タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

次の実験の全体的な目標は、透過型電子顕微鏡によるその後の視覚化のために、高圧、凍結、および急速凍結置換によって植物細胞の細胞構造を固定化することです。これは、凍結用の組織サンプルを凍結保護剤でコード化して慎重に準備し、高圧凍結中に組織の損傷が最小限に抑えられるようにすることで達成されます。第2のステップとして、サンプルを高圧下で急速に凍結することで、細胞成分が固定化され、結晶性氷の形成が制限されるため、細胞の形態は無傷になります。

次に、細胞の水を有機溶媒で置き換え、四酸化オスミウムなどの固定剤を導入するために、迅速な自由置換を行い、細胞の超構造を結合して安定化させます。透過型電子顕微鏡法に基づき、高圧凍結と急速凍結置換が植物の細胞構造と形態を効果的に保存することを示す結果が得られました。従来の化学固定のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、H-P-F-Q-F-Sが細胞内容物をミリ秒単位で固定化し、アーティファクト形成を最小限に抑えることです。

一般的に、QFSプロトコルは初心者にとって難しいため、ユーザーが手順に慣れるまで2人で協力することをお勧めします。クライオグローブやゴーグルなどの個人用保護具は、液体窒素を取り扱うときは常に着用する必要があります クライオバイアルホルダーが入った断熱ボックスに液体窒素を充填して、ホルダーが完全に覆われるようにします。急速凍結置換またはQFS中の固定剤の使用は、アセトン中の1%オスミウム、四酸化体、および0.1%の小便器アセテートです。

すべての安全上の警告に従って大量の溶液を調製した後、1.5ミリリットルのアリコートをクライオバイアルに分注し、液体窒素で凍結保存します。凍結置換またはFS培地を含む標識クライオバイアルを適切な数、アルミニウムに、液体窒素に2つのホルダーを入れます。このプロトコルでは、サンプル調製の約1〜1時間半前に、それぞれに1つのサンプルを含む最大4枚のディスクを1つのバイアルに入れることができます。

高圧冷凍庫のスイッチを入れて、運転の準備をする必要があります。このプロトコルでは、サンプルの周囲のスペースを埋めるための細胞外凍結保護剤として酵母ペーストも必要です。試料担体に、ペーストが滑らかになるまでつまようじを使用して、パン酵母をほぼ等量の10%メタノールと混合します。

パンケーキミックスの一貫性により、必要なペーストの量は10サンプル以下のサンプル数に依存し、ペーストをマイクロ遠心チューブで混合することができます。高圧凍結またはHPF用のサンプルを調製するには、植物から目的の葉を取り除き、デンタルワックスまたはその他の切断面にそっと置きます。0.2mmのパンチを使用して、葉からサンプルを切り取ります。

この手順の最も重要な部分は、この試料キャリアにロードするためのこのサンプル調製です。サンプルの取り扱いが不十分な場合、他のステップではダメージコストを補うことはできません 解剖顕微鏡下での作業。タイプA試料担体の0.2mm側を見つけ、酵母ペーストを塗布します。

リーフディスクを試料キャリアに置き、細かいペイントブラシでペーストを滑らかにして、ディスクが完全に満たされ、ペーストがホルダーの縁と同じ高さになるようにします。試料キャリアを乾燥させ、室温で乾燥させた試料ホルダーに置き、タイプBの試料キャリアの平らな面を下にして試料を覆います。前に準備した断熱ボックスを機械の上に置きます。

試料ホルダー内のサンプルを高圧冷凍庫に持って行きます。サンプルが入った試料ホルダーを高圧冷凍庫に挿入します。ジェットオートボタンを押してフリーズサイクルを開始し、1秒か2秒でできるだけ早く作業を完了する必要があります。

試料ホルダーを機械から取り外し、先端を置きます。サンプルを断熱ボックス内の液体窒素に保持します。2対の鉗子の先端を液体窒素に浸して、凍結後に冷やします。

キャリアは、液体窒素の下で作動する液体窒素冷却鉗子でのみ取り扱う必要があります。試料ホルダーを反時計回りに回して開き、液体窒素冷却鉗子で試料キャリアをホルダーから取り外し、ディスクが常に液体窒素または蒸気の中にあることを確認します。FS培地が入ったクライオバイアルを開け、蓋を箱の側面に置きます。

1つの予冷された鉗子でクライオバイアルを保持し、もう一方の鉗子を使用してディスクをクライオバイアルに入れます。クライオバイアルの蓋をねじ込み、バイアルに液体窒素を閉じ込めないように注意して取り付けます。液体窒素は温暖化中に700倍に膨張し、閉じ込められた液体窒素はこの間に爆発を引き起こす可能性があります。

必要なサンプルがすべて凍結するまで、このプロセスを繰り返します。同じ種類のサンプルを含む複数のリーフディスクを同じバイアルに入れることができます。自由置換の準備を開始するには、アルミニウムヒーターブロックを液体窒素に10分間、または核の沸騰が止まるまで完全に浸します。

その間、QFSチャンバーとして使用するために、コンテナの底にドライアイスの層を置きます。砕いたドライアイスやペレットが入った発泡スチロールの容器やアイスバケツが使用できます。この手順には、温度プローブが必要です。

熱電対は、クライオバイアルの上部からチューブの底に到達するように配置され、チューブの蓋は樹脂で密封されているため、液体が漏れることはありません。各QFSランの開始時に、チューブに1.5ミリリットルのアセトンを充填します。FS中にFSメディアが漏れないように、バイアルの蓋がしっかりとねじ込まれていることを確認してください。

サンプルが入ったクライオバイアルと温度プローブをヒーターブロックの中央列にすばやく挿入します。断熱されたクライオグローブまたは大型の鉗子を使用して温度の記録を開始します。ヒーターブロックからすべての液体窒素を注ぎます。

クライオバイアルを注ぎ出さないように注意してください。バイアルを含むブロックをQFCチャンバーのドライアイスの層に入れます。ブロックがチューブが水平に横たわっているが、わずかに上向きに傾くように配置されていることを確認してください。

正しいクライオバイアルを使用すれば、漏れはないはずです。FSチューブが覆われるように、QFSチャンバーにドライアイスを詰めます。ブロックの上部を覆う必要はありませんが、チャンバーに蓋をします。

QFSはドラフト内で実行する必要があります。サンプルを入れたQFSチャンバーをプラットフォームのロータリーシェーカーに置き、125RPMで120分間回転させます。この間、ブロックの温度は徐々に摂氏約マイナス80度まで上昇します。

攪拌により、成分の混合が保証され、FSが向上します。2時間後、ドライアイスをチャンバーから取り出します。クライオグローブを使用して、ヒーターブロックをQFSチャンバーからすばやく持ち上げ、ドライアイスを二次容器にすばやく注ぎます。

さらに1時間揺れ続けます。この間、温度は摂氏マイナス15度からマイナス20度に上昇するはずです。1時間の終わりに、サンプルと温度プローブをQFSチャンバーから取り出し、室温になるまでさらに10〜15分間、室温でシェーカーに置きます。

クイックフリー置換が完了したら、温度の記録を停止します。プラスチック製の移送ピペットで各クライオバイアルからFS培地を慎重に取り出し、有毒廃棄物用の適切な容器に入れます。サンプルを100%アセトンで4回洗浄します。

最初の2回の洗浄液を集めて、有毒廃棄物容器に入れます。アセトンを取り外すときは、サンプルを捨てないように注意してください。サンプルを洗浄した後、細い鉗子を使用して組織サンプルを検体担体から取り出します。

これを行う間、サンプルをアセトンで濡らしたままにし、サンプルが壊れないように非常に穏やかに作業します。酵母ペーストがサンプルから落ちることは珍しくありません。この時点で、イーストペーストは通常非常に暗褐色ですが、葉の組織はまだ緑色です。

多くの場合、FS中に組織サンプルが検体キャリアから脱落し、アセトンを含むクライオバイアルにトランスファーピペットを使用してサンプルを収集します。その後、サンプルは標準的なプロトコルに従って透過型電子顕微鏡法のために調製されます。A.QFS時の温度変化の代表的な曲線をこのグラフに示します。

液体窒素の温度であるマイナス196°Cからマイナス80°Cまで急激に上昇します。ラン開始時のスパイクはプローブの電子機器によるものであり、透過型電子顕微鏡で観察するためにHPFおよびQFSサンプルを準備した後の実際の温度測定値を反映していません。典型的な結果は、ウサギのオプシスの葉のサンプルからのこれらの画像に示されています。

滑らかで細胞壁に押し付けられた原形質膜は、良好な固定を示しています。高倍率では分岐したプラズマデマが見えます。他の細胞小器官もはっきりと見えます。

それらには、葉緑体とチラコイドのミトコンドリア、GOGI微小管、およびプラズマデサが含まれ、大きな中央VAEは無傷のままです。H-P-F-Q-F-S中の取り扱いが不十分な場合、氷の結晶による損傷や溶解などのアーチファクトが発生します。鉛沈殿物は、一度習得すると切片の染色中にも形成される可能性があります。

この手法は、適切に実行すれば4時間半で実行できます。液体窒素と四酸化オスミウムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、ドラフトでの作業や手袋、白衣、ゴーグルなどの個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。