植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

次の実験の全体的な目標は、植物や藻類のin vitro光捕集色素タンパク質複合体を再構成することです。これは、ほうれん草の葉や藻類の培養物から色素を抽出し、大腸菌でAPAプロテを過剰に発現させることによって達成されます。第2のステップとして、APAプロテを顔料と混合して、再構成された複合体を得る。

次に、再構成された色素タンパク質複合体を過剰な色素から精製し、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、および循環理神学に基づいて、再構成された色素タンパク質複合体と天然のものと同様の分光特性を示すアンフォールドタンパク質の結果が得られます。この手順の主な利点は、比較的大量の色素タンパク質複合体を得ることを可能にし、また、異なる組成の変異型タンパク質および顔料混合物を用いて複合体を操作することができることであり、この手順を実証するのは、研究室の大学院生であるアルベルト・ナがホウレンソウの葉から全色素を抽出するための手順を開始することである。ブレンダーを使用して一握りのほうれん草を均質化し、100ミリリットルの冷間粉砕バッファーに約20グラムを20秒間放置します。

直径が20マイクロメートルの小さいナイロン布の2層で溶液をろ過し、濾液を1, 500Gで10分間遠心分離します。摂氏4度で。上清を取り除き、1ミリリットルの冷洗浄緩衝液を追加します。

葉緑体を含むペレットを柔らかいアーティストの絵筆で再懸濁します。ペレットが再懸濁されたら、50ミリリットルの洗浄、緩衝液、遠心分離機、10, 000Gの溶液を10分間加えます。摂氏4度で、上澄みを取り除き、50ミリリットルの洗浄緩衝遠心分離機、10, 000Gの溶液で摂氏4度で10分間ペレットを穏やかに再懸濁し、この時点から上澄みを完全に除去します。

この手順は、暗闇の中で実行する必要があります。顔料の酸化を避けるために、炭酸ナトリウムで緩衝した約20ミリリットルの80%アセトンを加えて顔料を抽出し、溶液を氷の上に10分間放置します。ボルテックスは、摂氏4度で15分間、12, 000Gで遠心分離することにより、細胞成分を時折パレット

全顔料抽出により、白いペレットが得られるはずです。スナットをセパリーファンネルに集めます。0.4容量のダチルエーテルを追加します。

激しく振って、ガスを排出するためにバルブを開けてください。0.8容量のポイント33モル塩化ナトリウムを加え、激しく混合します。レイヤーが分離するまで約 10 分待ちます。

上部のエーテル相には、抽出された顔料が含まれています。透明な下相を取り外して廃棄します。エーテルをセパリーファンネルの上部から適切なガラス容器に注

スプーン一杯の粒状の無水硫酸ナトリウムを加えてエーテルを乾かします。溶液を渦巻き、乾燥剤がエーテルから水を吸収するまで約5分間待ちます。エーテルが十分に乾燥したとき。

いくつかの自由浮遊結晶があり、硫酸ナトリウムの凝集があってはなりません。エーテルを新しいガラス容器にデカントし、硫酸ナトリウムを固体の後ろに残し、顔料を分注し、アセトンが完全に蒸発するまで回転速度vacで乾燥させます。乾燥させた顔料はマイナス80°Cで保管してください。

ほうれん草からのケラチノイドの抽出はこのビデオには示されていませんが、乾燥した色素も摂氏マイナス80度で保存されます。再構成のための光捕集複合体またはLHCを発現させ、封入体の形で大腸菌から精製した。再構成を成功させるためには、色素タンパク質とバッファーの使用量との比率が重要です。

この手順は、薄暗い場所で実行する必要があります。800マイクログラムのLHC封入体を合計400マイクロリットルのteに再懸濁します。2ミリリットルのフージチューブに、400マイクロリットルの2×再構成、バッファー、ボルテックスを加えます。

0.6モルのβ mar CAPTAエタノールストックを14.8マイクロリットル簡単に追加します。最終濃度を10ミリモルにするには、タンパク質を摂氏98度で1分間加熱します。短時間ボルテックスし、室温で3分間置きます。

500マイクログラムの総乾燥クロロフィル顔料と80マイクログラムのケラチノイド顔料を30マイクロリットルの100%エタノールに再懸濁して、激しくボルテックスします。.1分間。顔料混合物を摂氏4度で15,800Gで約30秒間回転させ、スピン直後にペレットがないことを確認し、ボルテックスしながら冷却したタンパク質に顔料混合物をゆっくりと加えます。

タンパク質がチューブの上部からオーバーフローする可能性があるため、激しく渦を巻かないように注意してください。5〜10秒間ボルテックスを続けてから、チューブを濡れた氷の上に置きます。20%octal、ベータDのglucocide、またはogの94マイクロリットルを加えて2%Vortexの最終濃度を短時間得るし、10分間氷上で保つ、90マイクロリットルの2モル塩化カリウムを加えて150から200マイクロモルモルの最終濃度を得るため。

短時間渦巻き、20分間氷の上に保ちます。15,800 GSで摂氏4度で10分間回転します。SUPナタントをペレットを乱さずに10ミリリットルのチューブに移します。

ナチンを冷たく保ち、光から保護してください。この手順は、プロトコルテキストで説明されているように、1ミリリットルのニッケルSROsカラムを準備することから始めます。タンパク質サンプルに3〜4ミリリットルのOGバッファーを加え、サンプルをカラムにロードします。

カラムを5ミリリットルのOGバッファーでリンスし、続いて2ミリリットルのOGリンスバッファーですすぎます。結合したタンパク質を3ミリリットルのeluバッファーで溶出します。再構成されたタンパク質を含む緑色のエルを収集します。

スクロース勾配は、プロトコルテキストに記載されているように、ニッケルSROsカラムから言及された緑色画分と同じ体積で、勾配の上部から慎重に除去して調製されます。再構成したサンプルをゆっくりと上にロードし、勾配を乱さないように注意します。チューブとバランスをS SW 41またはSW 60スイングバケットローターに入れ、200、000Gの超遠心分離機で摂氏4度で18時間回転させ、ゆっくりと加速し、休憩なしで停止します。

超遠心分離が完了したら、鉗子を使用してチューブホルダーからグラジエントを慎重に取り出します。緑の帯は、収集する分数です。CP 24の吸収スペクトル。

in vitroで再構成されたクロロフィルAB結合タンパク質を、天然複合体のスペクトルと比較します。同一のスペクトルは、実質的に同一の顔料組成および組織体質を示す。再構成された複合体の品質は、蛍光分光法によっても評価できます。

顔料は異なる波長で励起すると蛍光を発するため、クロロフィルAは440ナノメートル、クロロフィルBは475ナノメートル、ジルは500ナノメートルです。再構成されたCP 24野生型複合体の蛍光発光スペクトルは、最大限に正規化されたクロロフィルBおよびXANTHEフィルからクロロフィルAへの効率的なエネルギー移動を示しています。遊離クロロフィルAの存在は、代わりに約675ナノメートルの追加発光につながります。

再構成されたCP 24錯体と天然のCP 24錯体の両方の475ナノメートルの引用における蛍光発光スペクトルは、再構成された錯体が正しく折り畳まれていることを示す681ナノメートルの単一のピークを示しています。再構成されたCP24とネイティブコンプレックスも非常によく似た円形のカリスマスペクトルを示しています。異なる顔料の配位に重要な単一アミノ酸残基は、個々の顔料の特性を分析したり、複合体の機能と安定性への寄与を評価したりするために変更することができます。

ここに示されているのは、野生型と変異したCP29の吸収スペクトルです。緑の線は2つのプロットの違いを示しています テートすると、SUSEグラジエントを含むこの手法は、適切に実行されれば24時間で超遠心分離を行うことができます。