Name: 上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶ上皮間葉転移における選択的スプライシング変化の検出法。ヒト乳腺上皮細胞を用いた誘導型EMTモデルで、定量RT-PCRと免疫ブロッティングによりスプライスアイソフォームの発現を解析し、がん転移機構の理解に貢献する。

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著者は、細胞イメージングにおける貴重な支援に対して、Wensheng Liuに感謝したいと思います。この研究は、米国国立衛生研究所(R01 CA182467)、米国がん協会(RSG-09-252-01-RMC)、Lynn Sage Foundation、およびA Sister's Hope Foundationからの助成金によって支援されました。

EMT誘導の1。細胞培養注：EMTは、上皮細胞におけるTGFβの治療または転写因子ツイストの異所性発現、カタツムリ、またはZEB1 / 2によって誘導することができる。このプロトコルで9,11,29不死化ヒト乳房上皮細胞（HMLE /ツイスト-ER、博士Jヤン、UCSDの贈り物）でのツイスト-ER融合タンパク質の発現を介して誘導性EMTシステムについて説明する。 4 -ヒドロキシタモキシフェン（TAM）処理すると、融合タンパク質ツイスト-ERは12〜14日9,11,29フルEMT遷移に転写し、その結果を駆動するために核に移行。そのようなHMLE /カタツムリ-ER、HMLE /TGFβ、およびMCF10A /TGFβのような追加のEMT誘導系は、これまでの出版物11,30に記載されています。 <ol><li> 5％のCO 2で37℃のインキュベーター内で無血清乳房上皮細胞成長培地（MEGM）にHMLE /ツイスト-ER細胞を維持します。継代の細胞を2〜3日毎にそれらを80％コンフルエンスに達したとき。 5〜10分間、37℃で0.15％トリプシンで細胞をインキュベートし、次いで、5％ウシ血清/ DMEMでトリプシンを不活性化する。細胞をスピンダウンし、MEGMで再懸濁します。 1〜4個の割合で新しい組織培養皿で細胞をプレート。 </li><li> 200μMの溶液を作製するためにエタノールにTAMに溶解する。 -20℃で、光とストアからTAMを保護します。 20 nMのTAMの最終濃度を作るために10,000希釈：使用前に、たて1でMEGM培地にTAMを追加します。 </li><li> EMTの誘導のために、重複して10cmの組織培養皿に1.6×10 6 HMLE /ツイスト-ER細胞をプレート。 20 nMのTAM含有MEGM培地で培養細胞。 </li><li>重複して10cmディッシュにプレート1.6×10 6 HMLE /ツイスト-ER細胞と非TAM処理の対照として0.01％エタノールで細胞を処理。 </li><li>二日間のインキュベーション後に、細胞の形態学的変化を記録するために10倍の倍率で光学顕微鏡下で写真を撮る。 </li><li>制御の一皿から培地を吸引したりTAM処理された細胞。 RNA単離およびタンパク質分析のためのRIPAバッファー中で、残りの半分のためのRNA溶解緩衝液中にプレートの半分を廃棄することにより、冷PBSで細胞を、収穫細胞を洗浄する。 </li><li>重複して10cmディッシュにおける再メッキ1.6×10 6細胞による制御またはTAM処理した皿から継代細胞。連続して20 nMのTAMや車両で細胞を処理する。 </li><li>繰り返しますビヒクル処置対照細胞が敷石状の上皮形態を維持する一方で、その時点で、TAM処理されたツイスト-ER細胞は、紡錘状の間葉の形態を示し、14日目まで5回隔日〜7を繰り返します。 </li></ol> EMTの2キャラ注：EMTの完了は次式で示されます。紡錘状の線維芽細胞のような外観に石畳状の上皮形態から（1）細胞の形態学的変化; （2）細胞間結合におけるE-カドヘリンの局在の喪失;損失によって定義されたEMTマーカーの（3）切り替え式上皮マーカーおよび間葉マーカーのゲイン。 細胞形態学的変化がEMT誘導の時間経過の間に10倍の倍率で光学顕微鏡によって捕捉され、細胞接合部におけるE-カドヘリンの節で説明1免疫蛍光検出は、このセクションに記載されている。 EMTマーカーの発現を免疫ブロット法によって検出される。一般的な上皮マーカーはE-カドヘリン、γ-カテニン、およびオクルディンであり、間葉マーカーは、フィブロネクチン、N-カドヘリンおよびビメンチンを含む。イムノブロット法の一般的な手順は、セクション4で説明されている。 <ol><li> TAM処理、種子を24ウェルプレートのウェルに入れ12mmのガラスの円形カバースリップ上で1×10 5細胞の12日目に。 </li><li> 48播種後時間、吸引媒体及び予め温めPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 15分間予め温め、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 </li><li> PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li> 15のためにPBS中0.2％トリトンX-100で細胞をインキュベートRTで分。 </li><li> PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li>非特異的結合をブロックするために室温で1時間、5％BSA / PBSで細胞をインキュベートする。 </li><li>加湿チャンバーOの中で/ N 4℃で1％のBSA / PBSで1:50に希釈した一次抗体、E-カドヘリンと細胞をインキュベートします。注：一次抗体の希釈の範囲は1時50分〜1の間、通常は次のとおりです。200、および各抗体のための最適な希釈は、実験的に決定されるべきである。 </li><li>一次抗体をデカントし、PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li> RTで1時間500希釈：1中の蛍光標識二次抗体で細胞を培養する。この段階からは、光から細胞を保護する。 </li><li>二次抗体をデカントし、PBSで3回洗浄する。 </li><li> 10分間の0.1〜1グラム/ mlのDAPIまたはヘキストで染色細胞。 </li><li> PBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li>マウントはマニキュアと封入剤の液滴と、シールカバースリップでカバースリップ。 </li><li>細胞を観察し、取る63X蛍光顕微鏡画像。 </li></ol>付加的な抗体を用いた染色は、EMT表現型を確認するために行うことができる。例えば、N-カドヘリンおよびα-平滑筋アクチンは、間葉表現型29,31,32のために染色することができる。細胞骨格構造の再編成は、F-アクチン11ファロイジンで細胞を染色することによってモニターすることができる。また、細胞運動性および細胞死抵抗性についてのアッセイは、EMT 11の特性を調べるために行うことができる。 定量RT-PCRアッセイを用いて検出スプライスアイ​​ソフォームの3。 <ol><li>プライマー設計 注：プライマー対は、慎重に異なるスプライスアイ​​ソフォームを増幅するように設計されるべきである。エクソンは、最も一般的に観察された選択的スプライシングイベントをスキップし、プライマー設計の戦略を説明するために例として示されている。 図1Aは、可変エクソンのような第三のエクソンと4つのエクソンプレmRNAを示している。エクソンの包含3結果エクソン3のスキッピングのに対し、より長いスプライスアイ​​ソフォームの生産は、短いスプライスアイ​​ソフォームを生成します。プライマーは、エクソン3に含まれるアイソフォームおよびエクソン3スキップさアイソフォームを区別するために、およびこのmRNAの全転写産物を検出するように設計される必要がある。 <ol><li>エクソン包含を検出するために、慎重に可変エクソン含まアイソフォームの特異的増幅を可能にする、可変エクソン3、近隣の構成的エクソン4内のリバースプライマー内部フォワードプライマーを設計します。フォワードの両方を設計し、ゲノムDNAまたはプレmRNAから増幅されたPCR産物を避けるために、同じ変数エクソン内のプライマーをリバースしないようにしてください。 </li><li>特にエクソンスキッピングイベント、変数エクソン3が含まれている場合には他の方法で破壊される構成的エクソン2及びエクソン4の接合部にまたがるプライマーの設計1を増幅した。このように、構成的エクソン4内の他のプライマーを設計し、PCR産物は、可変エクソン3がexcludである場合にのみ生成されますエドと構成的エクソン2及びエクソン4は、続いて接合されている。 </li><li>遺伝子の全転写物を検出するために、したがって、2つの構成のエクソン1及び2内のプライマーを設計し、PCR産物は、すべてのアイソフォームから増幅される。 </li><li>必ず全てのプライマーの融解温度（Tm）が約55°C、各プライマーの長さは約18〜22ヌクレオチドであることを確認し、PCR産物のサイズは80〜150塩基対である。 </li></ol></li><li> RNA抽出：全RNA単離キットを用いてRNAを抽出し（材料の表を参照）。 <ol><li> 350μlのRNA溶解バッファーで細胞を回収します。 </li><li>溶解物に70％エタノール350μl添加し、十分に混合します。 </li><li> RNA精製カラムにサンプルを転送します。 </li><li> 1分間のを10,000×gで遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li> RNA洗浄緩衝液IIで二度私は、RNAの洗浄緩衝液500μlで一回カラムを洗浄して。 </li><li>残留するRNA洗浄バッファーを削除する2分間最高速度で遠心分離することにより、カラムからII。 </li><li>新しい1.5 mlチューブにカラムを移し、カラムマトリックスの中央に50μlのヌクレアーゼフリー水を添加し、最高速度で遠心分離してRNAを溶出する。 </li></ol></li><li>第一鎖cDNAの合成<ol><li> UV吸収測定によりRNAの濃度と品質を決定します。注：良質のRNAは、約2.0の260nmで/ 280 nmの吸光度比を持つ必要があります。 </li><li> 20μlの最終容量中250 ngの全RNA、0.05μgのランダムヘキサマープライマー、50pmolのMgCl 2を 、10ピコモルのdNTP、2μLの5×GoScriptバッファー、及び1μlのRT酵素が含まれている逆転写酵素（RT）反応を設定します。 </li><li> RT酵素を不活性化するために5分間70℃でインキュベートし、1時間、42℃でRT反応を行います。 </li></ol></li><li>リアルタイムPCR <ol><li> 10μlのSYBRグリーンマスターミックスで構成されて20μlの反応を設定し、0.1〜1.0μlのcDNAテンプレート、および5フォワードピコモルおよびリバースプライマー。 </li><li>以下のステップを40サイクルでリアルタイムPCRを実行します。95℃の変性を10秒、10秒、58℃のアニーリング、および30秒間60℃の拡張のために。三重でPCR反応を実行します。 </li><li>解離曲線を確認し、単一のピークが各プライマーセットについて観察されることを確認してください。 </li><li>増幅曲線の二次導関数値を計算することによって定量化サイクル（CQ）値を得る。 </li><li> 「デルタデルタはCq（ΔΔCq） 'は、次式に示すような方法を使用して、非誘導サンプルと比較して、誘導されたサンプル中の標的mRNAの相対量（RQ）を算出する。参照として、そのようなGAPDHまたはTBPのようなハウスキーピング遺伝子を使用します。 </li></ol></li></ol><img alt="式（1）" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg"> より正確にスプライスアイ​​ソフォームの相対値を算出し、tの彼は考慮されるべき複数の参照遺伝子の使用。結果は、Pfaffl ら 33,34により記載された修飾絶対値の定量法を用いて分析することができる。 タンパク質レベルでのスプライスアイ​​ソフォームの4。審査<ol><li> 100μlの氷冷したRIPA緩衝液中で細胞を回収します。 </li><li>約10分間、氷上で溶解物を設定してください。 </li><li> 4°Cで10分間14,000×gで遠心分離し、上清を収集する。 </li><li>ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定する。 </li><li> SDSローディング緩衝液中のタンパク質試料を希釈し、10％SDS-PAGEゲル中のタンパク質の20〜40μgのを読み込む。 </li><li> 1.5時間20mAでSDS-PAGEゲルを実行します。 </li><li> 85 V.で3時間、4℃での湿式転送システムでPVDF膜へトランスファータンパク質は、標的タンパク質の分子量に応じて転送時間を調整する。 </li><li> RTで1時間30分間、5％無脂肪乳でブロック膜。 </li><li>メンブレンWIインキュベート4℃のCO / Nにおける一次抗体番目。 200〜1：5000、実験的に各抗体のための最適希釈を決定する一次抗体の希釈の範囲は、通常1との間である。このプロトコルで使用される抗体の希釈は、「特定の試薬や機器一覧表」に記載されています。 <ol><li>スプライスアイ​​ソフォームを検出するために、特定のアイソフォームを認識する特異的抗体を使用しています。別の方法として、構成的エクソンコード領域中のエピトープを認識する抗体を使用し、それらの異なるタンパク質の大きさに基づいて、同時にスプライスアイ​​ソフォームを検出します。 </li><li>同時に、EMTマーカーについて免疫ブロッティングによりEMTを監視します。間葉系マーカーとして使用するE-カドヘリン、γ-カテニン、および上皮マーカーとしてオクルディン、およびフィブロネクチン、N-カドヘリンおよびビメンチン。 </li></ol></li><li> 5分間隔でTBS-T（50mMのトリス、150mMのNaCl、0.05％ツイーン20、pH7.4）で洗浄膜は三回。 </li><li> HRP結合二次蟻を有する膜をインキュベートRTで1時間10,000希釈：1 ibody。 </li><li> 5分間隔でTBS-Tで洗浄膜は三回。 </li><li>化学発光検出システムを用いてタンパク質を可視化し、オートラジオグラフィーフィルムに膜を公開します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明する手順は、誘導性EMTモデルにおける選択的スプライシングの検出を可能にする。このように、スプライスアイ​​ソフォーム発現の動的変化は、EMTの時間経過を通して捕捉することができる。非関連の細胞株とは異なる遺伝的背景が過度選択的スプライシングに影響を与える可能性があるため、この方法は、選択的スプライシングの比較のために異なるepithelial-または間葉表現する細胞株の使用よりも利点を有する。選択的スプライシングの変化について何らかの結論を引き出すことができる前に、しかし、EMTをうまく誘導は慎重にさまざまなEMTマーカーを使用して確認する必要があります。さらに、ここで説明するツイスト-ER誘導性EMTシステムに加えて、カタツムリ-ERまたはTGFβによって誘導されたもののような他のEMTシステムが実験結果11,30の検証のために推奨されている。 EMTの間のスプライスアイ​​ソフォームの切り替えは、RNAおよびタンパク質レベルの両方で検出することができる。スプライスイソフォーム特異的抗体は、タンパク質分析のために好ましい。アイソフォーム特異的抗...

上皮間葉転換（EMT）は、胚発生の間に臓器の形態形成や組織リモデリングを駆動発生プログラムです。異常に活性化されると、EMTは腫瘍転移および臓器線維症1,2を推進しています。説得力のある研究はcobble-が失われ、接着結合タンパク質E-カドヘリンの発現を抑制するなどのツイスト、カタツムリ、およびZEBなどのいくつかの転写因子、によって定義されたEMT過程において転写調節の重要性を記載している上皮形態と紡錘形の間葉表現型3-8のゲインのような石。 RNAのゲノムワイド解析による最近の研究では、スプライシングパターン上皮または間葉表現型9,10のいずれかと関連している遺伝子群が存在することを明らかにした。私たちの研究室からの作業は、機能的に選択的スプライシングとEMTを接続。細胞表面接着分子CD44を研究することによって、私たちはCD44 alternことが実証されativeスプライシングは、しっかりとEMTの間に規制され、より重要なのは、因果的に切り替えることがCD44スプライスアイソフォームは11 EMTに貢献します。 ヒト多エキソン遺伝子の95％までは、あるいは12〜14にスプライシングされる選択的スプライシングは、遺伝子調節の普及と保存されたモデルを表す。単一の遺伝子から複数のタンパク質産物を生成することにより、選択的スプライシングは、ヒトゲノムの複雑さの別の層を追加すること、タンパク質の多様性のために必須の機構を構成する。このように、選択的スプライシングの調節不全は、潜在的にヒトの疾患の原因となる重大な生物学的効果につながる可能性があります。実際、疾患における異常な選択的スプライシングはスプライソソーム機構をコードする遺伝子の変異は、一般的に骨髄異形成症候群26-28に見られる最近の知見を含め、十年以上15-25文書化されています。従って、選択的にスプライシングされたiを検出するための信頼できる方法を開発するsoforms EMTを含む多様な生物学的プロセスの研究に非常に重要である。 ここでは、誘導性EMTモデルを用いて選択的スプライシングの変化を検出するためのプロトコルを提供する。 PCRプライマーを設計し、スプライスアイ​​ソフォームを検出するための方法は、EMTの間の選択的スプライシングの研究のためだけでなく、他の生物学的プロセスにおける選択的スプライシングの研究のためのみならず、適当である。 EMTの間に​​選択的スプライシングを調査することは、より良い、癌の転移を治療するための効果的な戦略の開発を促進し、EMTおよび腫瘍転移のメカニズムを理解するために不可欠である。

<table><tbody><tr><td>4-ヒドロキシタモキシフェン</td>シ<td>グマ</td><td>H7904</td>エ<td>タノールに4-ヒドロキシタモキシフェンを200&#956;Mに溶かしてストック溶液を作ります。Cは光から保護します。</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Total RNA Isolation kit</td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>qRT-PCRアッセイ用試薬</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>qRT-PCRアッセイ用試薬</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td>Equipment for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>CD44 antibody</td><td>R&D Systems</td><td>BBA10</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>E-カドヘリン抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4065</td><td>1:2,500 免疫ブロッティング用希釈液; 1:50 免疫蛍光染色</td></tr><tr><td>用希釈液 γ;-カテニン抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>オクルージン抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>フィブロネクチン抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td></td><td>610077 1:5,000 希釈</td></tr><tr><td>N-カドヘリン抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2,000 希釈</td></tr><tr><td>ビメンチン抗体</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>希釈 GAPDH 抗体</td><td>ミリポアコーポレーション</td><td>MAB374</td><td>1:10,000 希釈</td></tr><tr><td>アマシャム ECL ウェスタンブロッティング検出試薬</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>化学発光システム</td></tr></tbody></table>

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

選択的スプライシングは、様々な生理学的および病理学的プロセスで発生する重要な細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)において重要な役割を果たします。ここでは、誘導性EMTモデルを用いて転写リプレッサーTwistを発現させることにより、EMT中の選択的スプライシングを検出する戦略について述べます。EMTは、細胞形態の変化、細胞間接合部でのE-カドヘリン局在の喪失、および上皮マーカーE-カドヘリンとγ-カテニンの喪失、間葉系マーカーN-カドヘリンとビメンチンの獲得などのEMTマーカーのスイッチ発現によって監視されます。 アイソフォーム特異的プライマーセットを使用して、関心のあるmRNAの選択的スプライシングを定量的RT-PCRで分析します。対応するタンパク質アイソフォームの産生は、イムノブロッティングアッセイによって検証されます。ここで説明するスプライスアイソフォームの検出方法は、他の生物学的プロセスにおける選択的スプライシングの研究にも適しています。

上記の手順は、EMTの間に​​選択的スプライシングを検出するための堅牢な方法を提供する。ツイストに誘導されるEMT時のCD44スプライスアイ​​ソフォームの切り替えの代表的な結果は、一例として以下に示す。 HMLE /ツイスト-ER細胞でのツイストによって誘導されるEMTは、細長い線維芽細胞表現型への上皮表現のような石畳、石からの移行（ 図2A）、上皮マーカーE-カドヘリン、γ-カテニンとオクルディンとの欠如によって特徴づけられた間葉マーカーフィブロネクチン、N-カドヘリン、およびビメンチン（ 図2B）のアップレギュレーション。さらに、EMTは、細胞-細胞間結合（ 図2C）におけるE-カドヘリンの局在の消失によって評価した。 EMT中のCD44スプライスアイ​​ソフォームの切り替え式は定量RT-PCRおよび免疫ブロッティングによって調べた。ヒトCD44遺伝子は、9変数のエクソンから構成されている。 CD44の選択的スプライ...

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

次の実験の全体的な目標は、EMT中の選択的スプライシングの変化を検出することです。これは、融合タンパク質の発現がねじれる誘導性EMTモデルを利用することによって達成されます。ヒト乳腺では、上皮細胞が第2ステップとしてタモキシフェン治療時に細胞にEMTを受けるように引き起こします。スプライスアイソフォームの発現は、アイソフォーム特異的プライマーセットを使用して定量的なR-T-P-C-Rによって分析され、RNAレベルでの選択的スプライシングの変化が明らかになります。次に、各アイソフォームに対応するタンパク質の存在量を免疫ブロッティングによって決定し、タンパク質レベルでのスプライスアイソフォームの発現を確認するために、定量的R-T-P-C-Rおよび免疫ブロッティング分析に基づいて、EMT中の目的の遺伝子における選択的スプライシングの変化を示す結果が得られます。この方法は、RN選択スプライシングおよびEMTの分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。 例えば、EMT中に選択的スプライシングがどのように制御されるか、この規制がEMTおよびEMT関連の病理学的プロセスにどのように影響するかなど。EMTは腫瘍の浸潤と転移を促進する上で重要な役割を果たすため、この技術の意味は癌治療に向けて立っています。ただし、この方法では、EMT中の選択的スプライシングに関する洞察を得ることができます。アイソフォーム特異的MRA検出法は、ニューロン分化における選択的スプライシングやプログラム細胞死の研究など、他のシステムにも適用できます。最初のステップは、ねじれER融合タンパク質を発現する細胞をプレート化し、次に細胞を10センチメートルの組織培養皿に二重に播種し、タモキシフェン溶液を準備して光保護し、上皮間葉転換を誘導するか、EMT処理細胞を20ナノモルのタモキシフェン含有培地で非タモキシフェン処理対照群にインキュベーションの2日後に0.01%エタノールを追加します。光学顕微鏡で10倍の倍率で写真を撮り、形態学的変化を記録します。次に、細胞を冷たいPBSで洗浄します。プレートの半分から細胞をRNA分離用のRNA溶解バッファーに掻き取り、残りの半分をタンパク質分析用の100マイクロリットルの氷冷リパバッファーに掻き取り、前に示したように両方のグループの細胞を継代し、20ナノモルのタモキシフェンまたはビヒクルで連続的に処理します。これらのステップを14日目まで隔日で繰り返し、その時点でタモキシフェン処理ツイストER細胞は紡錘形の間葉系形態を示すはずです。一方、ビヒクルで処理されたコントロールは、上皮の形態のような石畳を維持する必要があります。ここでは、エクソンインクルージョンの検出の例として、4つのエクソンプレムNNAを使用しています。可変エクソン 3 の内側にフォワードプライマーを設計し、近くの構成エクソン 4 の内側にリバースプライマーを設計します。変数エクソンの特異的増幅を可能にするため、エクソンスキップイベントを特異的に増幅するためのアイソフォームが含まれていました。構成的なエクソン 2 とエクソン 4 の接合部にまたがるプライマーを設計し、可変エクソン 3 が含まれていると破壊されます。遺伝子の全転写産物を検出するために、構成的エクソン4の内側にもう一方のプライマーを設計し、準備ができたら、ゲノムDNAまたはプレム NA.Design プライマーから増幅されたPCR産物を回避します。標準的なRNA抽出手順に従って、以前に収集した細胞サンプルからRNAを単離します。UV吸収によってRNAの濃度と品質を決定し、最初の鎖CD NAを合成し、最終容量20マイクロリットルで逆転写酵素反応を設定します。42°Cで1時間RT反応を行い、続いて70°Cで5分間インキュベートします。RT酵素をリアルタイムで不活性化します。PCRは、10マイクロリットルのサイバーグリーンマスターミックス、0.1〜1.0マイクロリットルのCD NAテンプレート、および5つのピコモルフォワードプライマーとリバースプライマーからなる20マイクロリットルの反応を設定しました。40サイクルのリアルタイムPCRをトリプリケートで実行します。解離曲線をチェックし、各プライマーセットで 1 つのピークが観察されることを確認します。増幅曲線の 2 次微分値を計算することにより、定量化サイクル値を取得します。この式で示されるように、デルタデルタCQ法を使用して、誘導サンプル中の標的mRNAの相対量を非誘導サンプルと比較して計算します。タンパク質分析のために採取した細胞を氷上で約10分間放置してから、遠心分離して上清を回収します。タンパク質濃度を決定した後、SDSローディングでサンプルを希釈し、20〜40マイクログラムのタンパク質をバッファーに入れ、10%SDSページゲルにロードします。SDSページゲルを20ミリアンペアで1.5時間泳動します。この時間の後、タンパク質を4°Cの湿式転写システムで85ボルトで3時間PVDFメンブレンに転写します。ターゲットタンパク質の分子量に応じて転写時間を調整します。次に、5%無脂肪乳でメンブレンを30分から1時間ブロックします。室温で、メンブレンを一次抗体と摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体は、構成的エクソンコーティング領域のエピトープを認識し、異なるタンパク質サイズに基づいてスリクアイソフォームを同時に検出します。同時に、免疫ブロッティングによってEMTをモニターします。EMTマーカー用。上皮マーカーとしてeec、ahern、γカテニン、オクルージンを使用し、間葉系マーカーとしてフィブロネクチンnカドヘリンとメントンを使用します。.翌日、TBSTでメンブレンを5分間隔で3回洗浄します。次に、HRP標識二次抗体とメンブレンを1〜10, 000希釈で室温で1時間インキュベートします。この後、TBSTでメンブレンを5分間隔で3回洗浄します。最後に、化学発光検出システムでタンパク質を可視化し、メンブレンを自動X線撮影フィルムに露光します。ねじれ誘発EMTは、上皮表現型のような丸石から細長い線維芽細胞表現型への移行によって特徴付けられ、上皮マーカーeカドヘリン、γカテニン、およびオクルージンの欠如、および間葉系マーカー、フィブロネクチンnカドヘリン、およびビメンチンのアップレギュレーションを示しました。さらに、EMTは、描かれた細胞細胞結合部でのECカドヘリン局在の喪失によって評価されました。ここでは、CD 44 スプライスアイソフォームの検出のためのプライマーデザインを示します。プライマーの位置は、異なる色の矢印で示されます。Q-R-T-P-C-R解析の結果は、TAM処理の14日後にCD 44 V mRNAの有意な減少とCD 44 s mRNAの増加を示しています。対照的に、CD44の全転写産物は、EMT中に変化しないままであり、Q-R-T-P-C-Rの結果と一致し、CD44Vのタンパク質レベルは著しく低下したが、一方、CD44sタンパク質の発現は、この手順に参加している間、大幅にアップレギュレーションされた。耳鼻咽喉科の誘導を成功させることは非常に重要であることを覚えておくことが重要です。そのため、耳鼻咽喉科は、耳鼻咽喉科マーカーの細胞形態変化の検出や細胞表面でのRINの局在化など、様々な方法で慎重に確認する必要があります。この手順に続いて、アッセイを管理するスプライシングレポーターのような他の方法を実行して、これらの作用要素と取引要因が開発後に選択的スプライシング規制にどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができますか?この技術は、RNA生物学、発生生物学、および癌生物学の分野の研究者が、正常な発生および癌転移中のEMTプロセスにおける選択的スプライシング制御を探求するための道を開きました。

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

簡単な方法は、種々の細胞型における間葉移行（EMT）上皮の誘導のために記載されている。免疫細胞化学によるEMT状態にある細胞の分析のための方法が含まれる。...

間葉転換を誘導し、上皮の分析

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。...

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

このレポートは、具体的には、哺乳動物細胞において標的遺伝子のスプライシングを調節する新規な人工スプライシング因子（ASFS）を設計および構築する生物工学の方法を記載しています。この方法はさらに、RNA代謝の他の側面を操作するための様々な人工的な要因を設計するために拡張することができます。...

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。...

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス...

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

このシグナル経路に関与するタンパク質および遺伝子発現を研究することにより、TGF-βシグナル伝達およびTGF...

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。...

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

細胞形態変化を観察し、免疫蛍光染色を用いたEndMT関連マーカー変化の発現を調べることにより、内皮細胞におけるTGF-β2誘導EndMTを調べる方法について述べる。CRISPR/Cas9遺伝子編集は、TGF-β2誘導EndMTにおけるその役割を調査するためにカタツムリをコードする遺伝子を枯渇させるために記述され、使用された。...

TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価

選択的スプライシング(AS)および選択的ポリアデニル化(APA)は、転写産物アイソフォームとその産物の多様性を拡大します。ここでは、バルクRNA-seqを分析するためのバイオインフォマティクスプロトコルと、実験条件によって変化するASおよびAPAを検出および視覚化するための3'エンドシーケンシングアッセイについて説明します。...

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

ダーク/ライト遷移テストは、マウスの不安様行動を測定するために最も広く使用されている試験の一つです。ここで、我々はテストを行う方法についての詳細な手順を示して映画を紹介。...

マウス用ダーク/ライト遷移テスト

学ぶ上皮間葉転移における選択的スプライシング変化の検出法。ヒト乳腺上皮細胞を用いた誘導型EMTモデルで、定量RT-PCRと免疫ブロッティングによりスプライスアイソフォームの発現を解析し、がん転移機構の理解に貢献する。

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

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