上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

次の実験の全体的な目標は、EMT中の選択的スプライシングの変化を検出することです。これは、融合タンパク質の発現がねじれる誘導性EMTモデルを利用することによって達成されます。ヒト乳腺では、上皮細胞が第2ステップとしてタモキシフェン治療時に細胞にEMTを受けるように引き起こします。

スプライスアイソフォームの発現は、アイソフォーム特異的プライマーセットを使用して定量的なR-T-P-C-Rによって分析され、RNAレベルでの選択的スプライシングの変化が明らかになります。次に、各アイソフォームに対応するタンパク質の存在量を免疫ブロッティングによって決定し、タンパク質レベルでのスプライスアイソフォームの発現を確認するために、定量的R-T-P-C-Rおよび免疫ブロッティング分析に基づいて、EMT中の目的の遺伝子における選択的スプライシングの変化を示す結果が得られます。この方法は、RN選択スプライシングおよびEMTの分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。 例えば、EMT中に選択的スプライシングがどのように制御されるか、この規制がEMTおよびEMT関連の病理学的プロセスにどのように影響するかなど。EMTは腫瘍の浸潤と転移を促進する上で重要な役割を果たすため、この技術の意味は癌治療に向けて立っています。

ただし、この方法では、EMT中の選択的スプライシングに関する洞察を得ることができます。アイソフォーム特異的MRA検出法は、ニューロン分化における選択的スプライシングやプログラム細胞死の研究など、他のシステムにも適用できます。最初のステップは、ねじれER融合タンパク質を発現する細胞をプレート化し、次に細胞を10センチメートルの組織培養皿に二重に播種し、タモキシフェン溶液を準備して光保護し、上皮間葉転換を誘導するか、EMT処理細胞を20ナノモルのタモキシフェン含有培地で非タモキシフェン処理対照群にインキュベーションの2日後に0.01%エタノールを追加します。

光学顕微鏡で10倍の倍率で写真を撮り、形態学的変化を記録します。次に、細胞を冷たいPBSで洗浄します。プレートの半分から細胞をRNA分離用のRNA溶解バッファーに掻き取り、残りの半分をタンパク質分析用の100マイクロリットルの氷冷リパバッファーに掻き取り、前に示したように両方のグループの細胞を継代し、20ナノモルのタモキシフェンまたはビヒクルで連続的に処理します。

これらのステップを14日目まで隔日で繰り返し、その時点でタモキシフェン処理ツイストER細胞は紡錘形の間葉系形態を示すはずです。一方、ビヒクルで処理されたコントロールは、上皮の形態のような石畳を維持する必要があります。ここでは、エクソンインクルージョンの検出の例として、4つのエクソンプレムNNAを使用しています。

可変エクソン 3 の内側にフォワードプライマーを設計し、近くの構成エクソン 4 の内側にリバースプライマーを設計します。変数エクソンの特異的増幅を可能にするため、エクソンスキップイベントを特異的に増幅するためのアイソフォームが含まれていました。構成的なエクソン 2 とエクソン 4 の接合部にまたがるプライマーを設計し、可変エクソン 3 が含まれていると破壊されます。

遺伝子の全転写産物を検出するために、構成的エクソン4の内側にもう一方のプライマーを設計し、準備ができたら、ゲノムDNAまたはプレム NA.Design プライマーから増幅されたPCR産物を回避します。標準的なRNA抽出手順に従って、以前に収集した細胞サンプルからRNAを単離します。UV吸収によってRNAの濃度と品質を決定し、最初の鎖CD NAを合成し、最終容量20マイクロリットルで逆転写酵素反応を設定します。

42°Cで1時間RT反応を行い、続いて70°Cで5分間インキュベートします。RT酵素をリアルタイムで不活性化します。PCRは、10マイクロリットルのサイバーグリーンマスターミックス、0.1〜1.0マイクロリットルのCD NAテンプレート、および5つのピコモルフォワードプライマーとリバースプライマーからなる20マイクロリットルの反応を設定しました。

40サイクルのリアルタイムPCRをトリプリケートで実行します。解離曲線をチェックし、各プライマーセットで 1 つのピークが観察されることを確認します。増幅曲線の 2 次微分値を計算することにより、定量化サイクル値を取得します。

この式で示されるように、デルタデルタCQ法を使用して、誘導サンプル中の標的mRNAの相対量を非誘導サンプルと比較して計算します。タンパク質分析のために採取した細胞を氷上で約10分間放置してから、遠心分離して上清を回収します。タンパク質濃度を決定した後、SDSローディングでサンプルを希釈し、20〜40マイクログラムのタンパク質をバッファーに入れ、10%SDSページゲルにロードします。

SDSページゲルを20ミリアンペアで1.5時間泳動します。この時間の後、タンパク質を4°Cの湿式転写システムで85ボルトで3時間PVDFメンブレンに転写します。ターゲットタンパク質の分子量に応じて転写時間を調整します。

次に、5%無脂肪乳でメンブレンを30分から1時間ブロックします。室温で、メンブレンを一次抗体と摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体は、構成的エクソンコーティング領域のエピトープを認識し、異なるタンパク質サイズに基づいてスリクアイソフォームを同時に検出します。

同時に、免疫ブロッティングによってEMTをモニターします。EMTマーカー用。上皮マーカーとしてeec、ahern、γカテニン、オクルージンを使用し、間葉系マーカーとしてフィブロネクチンnカドヘリンとメントンを使用します。.

翌日、TBSTでメンブレンを5分間隔で3回洗浄します。次に、HRP標識二次抗体とメンブレンを1〜10, 000希釈で室温で1時間インキュベートします。この後、TBSTでメンブレンを5分間隔で3回洗浄します。

最後に、化学発光検出システムでタンパク質を可視化し、メンブレンを自動X線撮影フィルムに露光します。ねじれ誘発EMTは、上皮表現型のような丸石から細長い線維芽細胞表現型への移行によって特徴付けられ、上皮マーカーeカドヘリン、γカテニン、およびオクルージンの欠如、および間葉系マーカー、フィブロネクチンnカドヘリン、およびビメンチンのアップレギュレーションを示しました。さらに、EMTは、描かれた細胞細胞結合部でのECカドヘリン局在の喪失によって評価されました。

ここでは、CD 44 スプライスアイソフォームの検出のためのプライマーデザインを示します。プライマーの位置は、異なる色の矢印で示されます。Q-R-T-P-C-R解析の結果は、TAM処理の14日後にCD 44 V mRNAの有意な減少とCD 44 s mRNAの増加を示しています。

対照的に、CD44の全転写産物は、EMT中に変化しないままであり、Q-R-T-P-C-Rの結果と一致し、CD44Vのタンパク質レベルは著しく低下したが、一方、CD44sタンパク質の発現は、この手順に参加している間、大幅にアップレギュレーションされた。耳鼻咽喉科の誘導を成功させることは非常に重要であることを覚えておくことが重要です。そのため、耳鼻咽喉科は、耳鼻咽喉科マーカーの細胞形態変化の検出や細胞表面でのRINの局在化など、様々な方法で慎重に確認する必要があります。

この手順に続いて、アッセイを管理するスプライシングレポーターのような他の方法を実行して、これらの作用要素と取引要因が開発後に選択的スプライシング規制にどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができますか?この技術は、RNA生物学、発生生物学、および癌生物学の分野の研究者が、正常な発生および癌転移中のEMTプロセスにおける選択的スプライシング制御を探求するための道を開きました。