Name: 神経可塑性を誘導する治療法の評価のためのラットの皮質脊髄路の片側Pyramidotomy (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶラットの片側ピラミドトミーによる皮質脊髄路損傷モデル。神経可塑性と運動機能回復を評価する行動学的・組織学的手法を用い、中枢神経系損傷治療法の開発に貢献する実験手順です。

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倫理声明：すべての手順は、1986年の英国内務省と動物（科学的処置）法からのガイドラインに従った。 1.手術やけが注：外科医は動物が頻繁に彼らの術前の体重の10％以上を失う見つけた場合220グラムより重い使用したラットは術後の回復を支援することができます。 <ol><li>手術の前に、シリンダー飼育試験15またはモントーヤstaicaseテスト24との前足の好みのために動物をテストします。好ましくは、ピラミッド/支配的な前足に対応するCSTをカット。 ヒドロゲルパック、湿ったマッシュ、及び高カロリー食品のサプリメント：注：ラットは手術からの回復中に有益であろう食品に慣れるように、手術前の2日間、ケージに以下の項目を配置します。これらの栄養補助食品の滅菌のバージョンでは、さまざまなベンダーから提供されています。 </li><li>女性Lを麻酔酸素（：1.5リットル/分の流量）でイソフルランとジスタフード付きのラット（グラム200〜250の重さ）（誘導のための5％と保守のための百分の1から2）。注：麻酔薬の選択は重要です。吸入麻酔薬も一般的に使用されているケタミンよりも麻酔の深さをより迅速に規制を可能にする。イソフルランは、呼吸周波数及び深さの良好な制御を可能にする。麻酔薬の選択は、イソフルランである。注：外科医は動物が頻繁に彼らの術前の体重の10％以上を失う見つけた場合220グラムより重い使用したラットは術後の回復を支援することができます。 </li><li>動物は、炎症を軽減し、鎮痛を提供するために、麻酔鎮痛剤としてカルプロフェンの皮下に投与する。注：カルプロフェンは、当社の獣医師のアドバイスに従って、私たちの研究室でpyramidotomyの手術中に与えられている。オピオイドは手術中にさらに呼吸抑制を引き起こす可能性があります。 </li><li>ホームを使用して手術中に37℃で動物を維持othermicブランケットシステム及び直腸温度プローブ。 </li><li>足のピンチ引っ込め反射とまばたきをチェックすることにより、完全な麻酔を確認してください。 注：オプション：手術、挿管および換気中呼吸器系の問題に対抗するためには、実現可能性があります。しかし、気管が手術中に避難する必要があることに注意してください。 </li><li>麻酔をかけた後、腹、首を剃ると、1％クロルヘキシジンワイプおよび/またはアルコールワイプでそれを殺菌、仰臥位でラットを置く。動物の上に無菌外科毛布を適用し、常に無菌領域を維持する。 </li><li>麻酔をかけた後、仰臥位でラットを配置腹首を剃るし、1％クロルヘキシジンアルコールワイプでそれを滅菌する。動物の上に無菌外科毛布を適用し、常に無菌領域を維持する。 注：必要に応じて、ラットの頭が頭の移動を無効にするには、手術中の仰臥位で定位フレームに固定することができ、 すなわち後頭骨。 </li><li>滅菌メス（＃10）を用いて胸骨のほとんど吻側最後にあご2〜3センチの正中切開を行います。必要に応じて、皮膚を​​後退させる小さなブルドッグクランプを適用する。 </li><li>そのような鈍いはさみや歯鉗子でリバースアクションを使用して気管をカバーする腺（ 例えば顎下腺と耳下腺）と筋肉などの組織の上層を解剖鈍い。常に正中線に滞在。組織は簡単に分離する必要があります。 </li><li>気管が露出されると、一方の側に変位させる。正中線は、吻側端に正中線をマーク、2白色脂肪パッドとその下に表示されている。 </li><li>白色脂肪パッド、鈍い解剖組織への吻側頭蓋骨（basioccipital骨）の腹側表面に到達するまで。 </li><li>片側（最大1センチメートル）に変位気管を維持し、頭蓋底を露出させるために長い歯リトラクター（歯の長さ5.5ミリメートル以上16ミリメートル）を挿入します。気管の変位はOBができます構造体の呼吸。 注：2分のためのいくつかの動物について、気管に歪みを除去するための手術中に複数回のリトラクターを緩め、 例えば 10分ごと。フックリト​​ラクタは、変位の歪みを低減するために長い歯開創器の代わりに使用することができる。 </li><li>注意深く出血を回避するために喉頭に向かう吻側端に小さな見える血管を焼灼する。 注：それらが焼灼される前に、反回神経、血管を焼灼しないようにするために慎重に組織壁から引き離されている。 </li><li>手術の残​​りの顕微鏡を調整します。 </li><li>細かい鉗子で頭蓋骨のベースカバー骨膜を削除します。掘削のための可能な限り最高のビューを達成するためにリトラクターを調整します。 </li><li>脳底動脈をカバーして正中線、で高度に注意して、細かい鉗子でbasioccipital骨の表面に凹凸を感じる。吻方、頭蓋骨はわずか凸として育てられてしまう。 </li><li>病変が望まれる面に応じて、約1 mmの内外運動における正中線に横方向の穴をドリル。 注：ラットは仰臥位であることを忘れないでください、とその左側が研究者の右側にあってもよい！ </li><li>穴が行われると、脳底動脈がはっきり見えるようになるまでドリルで小さな垂直アップ·アンド·下向き·運動との正中線に向かって拡大し、少なくとも2ミリメートルのために横方向に拡大する。 </li><li>脳底動脈がはっきりと見えることを確認してください。ピラミッドは、そのわずかに膨らんだ形状（ 図2）によって、血管に隣接することによって同定することができる。 </li><li>細かい鉗子で、残りの骨片を除去します。 </li><li>舌の上でドキサプラム塩酸塩、呼吸興奮剤の一滴を、適用します。 </li><li> 26ゲージの針と脳底動脈に横方向の細かい鉗子で縦方向に硬膜を開きます。脳脊髄液（CSF）と綿棒を持つ任意の出血を吸収。 </li><li> injuの回避脳底動脈にryが、約1.5ミリメートル幅のピラミッドとCST線維を中断する脳底動脈（ 図2）に垂直Vannas春はさみとの深い0.5ミリメートルの幅にわたるカットをする。 注：事前に先端から0.5ミリメートルでmicroscissorsをマークします。硬膜が開かれると脳底動脈、ピラミッドへのより良いアクセスを可能にする一方側にわずかに移動させることができる。 </li><li>病変が脳底動脈に近い繊維を含むことを確認するために26ゲージの針の先端を使用してカットを繰り返します。 </li><li>綿棒によって照射された光の圧力で出血を止める。必要に応じて、カットゲルフォームで覆うことができる。 </li><li> 、リトラクターを取り外し3-0ビクリル縫合糸で組織や縫合皮膚のみを交換してください。 </li><li>手術後、完全に目を覚ましまで32℃のインキュベーター中で動物を維持し、必要に応じて、生理食塩水を皮下5ミリリットルを管理する。無人の動物を放置しないでください。 </li><li> Carporfen皮下を与える抗炎症などと手術後の痛み1日の術後のための鎮痛剤として。 </li><li>手術後少なくとも週に一度、その後密接に一週間の動物を監視します。 </li><li>手術後に必要に応じて、ケージの床に水和ゲルパック、ピューレベビーフード、湿ったマッシュとドライ飼料を置く。 （ボールベアリングバルブを欠く）長い注ぎ口と水のボトルを提供します。 </li></ol>

<ol><li>Lemon, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descending+pathways+in+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Descending pathways in motor control.</a> Annual review of neuroscience. 31, 195-218 (2008).</li>
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<li>Z'Graggen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+sprouting+and+impulse+rerouting+after+unilateral+pyramidal+tract+lesion+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion in neonatal rats.</a> J Neurosci. 20, 6561-6569 (2000).</li>
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<li>Z'Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+and+enhanced+corticofugal+plasticity+after+unilateral+pyramidal+tract+lesion+and+blockade+of+myelin-associated+neurite+growth+inhibitors+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats.</a> J Neurosci. 18, 4744-4757 (1998).</li>
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<li>Thallmair, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+inhibitors+restrict+plasticity+and+functional+recovery+following+corticospinal+tract+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions.</a> Nature Neuroscience. 1, 124-131 (1998).</li>
<li>Akbik, F. V., Bhagat, S. M., Patel, P. R., Cafferty, W. B., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+plasticity+of+adult+brain+is+titrated+by+Nogo+Receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Anatomical plasticity of adult brain is titrated by Nogo Receptor 1.</a> Neuron. 77, 859-866 (2013).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacol. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Steward, O., Sharp, K., Yee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+re-assessment+of+the+effects+of+intracortical+delivery+of+inosine+on+transmidline+growth+of+corticospinal+tract+axons+after+unilateral+lesions+of+the+medullary+pyramid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid.</a> Experimental neurology. 233, 662-673 (2012).</li>
<li>Thallmair, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+inhibitors+restrict+plasticity+and+functional+recovery+following+corticospinal+tract+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions.</a> Nature neuroscience. 1, 124-131 (1998).</li>
<li>Weidner, N., Ner, A., Salimi, N., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+corticospinal+axonal+plasticity+and+functional+recovery+after+adult+central+nervous+system+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3513-3518 (2001).</li>
<li>Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+enhances+sprouting+of+corticospinal+tract+during+development+and+after+adult+spinal+cord+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion.</a> Nature. 367, 170-173 (1994).</li>
<li>Starkey, M. L., Bleul, C., Maier, I. C., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehabilitative+training+following+unilateral+pyramidotomy+in+adult+rats+improves+forelimb+function+in+a+non-task-specific+way%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Rehabilitative training following unilateral pyramidotomy in adult rats improves forelimb function in a non-task-specific way.</a> Experimental neurology. 232, 81-89 (2011).</li>
<li>Ueno, M., Hayano, Y., Nakagawa, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+rewiring+of+the+corticospinal+tract+requires+target-derived+brain-derived+neurotrophic+factor+and+compensates+lost+function+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Intraspinal rewiring of the corticospinal tract requires target-derived brain-derived neurotrophic factor and compensates lost function after brain injury.</a> Brain : a journal of neurology. 135, 1253-1267 (2012).</li>
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<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bstaircase+test%26%2334%3B%3A+a+measure+of+independent+forelimb+reaching+and+grasping+abilities+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;staircase test&#34;: a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats.</a> Journal of neuroscience methods. 36, 219-228 (1991).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

私たちは、pyramidotomy損傷モデルを記載している。皮質脊髄路は、脳幹のレベルで切断される。技術的な観点から、この手術は慎重と精度の多くを必要とします。脳幹は、そのようなピラミッドの下に網様体に埋め込まれた曖昧な核と孤ように、複数の核における呼吸センターや心血管センターを収納する。カットが深すぎる行われた場合、これは致命的でありうる、突然呼吸困難につながることができます。我々は、カットが突然呼吸停止を防止するために、呼吸活動を増加させる直前にDopramを与える。呼吸が停止した場合は、それが回復することができるように酸素と以下の5分間動物を換気する価値がある。さらに、脳底動脈の損傷は絶対に避けるべきである。最初の数日間の受傷後時の合併症は以下のとおりです。他の重要な機能に影響を与える脳幹出血、かなりの体重減少、激しい呼吸diffic原因ピラミッドのすぐ横のオリーブを含む大規模な損傷に対する動物の気管変位と厳しい方向性とのバランスの問題に起因するulties。エンドポイントおよび動物を安楽死させることができるように、これらの合併症を治療することができる。手術後の最初の週の間閉じるモニタリングが不可欠です。補助食品は、体重減少を相殺するために与えることができる。気道炎症（耳障りな呼吸）は、通常1〜2日以内に解決します。一般的に、若い動物は彼らの首が少ない深いようで動作するように簡単である。さらに、それらは、より弾力性が少ない呼吸合併症を持っている。 それはpyramidotomyとCSTの完全な病変を達成するためのいくつかの練習が必要です。同様に、スチュワードら 16、Benowitz ら 28によってかつての実験を複製するために設定することによって二つの研究では、最初に高い死亡率を報告し、それらの病変の一部が不完全であったこと。行動赤字も変数になります。私たちは、候補治療法をテストするために、任意のフル実験が行われる前に、新しい外科医は多くの練習pyramidotomy手術を実行することをお勧めします。不完全な病変を予防する方法は皮下注射針が、このプロトコルで説明したように脳底動脈に近い皮質脊髄繊維が切断されていることを確認することで、カットを辿りされている。他のオプションは、Zhou ら 2003 29に記載されるように傾けガラス吸引ピペットを用いて病変部を吸引することである。微細なタングステン線はまた、管22を切断するために使用することができる。 pyramidotomyする代わりに、一方的に子宮頸C3の背側CSTをカットした後、腹側アプローチCST 18のipsilesional C2腹の部分をカットすることです。目標はcontralesional CSTの萌芽を研究することである場合はほぼ間違いなく、完全な病変は必要ありません。ピラミッドの大部分が病変と非病変側から発芽応答が発生している場合、これで十分であることができる。 pyramidotomy病変モデルの1つの目的は、皮質脊髄路の一方の側を切除し、無傷の非傷ついた繊維の可塑性および出芽を刺激する神経可塑性を誘導する治療を使用することである。神経保護療法をテストするために、このモデルは不向きであり、そのような挫傷などの他の損傷モデルを使用する必要があります。 pyramidotomiesのアウトカムは、行動試験と解剖学で最も頻繁に評価される。水平ラダーテストシリンダ飼育試験とモントーヤ階段試験は、最も一般的に使用される行動評価である。文献に記載されている他のテストは、テスト、ロープクライミングテスト、歩行分析と粘着テープテスト3,17-19に達したペレットである。しかし、ほとんどの行動試験の結果は、多くの場合のみ42日postlesion 3,4,11,17,18,20-22の最大値まで監視されている。過去の経験からは、げっ歯類は、あらゆる治療の介入なしに、後の時点でほとんどの機能を回復。我々は、股関節を示しているテストに達する水平ラダーテストとモントーヤの階段ペレットトン後の時点までの障害を検出する。これらは、治療のために機能回復を測定するために用いることができる。病変完全性は吻側頸部のレベルで脊髄または損傷部位の横断面のエリオクロムシアニン染色の（背側の列のCST繊維をラベル）PKCガンマ染色により判断される。ビオチン化デキストランアミンは、脱神経、脊髄領域に正中線を横切る無傷の繊維の萌芽を評価するためにcontralesional皮質に注入することができる。 結論として、pyramidotomyモデルは、手術が成功して習得されている場合、中枢神経系損傷の治療薬の神経可塑性を誘導する能力を評価するための良いです。それは完全な繊維の可塑性を評価する。次のステップは、より大きな克服する薬剤の能力を評価するために、そのような挫傷、より臨床的に関連するモデルを使用することであろうinjuriES複数の管に影響を与える。

皮質脊髄路（CST）は、ヒト脊髄つの主要な運動管である。器用さのかなりの損失で脊髄損傷の結果後にこの管へのダメージ。 CSTは、桁の移動および遠位筋コントロールとしてヒトにおける微細運動の動きのために特に重要である。脊髄内の解剖学的位置は人間のものとは異なり、CST損傷が少ない1-4を無効にしているが、それはまた、齧歯類に見られる。 CST損傷の一つのインビボモデルは、腹側脳幹一ピラミッドが交叉（ 図1）の吻側切断される一方的pyramidotomyを伴う。ピラミッドは、それがdecussates前にCSTが実行されるを通して延髄の腹側の明確な解剖学的特徴である。ラットでは、繊維の大部分（約95％）decussate髄質の尾側端でおよびその後脊髄の背内側部に見出される。しかし、approximatdecussated繊維のエリー10％が背外側の列で実行されます。繊維の残りの約5％が腹内側部5,6に同側と旅行に非クロスとどまる。 pyramidotomyの後脊髄は反対側のCST（ 図1）からの直接入力を失う。 pyramidotomyモデルは、治療に非損傷CSTの完全な繊維の応答をテストするために特に良いです。これは、除神経領域の神経支配する脊髄の正中線を横断そのまま繊維の可塑性と発芽の評価を可能にする。皮質脊髄路は脊髄損傷モデルで大幅に発芽することが観察、特に前肢回復7-10を仲介しています。治療は、この前肢の回復を促進することを目指しかもしれません。治療の有効性は、行動評価、非損傷管の解剖学的トレーシング技術と端末電気生理学的実験3,11,12でテストすることができます。&lt;/ pの&gt; 脊髄損傷の他のほとんどの前臨床モデルと比較しての利点は、特に、多くの場合、複数の管に影響を与える他の脊髄損傷と比較して1つ気道に影響を与えることがある。明確な、表面的な解剖学的位置で唯一の管が病変れている。もう一つの利点は、pyramidotomyが再現可能な損傷モデルであるということです。研究者は、運動系13,14に影響を与える傷害または障害後の運動機能の回復を目指す可能性神経可塑性を誘発する治療の効果を試験することは、生体内のリソースに適している。

<table><tbody><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vm No; 02000/4229</td><td>5 mg/kg を 1 日 2 回投与</td></tr><tr><td>Homeothermic Blanket System</td><td>ハーバード・インスツルメンツ</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>ファインはさみ - タフカット</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11019-12</td><td></td></tr><tr><td>長い歯のアルムリトラクターファイン</td><td>サイエンスツール</td><td>17009-07</td><td></td></tr>焼<tr><td>灼システムキット</td><td>ハーバードインスツルメンツ</td><td>726067</td><td></td></tr><tr><td>ファインデュモン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>炭素鋼バリ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>19007-07</td><td></td></tr>ド<tr><td>プラムVドロップ</td><td>ファイザー</td><td></td>は<td>舌Vannasスプリングに1滴を適用します</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>gelfoam</td><td>Equimedical</td><td>EQU705001</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl 縫合糸</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンパクト麻酔システム イソフルラン K/F シングルガス</td><td>VetTech ソリューション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>Ohaus</td><td>NVT3201</td><td></td></tr><tr><td>炭素鋼メス刃 No.10</td><td>スワン・モートン</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>25g針</td><td>テルモ</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (1ml・5ml)</td><td>テルモ</td><td>SS+01T1/SS*05SE1</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水 (塩化ナトリウム0.9%)</td> <td>フレゼニウス・カビ</td><td>Pl 08828/0178</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ジョンソン・エンド・ジョンソン</td><td>5000207582502</td><td>使用前に滅菌</td></tr></tbody></table>

神経可塑性を誘導する治療法の評価のためのラットの皮質脊髄路の片側pyramidotomy

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

皮質脊髄路（CST）を完全齧歯類脳幹の髄ピラミッドに一方的に切断することができる。 CSTはげっ歯類では、ヒトでの遠位筋肉制御のための大きい重要性を持つと、より少ない程度にモータ管です。主に前肢と器用さの持続的な損失に過渡運動障害につながる脊髄の反対側の脊髄のCSTの神経支配の喪失で1ピラミッド結果の一方的なカット。皮質脊髄路の同側投影が軽微なものである。私たちは、病変完全性の可能性を高めるために私たちの外科的手法を洗練している。私たちは、術後のケアについて説明します。モントーヤの階段ペレット到達テストとここに示す水平ラダーテストで赤字が受傷後8週間までに検出されている。シリンダー飼育試験上の赤字が一時的にのみ検出されます。したがって、円筒試験は短期間の回復の検出に適切であり得る。私たちは、電気生理学的に、どのように示してそして解剖学的に、一つの病変及びプラスチックの変化を評価することができる。我々はまた、貧困地域に正中線を越え発芽無傷CSTからの繊維を分析する方法について説明します。それは、一貫して原因延髄と生存率の脳底動脈に近接へ​​の完全な病変が低くなる可能性が&gt; 90％を取得するために挑戦している。代替外科的アプローチと行動試験は、このプロトコルに記載されている。 pyramidotomyモデルは、損傷後の完全な繊維の萌芽を増やす神経可塑性を誘導する治療を、評価するための優れたツールです。

生存率。 私たちが行った代表的な研究では、16〜20のうち、女性のリスターのフード付きラット（200〜250グラム）の生存率を持っていた。最も一般的な合併症はちょうどピラミッド（核孤、曖昧とparabrachilis）に背側脳幹の呼吸器センターにあるため気管変位や損傷の難しさを呼吸している。同様の結果が、文献16に報告されている。 行動の成果。 行動試験の範囲は、げっ歯類におけるpyramidotomy後の感覚運動成果を評価するために使用されている水平ラダーテストを、テストに達する単一のペレットを、シリンダー飼育試験とモントーヤ階段試験は、最も一般的に使用される行動評価である。文献に記載された他の試験は、試験ロープクライミング試験、歩行分析、および粘着テープ試験に到達したペレットである3,17-19。これらのほとんどは、損傷後の機能的な運動障害1週間表示されます。現在は、文献に記載ほとんどの研究は、42日4,11,13,20,21、または短い時間3,18,22のために行動試験を行う。私たちは、長期間行動試験を行ったとモントーヤの階段テストおよび水平ラダーテストを除き、行動試験の一部のための運動機能8週間後pyramidotomyの本質的に完全な回復を見てきました。これはいくつかの理由であると考えられる。まず、病変への負傷CST吻側の脊髄運動ニューロンへの間接リレー作用脳幹のニューロンにシナプスを形成してもよい。第二に、無傷の（対側）CSTは発芽し、運動ニューロンへのリレーとして機能脳幹や脊髄のニューロンにシナプスを形成することができる。第三に、そのような網様体などの他免れモーター管、前庭脊髄または赤核脊髄路は、いくつかの機能を引き継ぐことがあります。このように、持続的なTreatment効果はpyramidotomyモデルの多くの行動試験で検出することは困難である。このモデルではいくつかの行動試験は、しかし、早期治療に関連している傷害、後に加速の回復を示している可能性が。 シリンダー飼育試験を 3,4,23 シリンダー飼育試験に基づき、支配的な前足に対応するCSTは負傷した。ラットはプレキシガラスのシリンダーに入れ、飼育動作が3分の期間に観察される。 Preinjuryは垂直探査（ 図3A）の間に1前足、支配的な前足の使用のための若干の好みがありました。損傷が支配的な側面に影響を及ぼし、contralesional前肢の使用は1週間の受傷後に28％に減少した（反復測定ANOVA（p &lt;0.05）であること、事後分析は、動物は、週1、2及び3はp &lt;0.05で有意な障害を持って明らかにしたフィッシャーのLSD）。 4週間は、動物が回復し受傷後dは後部の45％を、影響を受けた前肢を使用し、6週間後に、これは（N = 16、標準誤差が示されている平均値±）57パーセントだった。同様に、スターキーらは、（4）pyramidotomy後最長42日間、シリンダー試験を用いてマウスを評価し、全試験期間を通じて、影響を受けた前肢の使用の有意な減少を報告している。 モントーヤ階段テスト 24 ラットは、傷害の前に順応するために、このテストのための事前訓練を与えなかっが必要です。テストセッション動物中にモチベーションを高めるためには食べ物は夜の前に、ラットあたり15グラムの食物に制限されています。食べ物を奪わラットを15分間モントーヤの階段に置かれている。各側では、ウェルを有する7段階、3ペレットを含む各の階段があります。それぞれの側に取り出されたペレットの総数が記録されている。 contralesional /影響を受けた前足で検索されたペレットの数は61パーセントのpreinjuryから大幅に減少した3％3日間受傷後（ 図3B）。ペレットを取得する機能は、まだかなり取り出されたペレットの20％受傷後4週目に損なわれた。ラットは、その時点で食べたペレットの唯一の29％で8週までの大幅な赤字を示した（反復測定分散分析P &lt;0.05、 事後解析は、動物がすべての週でcontralesional側に重大な障害を持っている、P &lt;0.05、フィッシャーの明らかにしたLSD）。 ipsilesional前足は1週間の受傷後まで影響を受けている。しかし、これは第二週によって回復（反復測定分散分析P &lt;0.05、 事後解析では、動物を明らかにしたipsilesional前足で3日目と1週で有意赤字を持って、P &lt;0.05、FisherのLSD）。 ipsilesional前足の初期赤字は、その後の発芽と回復で、カットピラミッドを通る皮質脊髄路の同側部分のlesioningによって説明されることがあります。 水平のラダーテスト25 ラットは、このテストの事前訓練を与えなかっが必要です。ラットは、不規則なラング間隔で1メートルの長いはしごの上に三回歩く。ビデオは、後のスローモーションで分析され、各足のための足のスリップやミスの合計数が定量化される。 図3Cのグラフは、ミスと取られるステップの総数に対するパーセンテージとして、影響を受けると影響の少ない側（+前肢後肢）のスリップの総数を表す。ラットは、10パーセント以上、影響を受けた側の11％、少ない患側と1週間の受傷後、それぞれのエラーの有意に増加した数を持っている。この赤字が、しかし、行われ、10％の誤差で最大8週までcontralesional /影響を受けた側で永続的である2週間ipsilesional /あまり影響側に解決します（反復測定ANOVAは、 事後解析は、動物が上のすべての週で大幅な赤字を持って明らかにしたipsilesionalに週1と3でのcontralesional側と大幅な赤字側に、p &lt;0.05、FisherのLSD）。 電気生理学的検査 ターミナル電気生理学的なセットアップにおいて、動物は、ウレタンを腹腔内麻酔した。手順では、それは37℃±1℃に保った。その腹側頸部、その前肢および胸部を剃毛し、ヨウ素スクラブで消毒された。以前に皮膚や胸の主要なを切開腹側アプローチによって上腕に記載され、橈骨神経が露出したとしてピラミッドを露出させた。橈骨神経の遠位端は、切断された神経は、鉱物油浴に2つの銀ワイヤフック電極上に置いた。ピラミッドは、300 Hzで5パルスで異なる深さに同心双極電極で刺激し、刺激の振幅を大きくしたのいずれか。録音は常に無効になってアーム（ 図4）の橈骨神経から作られた。 無傷のアニメーション反対側のピラミッドが（ 図4B）に刺激されたときにALSは橈骨神経で12から20ミリ秒の間の待ち時間で強い反応を示した。同側の刺激は時折活性化（ 図4C）になる。病変管の病変（ 図4B '）の上に刺激されると、以前に記録アームに反対側に、pyramidotomiesを受けた動物は、橈骨神経内に応答を示さない。しかし、記録電極と同側ピラミッドにおけるCST線維の刺激は、12週での非損傷動物と比較して、橈骨神経においてより強い活性化受傷後（ 図4C '）をもたらした。 解剖の結果。 動物は動物のスケジュール1（科学的処置）法1986年以前に二週間に応じて10週間の術後を安楽死させ、無傷CSTは、ビオチン化して追跡した無効になって腕に運動皮質26、同側にデキストランアミン（BDA）注 ​​射（ 図1）。これは正中線を横断しcontralesional脊髄（ 図5C、D）を供給無傷の繊維の定量化を可能にする。これは傷害に応答して増加するのに対し、無傷の動物は唯一、正中線を横切る少数の繊維を有する。横頚椎脊髄切片は、病変CST（ 図5E）16で除神経の割合を評価するために、プロテインキナーゼC（PKC）γで染色した。代替的に、病変の完全性pyramidotomy損傷のipsilesional側の運動皮質にBDAトレーサーを注入することによって評価することができる。反対側の背内側CSTと同側の腹内側CST中の標識の不在は、完全な一方的な離断の証拠を提供する。 <img alt="図1" fo:conte> NT-幅= "4インチ" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg"幅= "400" /&gt; 図1：回路図ラットとピラミッドのCSTの一方的な軸索 ​​切断における皮質脊髄路を示す上面画像：皮質脊髄ニューロンは、皮質層5錐体細胞に由来する。 （緑色で示される）、ビオチン化デキストランアミン、実験の最後に二週間前contralesional皮質内に注入される。中央の画像：トラクトは延髄の腹側表面上及び軸索の大半はdecussate spinomedullary接合部でピラミッドを形成する。片側性pyramidotomyは（赤で表示）尾髄質中で行われる。下の画像：脊髄の背内側と背の部分にダウンを実行皮質脊髄路の大多数。少数派は、同側のままとventromedially実行されます。 1843fig2highres.jpg "幅=" 500 "/&gt; 図2：ラット脳の腹側ビュー 。これらは、並列凸（黄色のボックス）を上げているので、ピラミッドが特徴的である。ピラミッドの境界は正中線を越えて横方向に半押し（C）に見られるように脳底動脈とparaolivary動脈（POL）との間に凸部の基部に脳底動脈（BAS）によって内側に定義されています。開頭術は脳底動脈の上とparaolivary動脈（Cの赤いボックス）に至る横実行されます。 Oneピラミッドが脳底動脈に垂直に切断された（Cの赤い線、カットはAとBで試料上に表示されます）。 CSTはdecussateを開始しているためと椎骨動脈は正中線をオフに設定されているため、椎骨動脈（VERT）の近くにあまりにも尾側に配置された病変が不完全になります。ジョージ·パクシーノス27で「ラット神経系」から適応（C）画像。注：この図は、画像の左側に病変を示しています。これは、動物のリグですHTの錐体路では仰臥位嘘をついているので。ビデオは、動物の左錐体路に病変を示していることが注意してください。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51843/51843fig3highres.jpg" width="500"> 図3：シリンダー飼育試験のための代表的な結果は、テストおよび水平ラダーテストに達するモントーヤの階段ペレットは、損傷後のすべてのテストで検出された運動障害があります。しかし、持続的な赤字は8週間受傷後までモントーヤの階段テストおよび水平ラダーテストで検出することができるのに対し、全く赤字は、4週間の受傷後でテストを飼育シリンダーを用いて検出することができない（N =グループ、平均と標準誤差あたり16です示す）。アスタリスクはpreinjuryベースライン（フィッシャーのLSD検定）に比較してp &lt;0.05を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51843/51843fig3highres.jpg" target="_blank">クリックしてください</a>ここで、この図の拡大版を表示します。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51843/51843fig4highres.jpg" width="500"> 図4：pyramidotomy前後の皮質脊髄路を評価する電気生理学（A）は 、端末のための実験セットアップを示す。私たちは、lesioningと交叉部位への吻側様々な深さで5パルスの列を持つピラミッドを刺激する。赤い管が病変管です。私たちは、contralesional側の橈骨神経から記録します。（B）と（C）を ipsilesional刺激またはcontralesional刺激の前またはpyramidotomy 12週間後に例の録音を示しています。 Ipsilesional刺激は、傷害の前に橈骨神経（B）内の複数の複合活動電位（トレースでスパイク）を呼び起こす。これらは負傷により廃止され、活動は返したい時はありませんnの内の12週間（B '）。 Contralesional刺激は珍しい単一の複合活動電位のpreinjury（C）を連想させる。傷害の活動12週間後にはかなりおそらく脊髄内の正中線とプラスチックの変化を横断萌芽そのまま軸索に、（C '）を増加させる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51843/51843fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51843/51843fig5highres.jpg" width="500"> 図5：pyramidotomy後の解剖学的評価は（A、B、C、D）ビオチン化デキストランアミンは、非損傷CST（ 図1には緑色を参照）に対応する運動皮質に注入することにより、皮質脊髄路を追跡するために使用された。背内側、CSの腹内側部品Tは、（A、背内側Bに拡大部分）。（C）及び（D）は処置に応答して除神経側の灰白質に正中線を横切って発芽の繊維（A）からの倍率であるはっきりと見える。病変の完全性を評価するために、子宮頸部レベルの横断面4（12週間受傷後の組織）がPKCγ（E）に対する抗体を用いて切断し、染色した。画像の左側のCSTはそのままであり、おそらく、負傷した背部CSTの構造的崩壊により、除神経側に正中線を横切って膨出見ることができる。

皮質脊髄路、主要な感覚路の一つは、中枢神経系のための神経可塑性を誘導する治療法を試験するために、齧歯類脳幹に一方的に傷害することができる。この外科手術手順（「pyramidotomy」）と術後の評価は、このプロトコルに記載されている。

神経可塑性を誘導する治療法の評価のためのラットの皮質脊髄路の片側Pyramidotomy

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

この手順の目的は、ラットの髄質ピラミッドの皮質脊髄路の片側分類学を行うことです 損傷後の神経可塑性を評価するために、自発的であろうと治療によって誘発されたものであろうと。これは、最初に気管を過ぎた腹側アプローチから首を解剖することによって達成されます。次に、開頭術によってピラミッドが露出し、基底基底動脈の片側のピラミッドに病変が作られます。手術後、錐体耳術の効果は、行動検査、電気生理学的検査、および組織学を使用して評価できます。成体ラットの髄質ピラミッドにおける皮質脊髄路の片側分類学は、器用さの長期にわたる欠損を引き起こします。このモデルは、CNS損傷の候補治療法を評価するために使用できます。まず、対応するピラミッドを傷つけるためのシリンダー飼育試験計画を使用して、動物の支配的なフォアパワーを決定します。たとえば、右のピラミッド吻側を咻吻に切断して、ラットの左側を無効にします。女性のリスターの麻酔を誘発した後、5%isのフッ素を含むフード付きラットは、首の腹側を剃り、麻酔を調整し、維持します。フッ素使用量は約1.5%です。次に、カルプロフェンを皮下投与して炎症を軽減し、ホメオテーマシステムを使用して鎮痛を提供します。手術中は動物を摂氏37度に維持してください。始める前に、ピンチ離脱反射とまばたき反射を確認してください。目に軟膏を塗ります。露出した皮膚をアルコール中の1%クロルヘキシジンで消毒します。.手術を開始するには、あごまでコード状から始まり、胸骨までローラルで終わるように、2〜3センチの正中線切開を行います。次に、小さなブルドッグクランプを使用して、皮膚を鈍く引っ込めます。組織の上層を解剖して気管を露出させます。正中線に留まり、鈍いハサミと歯の鉗子で逆のアクションを使用します。露出したら、気管を片側にずらします。その下に2つの白い脂肪パッド。バイ後頭骨のコードの端に印を付けます。今、パッドに鈍く解剖し、頭蓋骨の腹面にローラルします。頭蓋骨を露出させるには、気管を最大1センチずらします。一対の長い歯のリトラクターやフックリトラクターを使用すると、変位が大きすぎると呼吸が妨げられます。ラットがより良い換気を必要としている兆候がある場合はいつでも、リトラクターを数分間閉じると役立つ場合があります。次に、気管の吻側端にある小さな血管を喉頭に向かって慎重に焼灼します。顕微鏡を調整し、頭蓋骨に焦点を合わせます。細かい鉗子で骨膜を切除し、リトラクターを調整して穴あけの準備をします 頭蓋骨をよりよく露出させるには、基底後頭骨の凹凸面を放射状にプローブします。正中線には、脳底動脈を覆う隆起があります。選択した側の正中線から1ミリメートル横に穴を開けます。小さな垂直方向の上下の動きを使用して、穴を正中線に向かって徐々に拡大します。次に、脳底動脈とそのわずかに膨らんだ形状のピラミッドを特定できます。残っている骨片は鉗子で取り除く必要があります。ピラミッドは、そのわずかに膨らんだ形状で識別でき、隣接する血管が呼吸刺激剤の塩酸ドーラを舌に1滴塗布してピラミッドを露出させます。まず、26ゲージの針と細い鉗子で硬膜を開きます。綿棒で脳脊髄液と血液を吸収します。先端から0.5mmのところに印をつけたヴィーナスの春ハサミを用意します。これらのはさみを使用して、ピラミッドにまたがり、脳底動脈に垂直な深さ0.5ミリメートルのピラミッドに幅約1.5ミリメートルの切り込みを入れます。これにより、CST ファイバーが中断されます。ゾミーの後、動物は一時的に呼吸を止めることがあります。ラットの鼻と口の上に置かれた10ミルの注射器を使用した人工換気の短いサイクルは、回復を促進する可能性があります 病変に脳底動脈に近い繊維が含まれていることを確認するため。26ゲージの針の先端を使用してカットをトレースします。綿棒からの軽い圧力で出血を止めます。カットはジェルフォームで覆うこともできます。次に、リトラクターとブルドッグクランプを取り外し、ティッシュを交換します。3つのゼロVicryl縫合糸を使用して皮膚のみを縫合します。その後、皮下。水分補給のために5ミリリットルの生理食塩水を投与します。手術後、動物が完全に目覚めるまで摂氏32度のインキュベーターに移します。動物を監視し、炎症を抑え、痛みを管理するために、次の2日間にわたって毎日カルプロフェン皮下注射を継続的に行います。また、その後の1週間は動物を注意深く観察してください。毎日体重を量り、必要に応じて追加の水分を与えます。ウォーターボトルには、ボールベアリングバルブがない長い注ぎ口が必要であり、最大20%の重量損失が発生する可能性があります。だから、ハイドロゲルパックを湿ったマッシュ、柔らかい果物、ピューレにした離乳食と一緒にケージに入れ、注射器で手で給餌します。必要に応じて、他の脳幹領域が損傷すると、樽が転がったり、まぶたが開いたり閉じたりすることがあります。場合によっては、動物を人道的に犠牲にする必要があるかもしれません。シリンダー後部のピラミッド切開術による欠損を測定するために、いくつかのテストが使用されました。優勢なfopoに影響を与えるテスト傷害は、病変後の緩やかな回復とともに、好みを大幅に低下させました。モントーヤ階段試験では、試験期間中、コントラルの影響を受けた側で回収されたペレットの数が大幅に減少することが示されています。同側の影響を受けにくいフロントポアの行動は、損傷後の水平ラダーテストで 1 週間後に回復しましたが、ミスの頻度は、同側の影響を受けていない側での即時の欠損と比較して、対側病変の影響を受けた側で有意に増加しました。手術の 10 週間後に、組織学的分析が行われました。動物の無傷の皮質脊髄路は、ビオチン化デキストランアミンで追跡されました。それをcontral病変皮質に注入することにより、CSTの背側内側腹側内側およびドス側方の成分がはっきりと見えました。より近くで拡大すると、正中線を越えてd側の灰白質に伸びる繊維が見えました。たとえば、手術後 10 週間で、病変の完全性が確認され、子宮頸部レベルでの横断面と PKC ガンマに対する免疫組織化学反応が予想どおり 1 つの皮質脊髄路が欠落していました。一度習得すれば、手術は30分で完了し、死亡率は低くなります。

unilateral-pyramidotomy-corticospinal-tract-rats-for-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Beom, J., et al.ラット脳の片側半球への反復経頭蓋磁気刺激J. Vis. 経験。(2016年)このビデオは、麻酔をかけたラットにおける皮質興奮性を調節するための反復経頭蓋磁気刺激 (rTMS) の適用を示しています。この手順では、ベースライン刺激を確立するための運動閾値 (MT) を決定し、その後、MT を超える強度で rTMS...

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脳深部刺激療法(DBS)はパーキンソン病の効果的な治療選択肢です。私たちは、ラットの新規刺激パラダイムをスクリーニングするための研究デザインを確立しました。このプロトコルでは、DBS...

Hemiparkinsonianラットにおける脳深部刺激効果のモーターの成果を評価するための新しいアプローチ：階段室とシリンダーテスト

私たちは、ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)を適用し、25mmの字型コイルを両側の頂点から1cm外側に配置し、コイルを45°角度付けました。rTMSには、社内の水冷システムを20分以上使用しました。...

ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激

本稿では、ラットの外を定量化する半自動化されたタスクについて説明します。ラットに到達、把握、および球状マニピュ...

ノブ外タスク: ラットの前肢関数を評価するための半自動メソッド

この詳細なプロトコルは、自由行動ラットの経頭蓋電気刺激の短期および長期効果を調査するために、側頭骨に経頭蓋刺激電極配置をについて説明します。...

慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

ここでは、成人ラットにおける9番目の胸部レベルで信頼性の高い脊髄横片切り(HX)を産生するための外科的処置と、そのような一方的な傷害後の非対称的な欠損を検出するために設計された神経行動評価について説明する。...

成人ラットにおける脊髄横片切と非対称行動評価

我々 はラットの運動皮質の微小電極注入が即時かつ持続的な運動障害を引き起こすことを示しています。方法が提案電極注入手術と罰金または総モーター機能の運動野への注入による損傷のための潜在的な変化を明らかにする 3...

ラット皮質運動野の微小電極注入による機能的障害を評価するためにテスト行動の齧歯動物

このプロトコルは、オープン頭蓋骨外傷性脳損傷のマウスモデルの方法論を示し、培養ヒト誘導多能性幹細胞由来細胞を傷害部位に移植する。これらの手順からの結果の行動および組織学的検査も簡単に説明される。...

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

坐骨神経クラッシュ傷害後のラットの行動検査用電池を介して運動行動評価のためのプロトコルを提供する。...

一方的坐骨神経クラッシュ傷害後のラットにおける運動行動の多因子的評価

このプロトコルは、順行性化学遺伝修飾剤を体性運動皮質に注入し、逆行性に輸送可能なCreリコンビナーゼを頸髄に注射することにより、生後5〜10日の新生児ラットの細胞の亜集団に遺伝子治療を適用するための新しい方法を示しています。...

脳と脊椎を組み合わせた手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生児ラットの皮質脊髄路の標的化

学ぶラットの片側ピラミドトミーによる皮質脊髄路損傷モデル。神経可塑性と運動機能回復を評価する行動学的・組織学的手法を用い、中枢神経系損傷治療法の開発に貢献する実験手順です。

神経可塑性を誘導する治療法の評価のためのラットの皮質脊髄路の片側Pyramidotomy

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