効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）体外ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

この実験の全体的な目標は、自己反応性または不要なT細胞集団を枯渇させるための非細胞HLA IGベースのキラー人工抗原提示細胞、またはK-A-A-P-Cを生成することです。これは、まずHLA IG分子とAntifaモノクローナル抗体を細胞サイズの鉄デキストラン粒子に共有結合して機能的なK-A-A-P-Cを生成することによって達成されます。次に、K-A-A-P-Cに目的の異なるペプチドをロードして、不要な抗原特異的T細胞集団を標的とします。

最終的に、フロー細胞分析を実施して、ロードされた同族によるT細胞の抗原特異的抗脂肪媒介死を測定することができます。K-A-A-P-C.この手法のアイデアを思いついたのは、細胞ベースのキラー抗原提示細胞の開発に取り組む際に問題に直面したときで、同時にビートベースのプラットフォームの開発にも取り組んでいました。免疫細胞調節技術 K-A-A-P-Cを生成するには、まず、ストックから250マイクロリットルのエポキシビーズと250マイクロリットルの新たに調製したホウ酸緩衝液を滅菌スクリュートップガラスバイアルに加えます。

バイアルを磁石に置き、2分後にビーズが接着するようにし、バッファーを吸引してバイアルを磁石から取り出します。ビーズをボア8バッファーの別のミリリットルで一度洗浄し、その後、550マイクロリットルのHLA A 2 IGおよび抗ヒトCD 95 MABに再懸濁します。バイアルを静かに振ってビーズと抗体を混合し、その後、4°Cで回転子上でビーズを24時間インキュベートします。

翌日、ビーズを300G、室温で2分間スピンダウンし、バイアルを磁石に戻します。2分後、ローディングバッファーを吸引します。バイアルを磁石から取り出し、1ミリリットルの洗浄バッファーでビーズを慎重に振って洗浄します。

3回目の洗浄後、1ミリリットルの新鮮なビーズ洗浄バッファーでバイアルを回転させ、残留タンパク質結合部位をブロックします。翌日、ビーズを再度回転させ、バイアルを磁石に戻します。2分後、洗浄バッファーを吸引します。

バイアルを磁石から取り出し、KAPCに1ミリリットルのPBSを追加します。ビーズの品質を確認するには、K-A-A-P-Cの1.5倍を10の5倍にFAXチューブに移し、1ミリリットルのFAX洗浄バッファーResusで洗浄します。洗浄緩衝液の100マイクロリットルにビーズペレットを懸濁し、HLAを検出するために抗マウスIgG1つのPEの1マイクロリットルを追加し、抗ヒトCD 95 MABを検出するために抗マウスIG MFI TCの2つのIGと1マイクロリットルを追加します。

次に、摂氏4度で15分間インキュベートした後、ビーズを1ミリリットルのファックス洗浄バッファーResusで洗浄します。それらを250マイクロリットルの洗浄バッファーに懸濁し、ペプチドローディングのためにフローサイトメーターでサンプルを読み取ります。K-A-A-P-Cの7回目に10を2回移し、新しい滅菌ガラスバイアルに移します。

次に、ビーズを磁石に2分間置いた後、PBSを吸引し、5マイクログラムのペプチドを含む500マイクロリットルの新鮮なPBSにビーズを再懸濁します。バイアルに、ロードされたペプチドの日付と名前(K-A-A-P-C)をラベル付けします。次に、ロードしたK-A-A-P-Cを摂氏4度で少なくとも3日間保存して、HLA A two IGダイマーに十分なペプチドをロードしてA-K-A-A-P-Cをin vitroで殺すアッセイを実施できるようにします。

示されているように、K-A-A-P-Cをロードしたペプチドを少なくとも6回洗浄して、すべての遊離ペプチドを除去します。次に、K-A-A-P-Cおよび5番目の抗原特異的T細胞に10回を2回移し、摂氏37度および5%二酸化炭素の加湿インキュベーターで48時間培養した後、共培養培地の200マイクロリットル中の96ウェル丸底プレートのサンプルごとに1ウェルに1対1の比率で移します。サンプルを適切な対応するファックスチューブに移し、1ミリリットルのネキシン5結合バッファーで洗浄します。

次に、ペレットを100マイクロリットルのネキシン5結合緩衝液に再懸濁し、次いで、サンプルを1マイクロリットルのネキシン5FITCおよび5マイクロリットルの7 a a dに室温でインキュベートします。10〜15分後、サンプルを1ミリリットルのネキシンファイブ結合バッファーで洗浄し、ペレットを250マイクロリットルのニンファイブ結合バッファーに再懸濁します。その後、すぐにフローサイトメーターでサンプルを読み取ります。

K-A-A-P-Cは、HLA A、2 IG、およびAntifa MABを同時に表示し、細胞ベースのアプローチと比較して、コーディングや形質導入の有効性によって変化せず、製造中に簡単に調節できます。K-A-A-P-Cは、同族ペプチドをロードするとin vitroで抗原特異的T細胞を枯渇させることができますが、非同族ペプチドをロードすると、抗原特異的T細胞を枯渇させることができます。K-A-A-P-CはT細胞を枯渇させないため、K-A-A-P-Cは抗原特異的な方法でT細胞のアポトーシスを誘導します。

その後、異なるT細胞特異性の混合物のみから抗原特異的T細胞を選択的に枯渇させるためにK-A-A-P-Cを使用すると、隣接するT細胞への細胞毒性が最小限に抑えられます。したがって、K-A-A-P-Cは、自己免疫疾患および同種移植片拒絶反応の治療に潜在的な臨床的適用性を有するヒト活性化抗原特異的T細胞のin vitro抗原、抗原特異的枯渇のための絶妙なツールを表していますその開発後。この技術は、細胞免疫学の分野の研究者が、T細胞媒介性自己免疫疾患および移植拒絶反応の治療のための新しいアプローチを探求する道を開きました。