td>マルチチューブボルテクサー&nbsp;</td><td>VWR</td><td>444-7063</td><td>ステップ 6</td></tr><tr><td>凍結乾燥機 25EL 凍結移動式</td><td>Virtis</td><td>25EL</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>VWR</td><td>Clinical 50</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Discovery</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

質量分析法による総合的なo-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

SDS-PAGEによるタンパク質の分離とそれに続く分離されたタンパク質バンドのゲル内タンパク質分解により、生物学的サンプルの高分解能プロテオミクス分析が可能になりました。SDS-PAGEで分離された糖タンパク質によって運ばれる糖鎖の詳細な分析を可能にする同様のアプローチでは、検出法として質量分析(MS)を使用する際に、回収率と感度を最大化するために特別な考慮が必要です。高品質なデータを得るために乗り越えなければならない大きなハードルは、MS分析の妨げとなるゲル由来のコンタミネーションの除去です。ここで紹介するサンプルワークフローは堅牢で効率的で、MSの前にインラインHPLCクリーンアップを行う必要がありません。標的タンパク質を含むゲル片をアセトニトリル、水、酢酸エチルで洗浄し、ポリマーアクリルアミドフラグメントなどの汚染物質を除去します。O-結合型糖鎖は、ゲル内還元的β脱離によって標的タンパク質から遊離され、堅牢で簡便なクリーンアップ手順によって回収されます。このワークフローの利点は、硫酸化糖鎖の検出と特性評価の感度が向上することです。これらの手順により、MS分析に先立って迅速な相分配により、非硫酸化(シアル化および中性)のペルメチル化糖鎖から硫酸化過メチル化糖鎖を効率的に分離し、SDS-PAGEで分離した糖タンパク質の糖鎖およびスルホグリコマイクス分析を強化します。

ゲル内還元的なβ-脱離前の酢酸エチル処理の影響
in-gel還元性β-脱離によりウシムチンから放出されたパーメチル化O-結合型糖鎖サンプルの代表的なマススペクトルを図3に示す。ゲル断片をEtOAcで洗浄することで、その後のMS分析を妨げるSDSおよびポリアクリル汚染物質を効果的に除去できる27。
<img alt="糖鎖分析のm/z比を示す質量分析グラフ。相対存在量のピークがラベル付けされている。" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 3"> 
図 3. ゲル内還元β-脱離前のポリアクリルアミドゲル断片の酢酸エチル洗浄により、遊離糖鎖の検出能が向上する。(<strong...

O結合型糖鎖の多様性を包括的に探求するために、ペルメチル化および迅速な相分配法と組み合わせた新しいゲル内還元的β除去の手順を、SDS-PAGEによって分離され、その後の質量分析による糖鎖分析に適した糖タンパク質から直接放出されるO結合型糖鎖の分析に適用されます。

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

improved-gel-reductive-elimination-for-comprehensive-o-linked-sulfo

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

免疫臓器や細胞内のスフィンゴ糖脂質抗原の発現プロファイルを洞察するための特異的かつ高感度の方法が記載されている。この方法は、化学的に合成された基準と比較して、構造解析のためのスフィンゴ糖脂質分子の段階的な断片化を許可するイオントラップ質量分析法を活用しています。...

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

血漿中のプロテオミクスとグライコミクスの精製、およびLC-MS/MS定量を組み合わせたハイスループットプロトコルが開発されました。N-結合型グリコシル化モチーフの脱アミド化解析は、脱グリコシル化部位に特異的でした。糖鎖ヒドラジドタグ法による標識では、フィルターを用いたN型糖鎖分離と個別性標準化を組み合わせることで、N型糖鎖の正確な定量が達成されました。...

定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略

このプロトコルは、酵素(エンドキシラナーゼ)加水分解の前にREを2つのアミノベンザミドでタグ付けし、その後、質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)を使用して得られたオリゴ糖を分析することにより、ヘテロキシランの還元末端(RE)および内部領域のグリコシル配列の構造特性評価に使用される特定の技術について説明しています。...

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

この記事は、GC-MSによる検出のために、糖鎖をそれらの構成結合特異的単糖類に化学的に分解することにより、未分画生体流体中の糖鎖のプール組成プロファイルを分析するように設計された新しいボトムアップグライコミクス技術の強化形を提示します。潜在的なアプリケーションには、がんやその他の糖鎖影響性疾患の早期発見が含まれます。...

糖鎖ノード分析：グライコミクスへのボトムアップアプローチ

ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。これらのリンケージによって安定化された多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析を介して行う。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS...

非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する

オープン検索は、これまで知られていなかった糖鎖組成で装飾された糖ペプチドの同定を可能にする。この記事では、 アシネトバクター・バウマンニを...

アシネトバクター・バウマンニO結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用

このプロトコールでは、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な複雑な腫瘍微小環境における不均一なグリコプロテオームに関する包括的な洞察を提供する統合オミクス技術である、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法について詳しく説明します。...

グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします 

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン O型糖鎖のプロファイリング

ミクログリア細胞からの精製ミトコンドリアの調製、 N型糖鎖放出のためのミトコンドリアタンパク質の単離、および赤外マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化と高分解能精密質量分析装置質量分析法を組み合わせた細胞内ミトコンドリア糖鎖の迅速な検出のためのプロトコールが開発されました。...

糖鎖分析のためのミクログリアからのミトコンドリア調製

エレクトロスプレーイオン化Orbitrap質量分析による、水銀(II)とジシステニルテトラペプチドの異なる相対比で形成された複合体の特性評価が提示されます。...

エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるDicysteinylテトラペプチドと水銀（II）の錯体の研究

学ぶSDS-PAGEと還元β脱離を用いたO結合型グリカンのゲル内抽出法。質量分析法による構造同定と定量が可能で、グライコミクス研究の効率化に貢献する革新的な手法です。

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

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