ネズミ弁内皮細胞の単離

この手順の全体的な目標は、内皮レポーターを使用して、胚および成体マウスから心臓弁、内皮細胞の濃縮集団を分離することです。これは、最初に、すべての僧帽弁、三尖弁、大動脈弁、および肺の心臓弁尖を含む心房心管領域の慎重な解剖によって達成されます。手順の2番目のステップは、一連の酵素処理により組織を治療することにより、弁組織を解離し、個々の細胞を放出することです。

このプロセスは9回繰り返されます。次に、細胞と破片を含む溶液をフィルターに通して、細胞破片のない単一細胞懸濁液を確保します。最後のステップは、蛍光活性化細胞ソーティングを使用して解離した細胞をソーティングし、収集することです。

最終的に、十分に多くの濃縮弁内皮細胞の集団がin vitro培養および分子分析に利用できるようになります。このアプローチでは、マウスから心臓弁内皮細胞を単離する方法を示します。生体分子ツールとして、マウスモデルで十分に確立されています。

これにより、心臓弁の研究に使用できる実験デザインの幅が広がります。さらに、胚中の心臓弁内皮細胞を単離することで、これまで実行不可能だった発生研究を行うことができます。さっそく始めましょう。

手術器具は、器具トレイ上でオートクレーブ滅菌して、必ず完全に滅菌してください。手術部位は、70%エタノールをスプレーして消毒する必要があります。これには、顕微鏡や、現場で接触する可能性のあるその他の機器が含まれます。

以下の溶液はすべて、実験の直前に調製する必要があります。解離バッファー、ソーティングバッファー、および培養する場合は、VEC培養、培地、GFPネガティブ培養培地。これらの溶液はそれぞれ0.2ミクロンのフィルターで滅菌する必要があり、その後、溶液は二酸化炭素の後で使用されるまで氷上に保持する必要があります。

マウスの窒息、続いて頸部脱臼。解剖ハサミを使用して胸腔を開きます。ここでのマウスは、タイツーGFPのホモ接合体であるか、またはファクトソーティングに必要な年齢一致のネガティブコントロールです。

次に、心臓と肺を露出させます。次に、大動脈で鉗子で心臓をつかみ、体から引き離します。心臓を部分的に沈めます。

皿の中の冷たいHBSSの皿で、付着した肺組織を取り除くことによって解剖のために心臓を準備し、サンプルを汚染する可能性のある非弁膜内皮細胞を排除することが重要です。最初に心房心管リングを取得するには、心房を心臓からそっと引き離して心房を取り除きます。次に、かみそりの刃を使用して心室を切り取り、AV弁の真下に切り込みを入れ、大動脈領域は無傷のままであるはずです。

次に、管の片側を切開してリングを開き、鉗子を使用して心房心室弁構造を露出させます。心筋をそっとからかい、弁尖を露出させます。それらは心筋の上にある緻密な白い組織です。

次に、cordi tendaiがまだ取り付けられている場合は、心房心室弁からゆっくりと取り外します。また、その過程で半月弁構造を含まない肺動脈と大動脈壁の近位領域を取り除きます。ECSが外れる可能性があるため、弁尖を損傷することなく、残りの心筋をできるだけ取り除きます。.

サンプルを汚染する可能性のある非弁膜内皮細胞を排除するには、慎重な解剖が重要です。したがって、4つのバルブすべてを無傷に保ちながら、周囲の組織をできるだけ多く取り除くようにしてください。最後に、トリミングした心臓弁領域を1.5ミリリットルのチューブに入れ、1ミリリットルの冷たいHBSSを入れ、チューブを氷の上に保ちます。

この技術を使用して、ピペットで成体またはE 14.5動物から分離された弁組織を調製します。組織と一緒にHBSSをチューブから取り出します。次に、1ミリリットルの解離バッファーと4マイクロリットルのDNASを1つ追加します。

解離バッファーとDNで組織を37°Cで7分間穏やかに回転させてインキュベートします。7分後、組織を3回上下にピペッティングして、細胞を解離させます。約15秒間沈降させた後、解離した細胞を含む上清を回収します。

細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。15ミリリットルの円錐形でコラゲナーゼ反応を終了し、馬の血清を添加します。これが最初のコレクション分数です。

次に、沈降した組織のチューブに戻り、解離バッファーとDNASバッファーを戻します。手順を繰り返して、2番目の分数を収集します。合計9つの細胞懸濁液が収集されるまで、このプロセスを繰り返し続けます。

次に、分画されたすべてのコレクションを70ミクロンのナイロンフィルターに通して1本のチューブに通し、細胞の破片のない懸濁液にします。チューブを400GSで5分間回転させることにより、細胞をペレットに集めます。次に、ペレットをミリリットルの選別緩衝液に再懸濁し、本文に記載されているファックスで分析できるようになるまで氷上に保ちます。

プロトコールの細胞培養と染色は、タイツーGFPトランスジェニックのテキストプロトコール組織切片でもカバーされています。マウスは成体から、E 14.5胚は成体から採取した。弁内皮細胞は、内皮マーカーCD31で同定され、GFPを共発現することがわかりました。

E 14.5胚から単離された同じ細胞。また、共発現CD31およびGFPファックス分析により、成体およびE 14.5胚から調製された細胞からGFP陽性および陰性の細胞集団が同定されました。野生型C57ブラックシックス。

成体細胞を用いてGFPパラメータを設定し、GFP陽性細胞集団およびGFP陰性細胞集団における遺伝子発現をGFP陽性細胞における定量的PCRにより比較した。内皮マーカーは高く、筋細胞マーカーは非常に低かった。GFP陰性細胞。

弁間質細胞マーカーは高かった。2つの細胞集団を2週間後に別々に培養しました。GFP陽性細胞は形態の周りで引き受けられ、CD31を発現しました。

対照的に、GFP陰性細胞は9日後に間葉系のような形態をとった。これらの細胞は、VICマーカーα SMAも発現しました その開発後。この技術は、心臓弁生物学の分野の研究者が、マウスモデルの発生と疾患のメカニズムを探求し、それをヒト集団に翻訳できる道を開きました。