Name: 植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学ぶ光捕集複合体のin vitro再構成法。ホウレンソウ葉からの色素抽出と大腸菌で発現したAPAタンパク質を用いて、色素タンパク質複合体を再構成し、分光特性を解析する手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、欧州研究評議会によってRCへのERC開始/統合助成金によって支援され、オランダの物質研究財団(FOM)によってFOMプログラム（10TM01）を通じて支援されました。

ホウレンソウの葉から1全顔料の抽出<ol><li> 20秒間、ブレンダーを使用します（ 表1を参照）、コールド研削バッファー100mlにホウレンソウの葉（〜20グラム）の一方の握りをホモジナイズする。 </li><li> 4℃で10分間1500×gで20ミクロン遠心濾液の孔径を有するナイロン布の二つの層を通して溶液を濾過する。 </li><li>ソフトアーティストは冷たい洗浄バッファー（ 表1参照）1ml中にブラシをペイントして葉緑体を含むペレットを再懸濁します。ペレットを再懸濁した後、4℃で10分間、10,000×gで遠心洗浄緩衝液50mlの溶液を加える。 </li><li>上清を除去し、穏やかに（ 表1参照）の洗浄緩衝液50ml中にペレット（チラコイド）を懸濁します。 </li><li>遠心分離し、4℃で10分間、10,000×gで解決し、完全に上清を除去。この時点で、顔料の酸化を避けるために、暗闇の中で、以下のステップを実行する。 </李&gt; <li>色素を抽出する（ 表1参照）〜のNa 2 CO 3で緩衝し、80％アセトン20mlを加える。時折ボルテックス、10分間氷上で解決策をしておきます。 </li><li> 4℃で15分間12,000×gでの遠心分離により細胞成分のペレット。 NOTE：顔料が完全に抽出されない場合は、ペレットが緑色を有しており、1.6を繰り返すべきであるステップう。 </li><li>分液ロートに上清を収集します。ジエチルエーテルの0.4ボリュームを追加し、激しく振り、ガスを排出するためのバルブを開きます。 </li><li> 0.33 M NaClを0.8ボリュームを追加し、激しく混ぜる。層を分離するための〜10分を許可します。上部のエーテル相を抽出顔料が含まれています。明確な下相を除去します。 注：分離が明確でない場合、相分離を改善するための解決策を凍結し、解凍。 </li><li>適切なガラス容器に分液ロートの上から注ぐことによって、エーテルを除去します。グランのスプーンを追加することでドライウラル無水硫酸ナトリウム。溶液を旋回し、エーテルから水分を吸収する乾燥剤のために約5分を可能にする。 注：硫酸ナトリウムが完全に一緒に凝集しているような場合は、この手順を繰り返します。エーテルを十分に乾燥したとき、いくつかのフリーフローティングの結晶があるはずです。水層を形成した場合、追加の無水硫酸ナトリウムを添加する前に、パスツールピペットでこれを削除してください。 </li><li>背後に固体硫酸ナトリウムを残し、新しいガラス容器にエーテルをデカント。 </li><li>ロータリースピードバックでまたはN 2気流下でエーテルを蒸発。 </li><li> 100％のアセトン10mlに完全に色素を溶解する。 </li><li> 80％アセトン1ml中に少量（〜3μl）を希釈し、吸収スペクトルを測定し、クロロフィルa / bの比とPorra らによって記載された方法とクロロフィル濃度を決定する。 （1989）15。 </li><li>アセトンになるまで一定分量を、ロータリースピードバック中またはN 2気流下で顔料を乾燥完全に蒸発。 -80℃で乾燥した顔料を格納します。 </li></ol>ホウレンソウからカロテノイドの2の抽出<ol><li> 、手順1.1〜1.5に従ってください。この時点で、顔料の酸化を避けるために、暗闇の中で、以下のステップを実行する。 </li><li>色素を抽出する（ 表1参照）のNa 2 CO 3で緩衝〜50ミリリットルの96％エタノール中にチラコイドペレットを再懸濁する。 5分間氷上で解決策をしておきます。 </li><li> 4℃で15分間12,000×gでの遠心分離により細胞成分のペレット。 NOTE：顔料が完全に抽出されない場合は、ペレットが緑色を有しており、2.2を繰り返すべきであるステップう。 </li><li>上清を収集し、（w / v）のケン化を開始するために80％のKOH 0.1ボリュームを追加。 </li><li> 4℃のCO / Nで溶液のままにし、しっかりと蓋をし、光から保護。 </li><li>分液ロートに溶液を収集します。ジエチルエーテルの1ボリュームを追加し、穏やかに混合。 </li><li> 0.8巻を追加0.33 M NaClをリューム、穏やかに混合。層を分離するための〜10分を許可します。上部のオレンジ色のエーテル相をケン化カロテノイドが含まれています。漏斗のストップコックを介して排出することによって、グリーン下相を除去します。 </li><li>水3容量を追加し、水酸化カリウムを除去するために穏やかに混合。層を分離することを許可する。注：上相が濁って表示された場合は、塩化ナトリウム（溶液200ml中のNaClの例、3グラム）を少量添加し、溶解するために穏やかに旋回。 </li><li>漏斗のストップコックを介して排出することによって下相を除去します。 </li><li> 、手順1.13に1.10に従ってください。 </li><li> 80％アセトン1ml中に少量（〜3μl）を希釈し、80％アセトン中で440 nmでの吸収スペクトルを測定する。濃度を決定するために、カロテノイドの平均係数絶滅を使用し、以下の式16（440 = 255ε）：カー[mg / mlの] =（ABS 440nmで / 225）×11（光路）= 1センチメートル。 </li><li> carotenoiを分注し、乾燥スピードバック中またはN 2気流下dsはすべてジエチルエーテルが蒸発されるまで。 -80℃で乾燥した顔料を格納します。 </li></ol> クラミドモナスから3全顔料とカロテノイドの抽出<ol><li> C.を育てる表面に液体培養の少量を広げることにより、シャーレ中の固体TAP培地17上のクラミドモナス 。細胞の緑色の層が表示されるまで20マイクロモルの写真の連続照明フラックスのPSAメートル-2秒-1の下で成長する。 </li><li>無菌接種ループを用いて、C.少量の収穫固体TAP培地からクラミドモナスとを1Lフラスコ中でTAP培地17 500ml中に細胞を置く。 20マイクロモルの写真の連続照明フラックスのPSAメートル-2秒-1の下で170rpmで攪拌しながら25℃で文化を育てる。 </li><li> 5-6日後、培養液を対数期（6×10 6細胞/ mlでの最後に到達する必要がありまたは750 nmで2〜2.5の光学密度）。遠心し、4℃で15分間、4,000×gで文化。 </li><li>全顔料抽出には、ステップ1.15に1.6に従ってください。 </li><li>全顔料抽出物の収率は、Cの完全な増殖培養の500ミリリットルから始まるクラミドモナスは、0.5mgのCHL a + b の / mlの濃度で遊ん5ミリリットルの溶液である。 </li><li>カロテノイドの抽出のために、ステップ2.12に2.2に従ってください。 </li></ol>封入体の精製4。 <ol><li>標準的な分子生物学的手順を用いて融合したC末端Hisタグをもたらす発現ベクターに目的のLHCタンパク質のコード配列をクローニングする。 E.に、この構築物を変換するそのようなBL21（DE3）などの大腸菌宿主株。 </li><li>準備溶解緩衝液、洗剤緩衝液、トリトン緩衝液、TE（ 表1）、1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）および適切な抗生物質を含むLB培地18。 </li><li> SINGLピック電子E.標準的な手順6を用いて、適切な抗生物質を含むLB培地約5中へ新たに画線し、プレートからの発現クローンを含む大腸菌コロニー 。少なくとも16時間、220rpmで攪拌​​しながら37℃で成長させる。 </li><li> LBの250ミリリットルと1リットルの三角フラスコに、O / N培養の2.5ミリリットルを追加し、適切な抗生物質を補充した。 </li><li> （OD 600が 〜0.6になるまで、または）、220rpmで、37℃で2〜3時間細胞を成長させる。 </li><li> 1 mMの最終濃度までIPTGを追加します。 220rpmで3〜4時間、37℃で細胞を増殖し続ける。 </li><li>予め秤量した遠心管中、4℃で5000×gで10分間の文化を遠心します。徹底的に上澄みを捨て、再び計量し、遠心管の重量を差し引くことにより、重量のペレットを決定。 </li><li> E.を再懸濁0.8ミリリットル/激しいボルテックスによる溶解バッファーのg中の大腸菌細胞ペレット。 注：あるいは、細胞ペレットを-80℃で凍結することができ後で使用するためのC。凍結したペレットで始まる場合は、溶解バッファーを追加する前に、完全に解凍することができます。 </li><li>細胞1グラム当たりのリゾチーム2mgを追加し、30分間、時折ボルテックスで濡れた氷上でインキュベートする。 </li><li> 20μg/ mlのDNA分解酵素、10mMのMgCl 2、1のNaCl、20μg/ mlのRNA分解酵素を追加します。ボルテックスし、30分間氷上に置く。 </li><li>細胞1グラムあたりの冷洗剤緩衝液2mlを加える。よく混合し、5分間、室温を保つ。 </li><li> 2ミリリットルの遠心管への転送は、（必要に応じて2のチューブに分割）。 4℃で12,000×gで10分間遠心分離し、封入体をペレット化する。 </li><li>冷たいトリトン緩衝液1mlを加え、完全に超音波処理することによりペレットを再懸濁し（20秒間隔で3パルス×5秒×50％出力）。注：超音波処理の間、寒さを保つために氷水に囲まれた小さなビーカーにチューブを持っている。複数のチューブの場合には、再懸濁した後に1チューブに再懸濁し、封入体を兼ね備えています。 </li><li> 12,000で10分間遠心分離4℃での遠心は、封入体をペレット化する。 </li><li>繰り返し手順4.13と4.14の2倍。 </li><li> Tritonバッファーを除去するための最終洗浄のために超音波処理を使用してコールドTE 1ml中封入体を再懸濁します。 4℃で12,000×gで10分間遠心分離し、封入体をペレット化する。 </li><li>超音波処理による風邪のTE 1ml中にペレットを再懸濁。 </li><li>そのようなブラッドフォードアッセイ19などの標準的な方法によってタンパク質濃度を評価する。 -20℃で封入体のストア分量。 </li></ol> 5。再構成吸光度はQyは地域（600〜750ナノメートル）で測定されている場合、このプロトコルは、典型的には4のODで再構成したタンパク質1〜2mlのが得られます。注意を手術中に適切な比率を維持するように注意すべきである量は、所望のように調節することができる。 <ol><li> 2X再構成緩衝液、20％OG、2 MのKCl、TE： 表1に記載したように、以下の溶液を調製する。以下のを実行します薄暗い光の中でTEPS。 </li><li> 2ミリリットルの微量遠心管中で400μlのTEの合計LHC封入体の800μgの再懸濁する。 2倍の再構成バッファと渦簡単に400μlのを追加します。 </li><li> 10 mMの最終濃度が、β-メルカプトエタノール（株式14.8 M）0.6を添加する。 98℃で1分間、タンパク質を加熱する。 3分間室温でボルテックス簡潔にと場所。 </li><li>精力的に1-2分間入浴ソニケーターで1分間、または場所をボルテックスすることによって30μlの100％エタノールの総乾燥したクロロフィル色素の500μgのプラス80μgのカロテノイド色素を懸濁します。 </li><li> 4℃で15,800×gで〜30秒顔料ミックスをスピンしてないペレットがないことを確認してください。ペレットがある場合は、ボルテ​​ックスおよび/または超音波処理を繰り返します。重要：再懸濁し、スピンした後、すぐにタンパク質に顔料を追加したり、それを集約することができますし、再び再懸濁する必要があります。 </li><li>ボルテックスしながらゆっくりと冷却してタンパク質に顔料ミックスを追加します。ボルテックス5-10 sに進みますECおよび湿った氷上にチューブを配置すること。タンパク質がチューブの上部をオーバーフローすることができますようにあまりにも積極的にボルテックスしないように注意してください。 </li><li> 、20％のオクチルβ-D-グルコピラノシド（OG）（最終濃度2％）の94μl加え簡単にボルテックスし、氷上で10分間保つ。 </li><li> 、塩化カリウム2 M（最終濃度150〜200 mM）を90μl加え手短にボルテックスし、氷上で20分間続ける。注：カラム調製（第6節）は、この時点で開始することができます。 </li><li> 4℃で15,800×gで10分間スピン。 10ミリリットルチューブに（LDS沈殿した）ペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。寒さと、光から保護してください。 </li></ol> 6。ニッケルカラム精製<ol><li> OG緩衝液、OGリンス緩衝液、溶出バッファー： 表1に記載したように、以下の溶液を調製する。 </li><li>空気が、このステップと次のステップの間に、列の中に入っていないことを確実にする蠕動ポンプにニッケルセファロースカラム（1ミリリットル）または同等を接続します。 </li><li> Tの速度を設定します彼は1ミリリットル/分にポンプおよびストレージ·ソリューションを除去するために水5〜10mlのカラムをすすいでください。 </li><li> OGバッファ3-4 mlのカラムを平衡化する。 </li><li>カラムにタンパク質試料負荷にOGバッファ3-4 mlを加え。注記：タンパク質はLDSの除去後10分よりも長い間、氷上で座っている場合には、追加のLDS沈殿を除去するために1分間、4℃で15,800×gで再度スピン。 </li><li> OG緩衝液5mlでカラムを洗浄します。 </li><li> OGリンス緩衝液2mlでカラムを洗浄します。 </li><li> 3ミリリットルの溶出バッファーで結合したタンパク質を溶出。再構成されたタンパク質が含まれている緑色の溶出を収集します。注：これは通常、合計で約1ミリリットルである。 </li></ol> 7。スクロース勾配遠心<ol><li>ショ糖溶液、0.06％のβ-DM、0.01MのHEPES、pH7.6の表1に記載したように、以下の溶液を調製する。 </li><li>ショ糖溶液を用いて超遠心管を記入し、CO / N O -20℃で凍結rは-80°Cのために少なくとも1時間。 </li><li>冷凍庫からチューブを外し、4℃で邪魔されずに解凍することができます。注：凍結/解凍工程は、0.1〜1Mのスクロース勾配を作成します。 15mlチューブは、典型的には約3時間で解凍。 </li><li>慎重にステップ6.8のニッケルセファロースカラムから溶出された緑色の画分として、上から同じボリュームを削除します。その後、勾配を乱さないようにゆっくりと上に再構成されたサンプルをロードします。 </li><li>加速とブレーキなしで停止を遅らせるように設定18時間SW-41またはSW-60スウィングローターを使用して、超遠心分離機内のバランス管4℃200,000×gでスピン。 </li><li>慎重にピンセットでチューブホルダの勾配を取り出します。トップからの画分を収集する鈍い開口部を有する長い針と注射器を使用してください。注：別の方法として、針でチューブを穿刺し、滴を収集することにより、下からの画分を収集します。 </li></ol>

著者は利益相反がないことを宣言します

膜タンパク質は勉強するのは簡単ではありません。天然の膜タンパク質の単離は、タンパク質を損傷し、必須の補因子を除去することができる界面活性剤と脂質二重層を可溶化する必要性によって複雑になる。これらのタンパク質は、集光性複合体の場合のように、それは、単一の複合体の精製が困難になる、また、生体膜において低レベルで存在するかもしれない、または密接に関連するタンパク質と混合する。 E.における異種タンパク質の発現大腸菌およびインビトロでの再構成中 これらの問題を回避する可能性を提供する。従ってネイティブ複合体20,21,23とのものと非常に類似した特性を有する複合体におけるインビトロ再構成および折り畳まれたタンパク質の精製の ​​結果が均質24にまで精製することができない複合体を研究するために使用することができ- 27。 この方法は簡単にattainabさほうれん草を使用しています全顔料及​​びカロテノイド調製物のためのソースとしてル一年中、。藻類に対する天然のタンパク質のいくつかの再構成のために、藻類から精製された顔料の使用は、異なる顔料組成物に好適である。クロロフィルa / bの比およびクロロフィル/車比に関係なく、顔料ソースの同じままである。 これは、再構成の効率は通常約35％で28であることを認識することが重要です。したがって、再構成後の溶液から非結合顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去することが必要である。二段階精製プロトコルは、（また結果を参照）、このプロトコルで提示される。しかし、ショ糖勾配ステップはアポとホロタンパク質の完全な分離を可能にしないことに留意すべきである。アポタンパク質は、機能的測定を妨害しない、したがって顔料を含有しない限り、ほとんどの分析のため、これは問題ではない。しかし、ケースでは、完全に、FRからアポタンパク質を除去することが必要である再構成された複合体（例えば、タンパク質の化学量論に顔料を計算する）を含有するアクションは、陰イオン交換カラムは、（参照Passarini ら詳細については2009年）を使用することができる。 試験管内で孤立した顔料を用いて、組換え集光タンパク質をリフォールディングする能力は、それによって得られた複合体の特性を変化させる、さまざまな方法で再構成「環境」を変更することにより、複合体を「操る」する機会を提供する。例えば、再構成中の顔料組成物を変更すると、変更された顔料組成物との複合体をもたらすことができる。この機能は、各種顔料を複合体の構造および安定性に及ぼす影響を調べるために利用することができる。 1と2.9のクロロフィル/車比：1通常ホウレンソウから得られた顔料調製物は、3のクロロフィルa / bの比を有する。この比率は、一般的にn個と同じ性質を用いて再構成タンパク質を産生する1をative。 33 -しかし、精製されたクロロフィルAまたはBの添加によりクロロフィルa / bの比の調整は、結合部位30の選択性を変化させることに起因する異なる顔料の結合に影響を与えることができる。顔料の結合部位の大部分はクロロフィルa またはクロロフィルbのための完全に選択的ではないが、異なる親和性10,30,34であるが、両方を収容することができるので可能である。 38 -同様に、カロテノイド結合部位はまた、複数のキサントフィル種8,35に対応できることが示された。 CP26、各種の顔料組成物を用いて、高等植物、他の色素-タンパク質複合体の別の再構成は、 表2 39に示されている。これらの再構成は、特定の顔料39の結合部位の親和性を評価した。これは、同じ顔料cを有する複合体を得るために、ことに留意することが興味深い。1：ネイティブ一つとしてompositionは、顔料ミックスのクロロフィルa / bの比は3でなければなりません。これは高等植物20,40のすべてのLHC複合体のためのケースであると思われる。 再構成技術を用いて、分子生物学の組み合わせがクロロフィル結合複合体の性質をより詳細に研究することができます。 44 -異なるタンパク質複合体の安定性及び折り畳みドメイン、またはタンパク質-タンパク質相互作用への関与の重要性は、アポタンパク質を切り捨てる又はランダム突然変異誘発8,41を実行することによって決定されている。 52 -異なる顔料の調整のための重要な単一のアミノ酸残基は、個別の顔料の特性を分析したり、複雑な10,28,29,45の機能および安定性への寄与を評価するために、部位特異的変異誘発によって変更することができる。 図6ははと​​Lhcb4（CP29）を再構成した位置216 53位のヒスチジンの変異。野生型および突然変異体複合体の顔料組成物の比較は、変異が標的部位は、WT複合体中のクロロフィルa を収容することを示す、分子1クロロフィルの喪失を誘導することを示す。 WTおよび変異体の吸収スペクトルの違いは、顔料の含有量に対して正規化の際に、また、失われた顔料の吸収特性を示している。この場合、差はクロロフィルHis216によってコーディネートこの波長で吸収する（この変異体についての詳細は、分光特性がモッツォら 、2008年53参照 ）ことを示し、680nmでの主ピークに見ることができる。変異分析はまた、顔料54の分光特性に及ぼす環境の影響を決定するために用いることができる。 結論として、集光性タンパク質は、容易に顔料proteiその結果、in vitroで再構成することができる天然の複合体と非常に類似した特性を有するn複合体。また、さらなる研究のために高い収率および純度でタンパク質調製物を提供しながらこのように、天然のタンパク質を単離することの困難さは、排除される。 3の重要性：本物の複合体の製造における1クロロフィルa / bの比が強調され、再構成された野生型および変異LHCsの実施例は、技術の応用を説明するために提供される。

植物や藻類の光合成装置は、膜内在性（CHL a）のクロロフィル a を結合するタンパク質、B（クロロフィルb）およびカロテノイド（車）が挙げられる。これらの色素-タンパク質複合体は、収穫光エネルギーで活性であり、それが電荷分離2を促進するために使用される反応中心にその励起エネルギーを伝達する。それらはまた、高い光損傷3,4から光合成装置を保護調節フィードバック機構に関与している。集光複 ​​合体（LHCs）は植物や藻類5の関連タンパク質の大きなファミリーで構成されている。 ファミリーの各メンバーの均質な精製は、複合体の高度に類似の化学的及び物理的性質によって複雑化されている。また、精製手順は、しばしば、顔料または脂質などの他の潜在的な補因子の損失をもたらす。 インビトロ再構成representsは強力な方法は、これらの問題を克服する。光化学系II（LHC-II）に関連付けられているLHCは、最初1987年1 Plumleyとシュミットによってin vitroで再構成された。研究者は、植物の葉緑体とは別に脱脂タンパク質及び顔料を抽出した後、リチウムの存在下での顔料と熱変性タンパク質を組み合わせた凍結融解1の3つのサイクルが続くドデシル硫酸（LDS）、。これらは、再構成されたLHC複合体のスペクトル特性は、植物から精製された複合体と非常に類似していたことを示した。何らかの固有の自己組織化機能への可能性が高いLHC顔料 - タンパク質複合体を再構成の容易さは、生物から精製された複合体を単離することが困難であるとともに、他の研究者による方法の迅速な採択につながった。 大腸菌（E. coli）で過剰発現光合成タンパク質の再構成1990年6ポールセンらによって達成された。E.で大腸菌は、過剰発現した膜タンパク質は、典型的には、その設備のそれらの精製、封入体に含まれている。再構成は、タンパク質の折り畳みを開始する顔料を添加したLDSの存在下で組換えタンパク質を含有する封入体の熱変性によって達成される。 LHCII複合体の折り畳みは、2段階のプロセスである：まず、 クロロフィル a が 1分以内に結合している;第二、 クロロフィル b は、数分7かけ結合し、安定化される。 フォールディング動力学への洞察を提供することに加えて、部位特異的突然変異誘発と組み合わせたインビトロでの再構成において安定性（ 例えば、8,9）または顔料の調整（ 例えば、10）に特異的なアミノ酸の同定が重要で可能にした。そのような顔料組成物または洗剤のようなパラメータを調整することによってリフォールディング条件の操作はまた、要素criticaを同定したそのようなLHCIIコンプレックスのキサントフィルの要件として適切な折り畳みのためのL（ 例えば、1,11）。さらに、複合体に結合された個別の顔料の特性の調査は生体内で再構成された複合体を使用可能であった（ 例えば、10）。 ここで説明する方法は、ほうれん草と緑藻クラミドモナスから色素（クロロフィルやカロテノイド）を単離することから始まる。EからLHCのタンパク質の発現および精製封入体の形で大腸菌を LHCとNiアフィニティーカラムによるその後の精製の ​​再構成に続いて、次に詳細に説明する。最後のステップでは、再構成された複合体はさらに自由顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去するために、スクロース勾配遠心分離により精製される。このプロトコルは、以上の異なる研究所によって導入されたいくつかの変更を組み込んだ最適化された手順を示して時間1,6,10,12 -14。

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン布&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &mu;m毛穴</td></tr><tr><td>ソフトアーティストペイントブラシ&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>粉</td><td></td><td></td><td></td>乳</tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &beta;-D-グルコピラノシド</td><td>Sigma</td><td>O8001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超遠心機 XL</td>、<td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、TAPミウム</td><td></td><td></td>、<td>レファレンス17</td></tr>、<tr><td>LBミディアム</td><td></td><td></td>、<td>レファレンス19</td></tr></tbody></table>

植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

植物および緑藻類では、光は光捕集複合体（LHCs）、クロロフィルおよびカロテノイド座標内在性膜タンパク質のファミリーによって捕捉される。 インビボでは 、これらのタンパク質はチラコイド膜に挿入されている複合体を形成する顔料を用いて折り畳まれる葉緑体の。ファミリーのメンバーの化学的および物理的特性の高い類似性は、一緒に彼らは簡単に単離中の顔料を失う可能性があるという事実と、天然の状態での精製が困難なことができます。 LHCsの均質な調製物を得るための別のアプローチは、それが天然のものと非常に類似した特性を有する複合体が得られる、精製された顔料および折り畳まれていないアポタンパク質から出発して、インビトロでこれらの複合体を再構成することが可能であったことを示した1987年1 Plumleyシュミットによって開発された複合体。これは、in vitro細菌発現された組換えタンパク質の使用への道を開い</eM&gt;再構成。再構成方法は、さまざまな理由で強力である：（1）個別の複合体の純粋な調製物を得ることができる、（2）顔料組成物は、構造と機能するようにそれらの寄与を評価するように制御することができる、（3）組換えタンパク質は、機能を研究するために突然変異させることができる個別の残基（ 例えば、顔料結合部位）、またはタンパク質ドメイン（ 例えば、タンパク質-タンパク質相互作用、フォールディング）の役割。この方法は、いくつかの研究室で最適と光捕集複合体の大部分に適用されている。ここに記載されているプロトコルは、現在、私たちの研究室で使用されるin vitroでの集光性複合体を再構成する方法を詳述 および方法の用途を説明する実施例を提供する。

このプロトコルは、光収集複合体のin vitroでの再構成を詳述しています。これらの内在性膜タンパク質は、クロロフィルとカロテノイドを調整し、高等植物や緑藻類の光を収穫する役割を担っています。

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

次の実験の全体的な目標は、植物や藻類のin vitro光捕集色素タンパク質複合体を再構成することです。これは、ほうれん草の葉や藻類の培養物から色素を抽出し、大腸菌でAPAプロテを過剰に発現させることによって達成されます。第2のステップとして、APAプロテを顔料と混合して、再構成された複合体を得る。次に、再構成された色素タンパク質複合体を過剰な色素から精製し、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、および循環理神学に基づいて、再構成された色素タンパク質複合体と天然のものと同様の分光特性を示すアンフォールドタンパク質の結果が得られます。この手順の主な利点は、比較的大量の色素タンパク質複合体を得ることを可能にし、また、異なる組成の変異型タンパク質および顔料混合物を用いて複合体を操作することができることであり、この手順を実証するのは、研究室の大学院生であるアルベルト・ナがホウレンソウの葉から全色素を抽出するための手順を開始することである。ブレンダーを使用して一握りのほうれん草を均質化し、100ミリリットルの冷間粉砕バッファーに約20グラムを20秒間放置します。直径が20マイクロメートルの小さいナイロン布の2層で溶液をろ過し、濾液を1, 500Gで10分間遠心分離します。摂氏4度で。上清を取り除き、1ミリリットルの冷洗浄緩衝液を追加します。葉緑体を含むペレットを柔らかいアーティストの絵筆で再懸濁します。ペレットが再懸濁されたら、50ミリリットルの洗浄、緩衝液、遠心分離機、10, 000Gの溶液を10分間加えます。摂氏4度で、上澄みを取り除き、50ミリリットルの洗浄緩衝遠心分離機、10, 000Gの溶液で摂氏4度で10分間ペレットを穏やかに再懸濁し、この時点から上澄みを完全に除去します。この手順は、暗闇の中で実行する必要があります。顔料の酸化を避けるために、炭酸ナトリウムで緩衝した約20ミリリットルの80%アセトンを加えて顔料を抽出し、溶液を氷の上に10分間放置します。ボルテックスは、摂氏4度で15分間、12, 000Gで遠心分離することにより、細胞成分を時折パレット化します。全顔料抽出により、白いペレットが得られるはずです。スナットをセパリーファンネルに集めます。0.4容量のダチルエーテルを追加します。激しく振って、ガスを排出するためにバルブを開けてください。0.8容量のポイント33モル塩化ナトリウムを加え、激しく混合します。レイヤーが分離するまで約 10 分待ちます。上部のエーテル相には、抽出された顔料が含まれています。透明な下相を取り外して廃棄します。エーテルをセパリーファンネルの上部から適切なガラス容器に注いで取り出します。スプーン一杯の粒状の無水硫酸ナトリウムを加えてエーテルを乾かします。溶液を渦巻き、乾燥剤がエーテルから水を吸収するまで約5分間待ちます。エーテルが十分に乾燥したとき。いくつかの自由浮遊結晶があり、硫酸ナトリウムの凝集があってはなりません。エーテルを新しいガラス容器にデカントし、硫酸ナトリウムを固体の後ろに残し、顔料を分注し、アセトンが完全に蒸発するまで回転速度vacで乾燥させます。乾燥させた顔料はマイナス80°Cで保管してください。ほうれん草からのケラチノイドの抽出はこのビデオには示されていませんが、乾燥した色素も摂氏マイナス80度で保存されます。再構成のための光捕集複合体またはLHCを発現させ、封入体の形で大腸菌から精製した。再構成を成功させるためには、色素タンパク質とバッファーの使用量との比率が重要です。この手順は、薄暗い場所で実行する必要があります。800マイクログラムのLHC封入体を合計400マイクロリットルのteに再懸濁します。2ミリリットルのフージチューブに、400マイクロリットルの2×再構成、バッファー、ボルテックスを加えます。0.6モルのβ mar CAPTAエタノールストックを14.8マイクロリットル簡単に追加します。最終濃度を10ミリモルにするには、タンパク質を摂氏98度で1分間加熱します。短時間ボルテックスし、室温で3分間置きます。500マイクログラムの総乾燥クロロフィル顔料と80マイクログラムのケラチノイド顔料を30マイクロリットルの100%エタノールに再懸濁して、激しくボルテックスします。.1分間。顔料混合物を摂氏4度で15,800Gで約30秒間回転させ、スピン直後にペレットがないことを確認し、ボルテックスしながら冷却したタンパク質に顔料混合物をゆっくりと加えます。タンパク質がチューブの上部からオーバーフローする可能性があるため、激しく渦を巻かないように注意してください。5〜10秒間ボルテックスを続けてから、チューブを濡れた氷の上に置きます。20%octal、ベータDのglucocide、またはogの94マイクロリットルを加えて2%Vortexの最終濃度を短時間得るし、10分間氷上で保つ、90マイクロリットルの2モル塩化カリウムを加えて150から200マイクロモルモルの最終濃度を得るため。短時間渦巻き、20分間氷の上に保ちます。15,800 GSで摂氏4度で10分間回転します。SUPナタントをペレットを乱さずに10ミリリットルのチューブに移します。ナチンを冷たく保ち、光から保護してください。この手順は、プロトコルテキストで説明されているように、1ミリリットルのニッケルSROsカラムを準備することから始めます。タンパク質サンプルに3〜4ミリリットルのOGバッファーを加え、サンプルをカラムにロードします。カラムを5ミリリットルのOGバッファーでリンスし、続いて2ミリリットルのOGリンスバッファーですすぎます。結合したタンパク質を3ミリリットルのeluバッファーで溶出します。再構成されたタンパク質を含む緑色のエルを収集します。スクロース勾配は、プロトコルテキストに記載されているように、ニッケルSROsカラムから言及された緑色画分と同じ体積で、勾配の上部から慎重に除去して調製されます。再構成したサンプルをゆっくりと上にロードし、勾配を乱さないように注意します。チューブとバランスをS SW 41またはSW 60スイングバケットローターに入れ、200、000Gの超遠心分離機で摂氏4度で18時間回転させ、ゆっくりと加速し、休憩なしで停止します。超遠心分離が完了したら、鉗子を使用してチューブホルダーからグラジエントを慎重に取り出します。緑の帯は、収集する分数です。CP 24の吸収スペクトル。in vitroで再構成されたクロロフィルAB結合タンパク質を、天然複合体のスペクトルと比較します。同一のスペクトルは、実質的に同一の顔料組成および組織体質を示す。再構成された複合体の品質は、蛍光分光法によっても評価できます。顔料は異なる波長で励起すると蛍光を発するため、クロロフィルAは440ナノメートル、クロロフィルBは475ナノメートル、ジルは500ナノメートルです。再構成されたCP 24野生型複合体の蛍光発光スペクトルは、最大限に正規化されたクロロフィルBおよびXANTHEフィルからクロロフィルAへの効率的なエネルギー移動を示しています。遊離クロロフィルAの存在は、代わりに約675ナノメートルの追加発光につながります。再構成されたCP 24錯体と天然のCP 24錯体の両方の475ナノメートルの引用における蛍光発光スペクトルは、再構成された錯体が正しく折り畳まれていることを示す681ナノメートルの単一のピークを示しています。再構成されたCP24とネイティブコンプレックスも非常によく似た円形のカリスマスペクトルを示しています。異なる顔料の配位に重要な単一アミノ酸残基は、個々の顔料の特性を分析したり、複合体の機能と安定性への寄与を評価したりするために変更することができます。ここに示されているのは、野生型と変異したCP29の吸収スペクトルです。緑の線は2つのプロットの違いを示しています テートすると、SUSEグラジエントを含むこの手法は、適切に実行されれば24時間で超遠心分離を行うことができます。

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等し​​い体積を質量分析によって混合し、分析する。...

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

この原稿は、油中水型エマルジョンに基づく疎水性顔料と水溶性タンパク質を組み立てるための単純かつ高スループットの方法が記載されています。私たちは、Eで表したアブラナ属植物の組換え水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs）の4種類でネイティブクロロフィルの組み立て方法の有効性を実証します大腸菌 。...

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

ここでは、凍結破壊された植物組織を研究する手順を説明します。高圧凍結葉試料は凍結破砕され、二重層コーティングされているため、保存状態の良い凍結水和試料が得られ、クライオ走査型電子顕微鏡を用いて高倍率でイメージングされ、ビーム損傷が最小限に抑えられます。...

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

フコキサンチン クロロフィル a/c 結合タンパク質 (FCP)...

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

プロトコル植物の解明のためチラコイドのタンパク質の複雑な組織と組成ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルとゲルの電気泳動 (BN-PAGE) と 2 D SDS...

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

生理活性チラコイドの高収率分離のためにここのプロトコルおよび葉緑体ツイン アルギニン転流 (cpTat)、分泌 (cpSec1)、およびシグナル認識粒子 (cpSRP)...

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

ネイティブ グリーン ゲル電気泳動による可溶化されたチラコイドの複合体を分離するためのプロトコルをご紹介します。緑のゲルのバンドが後で時間相関単一光子計数 (ピコ)...

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

本プロトコルは、スペクトル分析に基づく紅藻におけるフィコビリタンパク質変化の段階的な自己蛍光イメージングおよび評価を記載する。これは、希少な材料しか利用できず、実験室条件下で細胞がゆっくりと成長するか、まったく成長しない場合に、極端な生息地への細胞の適応を評価するためのラベルフリーで非破壊的な方法です。...

紅藻生理機能を評価するための自己蛍光イメージング

このプロトコルは安定した形質転換剤の生産をもたらす緑の微細藻類Chlorella...

Agrobacterium tumefaciens-緑色微細藻類Chlorella vulgarisの遺伝子工学

単一分子顕微鏡は、核輸送への新たな洞察を提供approch。...

核輸送の1分子イメージング

学ぶ光捕集複合体のin vitro再構成法。ホウレンソウ葉からの色素抽出と大腸菌で発現したAPAタンパク質を用いて、色素タンパク質複合体を再構成し、分光特性を解析する手法を解説します。

植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

さらに動画を探す