Name: フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: 学ぶ マウスの頭部固定と自由移動を両立させた新しい神経科学手法。空輸式ホームケージを用いて、覚醒状態での2光子顕微鏡観察やパッチクランプ記録を可能にし、自然な行動下での脳機能研究を実現する。

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著者は、原稿の彼の貴重なコメントのために教授エーロカストレンに感謝します。作品は、フィンランドの国際的な流動、および神経科学のフィンランド大学院（脳と心博士後期課程）のためのフィンランドアカデミー、センターからの補助金によってサポートされています。

<ol><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li>
<li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903-912 (2001).</li>
<li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li>
<li>Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+evoked+activity+in+cortical+cells+imaged+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).</li>
<li>Fee, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+stabilization+of+electrodes+for+intracellular+recording+in+awake+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals.</a> Neuron. 27, 461-468 (2000).</li>
<li>Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).</li>
<li>Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80, 371-384 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li>
<li>Parry, T. J., McElligott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+restraining+awake+rats+using+head+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolog+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">A method for restraining awake rats using head immobilization.</a> Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).</li>
<li>Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisker+movements+evoked+by+stimulation+of+single+pyramidal+cells+in+rat+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex.</a> Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).</li>
<li>Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conventional+anesthesia+on+auditory+brainstem+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice.</a> Hearing research. 193, 75-82 (2004).</li>
<li>Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+is+the+major+target+of+sedative+concentrations+of+volatile+anaesthetics%3A+strong+depression+of+firing+rates+and+increase+of+GABAA+receptor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition.</a> The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).</li>
<li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li>
<li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li>
<li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li>
<li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li>
<li>Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+psychophysical+channels+of+whisker+deflection+in+rats+align+with+two+neuronal+classes+of+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents.</a> J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67, 1048-1061 (2010).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461, 941-946 (2009).</li>
<li>Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+vision+and+movement+combine+in+the+hippocampal+place+code%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How vision and movement combine in the hippocampal place code.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).</li>
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<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neocortical+Neurons+through+a+Chronic+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internally+mediated+developmental+desynchronization+of+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity.</a> The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).</li>
<li>Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensor.%2C+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

より良い脳生理学と病理学を理解するために、研究は各調製のための最も適切な技術を利用し、準備の複雑さの様々なレベルで実行する必要があります。目覚めと行動する動物実験は、かなりの方法論的な課題を代表しているが現時点では、神経科学の方法論の広い範囲（フルボディのfMRIからのサブオルガネラSTED顕微鏡に）容易に、麻酔動物に適用される。 ここでは、新たなアプローチが実験動物は、しっかりと頭に固定であるにもかかわらず、空輸モバイルホームケージの周りに移動することができますし、ストレスのない条件で、その具体的な環境を探検する場所に記載されている。ここで紹介するヘッド固定振る舞う動物の準備は非常に重要、多くの利点を提供します。まず、この方法で得られた電気生理学や撮影データは、麻酔によっても拘束誘起応力によってどちらも妥協である。モバイルホームにマウスの位置ケージは、迅速であり、さらには一過性に動物を麻酔は必要ありません。第二に、空輸ホームケージは細かい神経細胞の形態の変化を定量化すると、目を覚まし動物で単一細胞の電気生理学的活動を記録するために必要とされる機械的安定性を確保します。最後に、モバイルホームケージの設計は、球状のトレッドミルと比較して、よりコンパクトであり、従って、覚醒マウスの脳における二光子イメージング又はパッチクランプ記録のための標準的な正立顕微鏡下でモバイルホームケージを配置することができる。 モバイルホームケージで確固たる頭部固定は、基礎となる脳領域への光または電気的アクセスのための中心部にある円形の開口部に、特別に設計された4翼金属ホルダーの移植を必要とします。これらの金属ホルダは、接着剤、歯科用セメントおよび頭蓋骨にねじ込ま小さなボルトの組み合わせによって頭蓋骨に取り付けられている。この外科的処置は、以前は多数に基づいて開発された公開された手順を、安定かつ再現可能な頭蓋窓製剤をもたらすことが見出された。 in vivoでの電気生理学的実験で、月状の窓34、小型開頭（0.5mm未満）32、および掘削ガラス張りの準備35のために利用されている。ここで、「反転」頭蓋窓を大きく（直径3.5mm）、小さい（0.5mm未満の直径）開頭術のいずれかを移植した。脳の動きを最小限にすることは、電気生理学的実験のために、小さなサイズの開頭術を実行することをお勧めします理由である、安定した単一細胞記録のために重要である。光学イメージング実験のための頭蓋窓の移植時に、動物は、ウィンドウが最初に一過性透明性を失い、その後に応じて、50〜70％の収率で（それを回復する期間中に少なくとも2〜3週間、回復させマウス系統の遺伝的背景）。頭蓋窓とSTABILの透明性頭蓋骨に装着歯科用セメント「キャップ」のITYは、動物取扱中に一定双眼顕微鏡および物理的な検査によって確認することができます。 2〜3週間の回復期間の終了時に、歯科用セメントの残留後の運用炎症または機械的な欠陥の兆候を示し、これらの動物は、実験から除外して終了する必要があります。 マウスを訓練開始するための最適な年齢は2〜4ヶ月（20〜40 gで体重に相当）である。若い動物では、頭蓋骨に歯科用セメント「キャップ」のアンカーは、モバ​​イルホームケージに頭固定のマウスの移動によって課されている機械的ストレス、その回復力を低下させる可能性がある、信頼できない可能性がある。雄および雌マウスは、モバイルホームケージ内をナビゲートすることも同様喜んで現れるが、雌マウスにおいて透明性を回復頭蓋窓（データは示していない）のより良好な比率を達成する傾向がある。したがって、T順番でO約30％以上の雄マウスに頭蓋窓を注入する、イメージングのために選択された動物のコホートにおける性別をバランスよく配合を確保することをお勧めします。社会的相互作用は、従ってそれは同腹子が操作訓練を受けた群と並列に収納用のケージに一緒に保持されることをお勧めし、動物の福利を改善し、ストレスを軽減することが知られている。 球状のトレッドミルの準備のために13公開された方法とは対照的に、モバイルホームケージを利用する方法は、ヘッド固定の時点でマウスを麻酔は必要ありません。それも簡単にし、 &quot;光&quot;麻酔のエピソードがまもなく後に得られた生理学的測定に基づいている可能性が高いことを任意の残留効果を除外することができますので、この違いは重要です。実際、研究で頭部固定は麻酔下で行われていた場所にもかかわらず、実際の実験は1ができない、短時間の待機期間13の後に開始されました実験データに簡単な麻酔エ​​ピソードの可能性長期的な影響を除外します。他の研究では、36不動のままに動物をやる気にさせるための手段として固定し、使用する水の報酬を頭に動物の体系的な慣れのために水の欠乏に頼ってきた。しかし、報酬ベースのヘッド固定方法は、適用可能な行動試験の選択肢を制限し、、重要なのは、十分に確立された刺激 - 報酬関連の1を占めている。これとは対照的に、モバイルホームケージに固定を頭にマウス馴化の方法は、水の欠乏とその後の報酬を必要としません。 水供給システムを有するモバイルホームケージを補完する長期的な実験のために推奨されます。ここで紹介するペットのためのトレーニングセッションや実験は、標準的な12時間の明スケジュール（LI下に保持されたマウスのための生理的に受動的な期間に相当する、（午前8時から午後6時までの間）、昼間に行われた午後6時午前6時とオフにGHTS）。水の摂取を直接マウスの活動と関連しているので、トレーニング/撮像/記録セッションの持続時間は2時間を超えない場合、パッシブマウス期間中に水供給を必要としない。トレーニングセッションのタイミング及び継続時間に加えて、1つは、モバイルホームケージに動物をhabituatingために必要なセッションの最適数の問題に対処する必要がある。 i）の重量損失、およびii）自発運動レベル：この目的のために、2つの基準は、頭部固定手順によって誘起される応力を評価した。 図6に示すように、重量損失は、トレーニング2日目に6％の平均レベルに達し、完全に訓練4日目（ 図6A）によって反転される。一貫して重さのダイナミクスと、頭固定の動物の自発運動レベルは、訓練の初日に抑制されているが、訓練4日目（ 図6D）によって安定化させる。これらの測定値に基づいて、我々はsuggesここプロトコルで説明したように、モバイルホームケージ上のマウスの訓練期間の最小限の期間は、4日間でトン。 空輸、フラットの床のモバイルホームケージの使用は、ヘッドを固定したマウスのためのトレーニングパラダイムに複雑なタスク（感覚、知覚、認知）を追加することができます。本研究では行動試験の2のプロトコルが提示されています。両方のプロトコルは、臭気の手がかりを利用して、マウスの大脳皮質における縦イメージング/レコーディングと組み合わせることができます。モバイルホームケージが非吸収性材料から製造されていますが、1はまだ考慮にデバイスとテスト臭（S）の香りの間で可能な干渉を取る必要があります。行動実験の視覚的/触覚的合図を妨害するもう一つの要因は、シームレスではない、したがって、ランドマークなどの動物によって知覚され得る壁とインサートとの間の接合である。ここは注目に値する、そのような統合の際に、動物の苦痛を最小にするためにモバイルホームケージ壁への臭気提示綿の配置などrventionsは、実験者は、可能な限り迅速な介入を行い、炭素ケージの長時間の処理を避けるために練習してください。小説臭い/オブジェクトのプレゼンテーションのための代替戦略が考えられる、 例えば動物の頭の位置に対応して高さの炭素ケージ壁の内側表面に付着し、小さな棚の上に、ハイドロゲルベースのソリューションを配置すると、ドロップしたり（例えば、食品チップなど）のオブジェクト。 本研究で示されているように、モバイルホームケージは、水平移動、situp、舐めて、泡立てる、グルーミング、鼻突く、熟練した前足の動き、および壁は前肢に触れるなど、2次元の動きの広い範囲を実行するために頭部を固定した動物を可能にする。モバイルホームケージやここで紹介するプロトコルを使用して、研究者は、刺激条件の両方を制御性の高い感覚ニューロン系を研究することができますSと行動の読み取りアウト。さらに、覚醒マウスでの認知能力の研究はエアコン、空間ナビゲーションと意思決定の作業中に実行することができます。 この方法のいくつかの実際的な制限があります。まず、加圧された空気のかなりの量がホームケージリフティング力を達成し、長期的な実験を行うために必要とされる。第二に、その現在の実装では、モバイルホームケージは直径わずか18センチ、したがって、複雑な実験環境が空間的制約を受けることなく設計することができる仮想現実に比べて比較的小型でシンプルな空間を提供する。第三には、ここで紹介するウィスカの刺激と報酬ベースの実験の間、デバイスはマウス用の可能性の壁接触を制限する使用された。 （このような目を向けられた光プロジェクターなど）外部の視覚や感覚刺激チャネルの追加は、と比較して、より人間工学的でコンパクトな装置の設計が必要となる球状​​のトレッドミルの実験で使用されてきた複数画面又はドーム投影溶液。 要約すると、空輸モバイルホームケージに移動するヘッド固定マウスの使用が大幅に単一の実験中の観察と操作の、携帯分子および行動のレベルを組み合わせた研究を容易にします。ここに示された特定のアプリケーションでは、非麻酔下の振舞いをマウスで2光子顕微鏡イメージング、内因性光信号イメージングとパッチクランプ記録が含まれています。なお、この方法は目を覚まし、挙動マウスの実験で新しい展望を開き、薬剤開発および脳機能の基礎研究の両方のための有用なツールとして役立つことが期待される。

神経科学での刺激的な最近の傾向は、目を覚まし、行動するげっ歯類の脳内の神経回路網のプロービング分子·細胞のための実験的なアプローチを開発することである。このようなアプローチは、運動機能、感覚統合、知覚、学習、記憶だけでなく、傷害の進行、神経変性および遺伝性疾患の根底にある神経生理学的プロセスに新たな光を当てることを約束したままにします。さらに、目を覚まし、動物の脳から記録することは、新たな治療薬や治療法の開発に可能性を秘めています。 一般的に、神経生理学的実験に使用されている麻酔は、潜在的に実験結果の誤った解釈をもたらす、脳機能の基本的なメカニズムに影響を与えることができることを意識の高まりがある。このように、広く使われている麻酔薬ケタミンは急速に新たな樹状突起棘の形成を増加させ、シナプス機能1を強化する。他の一般的に使用されるanesthet外科麻酔レベルでのICイソフルランは完全に新生ラットとブロック内の自発的な皮質活動成体動物2スピンドルバースト振動を抑制します。現在では、アプローチの限られた数の二光子顕微鏡イメージング又はパッチクランプ記録により、非麻酔したマウスでの実験を可能にする。これらのアプローチは、自由に移動し、頭部固定製剤に分けることができる。 自由に動く動物の調製のユニークな魅力は、それが、ナビゲーション中に全身の動きを含む自然現象の評価を可能にすることである。自由に移動し、げっ歯類の脳内の画像への一つの方法は、小型化されたヘッドマウント顕微鏡やファイバースコープ3-5を添付することです。しかし、小型化された装置は、対物系二光子顕微鏡法に比べて制限された光学性能を有する傾向があり、容易に全細胞パッチクランプ記録6と組み合わせることはできません。 EXIヘッド固定目覚め齧歯類用スティング·ソリューションは、物理的な拘束7,8または自主ヘッドレスト9を示すことが動物を訓練のいずれか主に依存してきた。他の一般的なアプローチは、 例えば 、動物の手足はそれを置くことで移動できるように球形トレッドミル10です。このアプローチは、多くの場合、コンピュータで生成された仮想現実と組み合わされる。ヘッド固定したマウスでの電気生理学的実験は、主に細胞外記録を使用していたし、心血管機能11の中央制御、ニューロンの活動12に対する麻酔の影響、脳幹13情報処理14における聴覚反応を研究するために使用された。目を覚まし振舞いを動物で先駆的な細胞内/細胞全体の記録が2000年代に実施し、知覚と運動、15〜20に関連した神経活動に焦点を当てている。同じ頃、目を覚ましたマウスの最初の顕微鏡イメージング研究がPUBた2光子顕微鏡を物理的に抑制したラット7の感覚皮質に球状トレッドミル21上で動作しているマウスで使用されたlished、。 その後のインビボ顕微鏡および電気生理学の研究は、頭部固定の準備が正常に前肢の動き、臭気認識、泡立て、そして8,22-25をなめるに基づいて、行動パラダイムと組み合わせることができることを実証した。球状トレッドミル上に置かれたマウスは、コンピュータ10,26によって生成された仮想的な視聴環境をナビゲートするために訓練することができる。細胞内/細胞外記録は、このような仮想環境をナビゲートする頭部固定動物において、海馬場所細胞の活性化が27を検出することができる、ことを証明した。仮想視覚的な環境では、マウスがアクティブな動き27時の局所電場電位とシータ相歳差で通常の移動に関連したシータリズムを示しています。最近では、空間的および時間的activit神経細胞集団のYパターンは、仮想環境28のメモリの決定作業 ​​を作業中にマウスでは、光学的に記録された。 画期的な研究を可能にしたにもかかわらず、球状のトレッドミルのデザインは、いくつかの固有の制限があります。まず、動物は、壁やバリアなど全く有形の障害にならない回転空輸ボール、無制限の表面に移動させるために必要とされている。視覚入力がこれらの種が自然に依存している触覚感覚入力（ 例えば 、ウィスカータッチまたはなめる）と比較して、マウスおよびラットに、おそらくあまり効果的であるため、この制限は、コンピュータで生成された「仮想現実」によって補償部分であるだけで上。第二に、ボール表面のかなりの曲率をケージ内の平らな床の上を歩いてするために使用する実験用マウスのために不快なことがあります。最後に、ボールの膨大な直径（マウスおよびラットのための300ミリメートルのための少なくとも200ミリメートル）は、球状の垂直方向のサイズをレンダリング比較的大きなトレッドミル装置。これは、それが困難な市販の顕微鏡のセットアップの大部分球形トレッドミルを組み合わせることになり、多くの場合、カスタムメイドの顕微鏡のフレームを用いてトレッドミルの周りの新しいセットアップを構築する必要があります。 ヘッド固定マウスは平らな床有形壁が特徴空輸モバイルホームケージの周りを移動し、ストレスのない条件下での物理的な環境を探索することができのはここ、新規な方法が記載されている。この記事では、マウスのトレーニングと頭部固定の手順を示していて、2光子顕微鏡、固有の光学イメージングとパッチクランプ記録が目を覚まし振舞いをマウスの脳内で行われている代表的な例を提供しています。

<table><tbody><tr><td>ピンセット、ステンレス鋼、115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>アニマルトリマー、シェービングマシン</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>双眼顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>生体温度コントローラー、ステンレス製加熱パッド付き</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>鈍い顕微鏡手術用ブレード</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td>374769</tr>フィ<tr><td>ラメント付きホウケイ酸チューブ</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>パッチピペット製造用</td></tr><tr><td>カメラ&nbsp;</td><td>Foscam</td><td>FI8903W</td><td>夜間の視認性</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>ファイザー</td><td>Rimadyl 獣医</td><td></td></tr><tr><td>歯科用セメント</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon 獣医</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てドリル</td><td>マイジンガー</td><td>HP 310104001001008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco's PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子、110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>目潤滑剤</td><td>ノバルティス</td><td>ビスコティアーズ</td><td>手術中の目の保護や浸漬のためのビスコース溶液として&nbsp;</td></tr><tr><td>Foredomドリルコントロール</td><td>Foredom&nbsp;</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>フォアドム マイクロモーターハンドピース</td><td>フォアドム</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>四翼メタルホルダー</td> ネロ<td>ターヘッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルダー マウス用</td><td>成重</td><td>SG-4N</td><td>脳定位固定装置に組み付け</td></tr><tr><td>止血 コラーゲンスポンジ</td><td>アビテン、ウルトラフォーム BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>イマリス</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>インターベット</td><td>ケタミノール獣医</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil&nbsp;</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイタイ ディープシーレーザー</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロドレッシング鉗子 105mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>微小電極プーラー</td><td>成重</td><td>PC-10H</td><td>ガラスピペット製造用縦型プーラー</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Sensapex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミニボルト</td><td>セントロスタイル</td><td>Ref. 00343 s/steelM1.0x4.5</td><td></td></tr><tr><td>モバイルホームケージ</td><td>神経腫瘍</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多光子レーザー走査顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>不織布綿棒、5 x 5</td><td>Molnlyckeヘルスケア</td><td>Mesoft</td><td>外科タンポン</td></tr><tr><td>ポリアクリル接着剤</td><td>ヘンケル</td><td>ロックタイト401</td><td></td></tr><tr><td>丸いガラスカバースリップ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td></td><td>1.5厚さ</td></tr><tr><td>小動物 定位固定装置</td><td>用 David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Student 虹彩はさみ、ストレート 11.5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

これは、広く一般的な麻酔薬の使用は、生きている動物の脳から得た電気生理学的または顕微鏡データの関連性を弱体化させることができることを認めている。また、麻酔からの長い回復が長期的研究での繰り返し記録/イメージング·エピソードの頻度を制限します。したがって、非麻酔下の振舞いをマウスから、安定した録画を​​可能にする新たな方法は、細胞と認知神経科学の分野を進めることが期待される。既存のソリューションは、単なる物理的な拘束からこのようなコンピュータによって生成された仮想現実と組み合わせて使用​​される線形および球形のトレッドミルのような、より洗練されたアプローチの範囲です。ヘッド固定マウスは空輸モバイルホームケージの周りを移動し、ストレスのない条件の下でその環境を探索することができますのはここ、新規な方法が記載されている。この方法では、研究者が同時に行動試験（ 例えば 、学習、慣れや新規物体認識）を実行することができます二光子顕微鏡イメージングおよび/またはパッチクランプ記録を、すべて単一の実験で組み合わせる。この映像資料は、覚醒動物の頭部固定装置（モバイルホームケージ）の使用を記載し、動物の馴化の手順を示していて、方法の可能なアプリケーションの数を例示している。

ここで紹介する方法は、顕微鏡イメージングや目を覚まし、頭を固定、それ以外は自由に移動し、行動するマウスでの単一セルの電気生理学的記録を対象としています。動物の頭蓋骨がヘッド固定アームにしっかりと固定されている動物は、現実に（仮想ではなく）、有形慣れた環境での二次元で移動することができる。空輸モバイルホームケージにマウスをHabituatingことは毎日二度2-HRのトレーニングセッションの4-6日間（ 図1）で構成されています。訓練された動物は、次いで、直ちに実験に使用することができる。代表的な研究では、数時間から数日または数週間の間隔で配置されている画像化セッションまたはパッチクランプ記録セッションの数が含まれています。重要なことに、光学的および電気生理学的記録の両方は、単一の実験内で、認知または行動刺激および読み出しと同時に行うことができる。 の機械的安定性を評価するためにモバイルホームケージ内でマウスの頭部固定実験動物は、モバイルホームケージ（ 図2）をナビゲートしながら、蛍光共役デキストランおよびYFPを発現する皮質樹状突起の標識された皮質の血管の画像シーケンスを収集した。動物の歩行運動中の脳の最大変位は、通常、1〜1.5マイクロメートルを超えなかった。これらの変位は、水平方向に発生せず、非常にまれにモーションアーチファクトの不必要な任意の修正をレンダリングする、撮像面の検出可能な変化をもたらした。モバイルホームケージでの安定したヘッド固定は、麻酔したマウスと同じ信頼性で目を覚まし、動物の個々の樹状突起棘の定量化を可能にする。樹状突起棘密度、形態および代謝回転は、数時間から数日または数週間の範囲の間隔で実行される複数の撮像セッションでの縦断的研究の間監視することができる。 Mの使いやすさTHY1-GCaMP3トランスジェニックマウスおよび野生型マウスにおけるii）の固有の光信号に結像i）の二光子顕微鏡法：機能性光学イメージングのためobileのホームケージは、2つのアプローチを用いて覚醒マウスの体性感覚皮質において試験した。のCa 2 +イメージングは、細胞の多くの蛍光標識されたニューロンの体、ならびにそれらの樹状突起と軸索（ 図3）を含むレイヤ2/3、で行った。インタレスト（関心領域）の選択された領域からの蛍光オーバータイムのプロットは、モバイルホームケージ内のマウスの積極的なナビゲーション中（GCaMP3蛍光の一過性の増加として測定される）自発的な神経活動を示す、 図3に示します。本来の信号に基づいて光学的画像は、機能ドメインの空間分布をマッピングすることができます。 図4は、Vに対応して体性感覚野に沿って伝播（地域ニューロンの活性化を反映した）血液酸素レベルの波のような変化を示している0.05ヘルツの周波数でibrissa刺激。 モバイルホームケージとパッチクランプ記録の実現可能性をテストするために、我々は2〜3ヶ月齢のC57BL/6Jマウスを使用していました。体性感覚皮質の層2/3ニューロンは電流クランプ·モードを使用して全細胞構成でから記録した。目を覚ましたマウスの脳内でのパッチクランプ記録は、ヘッド固定モバイルホームケージには、脳スライスパッチクランプブラインドと本質的に類似していた。試みの約50％が70％以上で安定した全細胞構成記録を得、そのうちの成功ギガシールの形成をもたらした。により細胞の機械的変位にギガシールの接触を失うことのない事象は認められなかった。 図5は、代表的な10分の長い電流クランプがマウスのアクティブな（実行中）のエピソードとパッシブ（休息）状態と相関して記録する60秒のフラグメントを示しています。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src='"/' files> 図1。モバイルホームケージにおける覚醒したマウスの頭部固定方法。 A）空輸モバイルホームケージの設計と典型的な実験のタイムラインの一般的な概念。B）図のイラストの概要。研究では、2週間前の取り扱いと8毎日二度のトレーニングセッションに続いて、ラッピング、マウスをhabituatingに頭蓋窓の移植で始まる。代表的な研究では、数時間から数日または数週間の間隔で配置されている画像化セッションまたはパッチクランプ記録セッションの数が含まれています。両方の光学的および電気生理学的測定は、単一の実験内の認知や行動の刺激と読み出しと並行して行うことができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 図2。モバイルホームケージの周りを移動起きてマウスでの2光子顕微鏡イメージングの例。 70kDaのテキサスレッド結合デキストランで標識した、B）皮質血管系、。個々の血管セグメントの直径は、経時的に、マウスの休止と稼働（A）の期間中に血管内腔を横切って描かれた線のプロファイルをプロットすることにより測定される。動脈および静脈の血流の速度、血管壁（B）に平行に引かれた線に沿って線走査によって測定される。の亜集団においてYFPを発現するトランスジェニックマウスの脳において視覚化ニューロン形態のC、D）ファイン詳細THY1プロモーター下ニューロン。マウスの体性感覚野（C）における錐体ニューロンの三次元再構成。樹状Bの画像目を覚まし、行動するマウスで取得された牧場では、個々の樹状突起棘の形態（D）の定量化のために十分に安定している。マウスの動きによって引き起こされる脳の運動のE）の定量化。大きな振幅の変位は、マウスのランニングの期間と相関している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600"> 図3。モバイルホームケージの周りを移動覚ましTHY1-GCaMP3マウスにおけるニューロン集団活動の例。皮質層のA）の二光子画像Ⅱ/Ⅲ神経細胞。 ROIを、例えば、神経細胞体、樹状突起と軸索が黄色で表示されます。（時間Sに示す関心領域からGCaMP3蛍光のB）ΔF/ Fトレースeries）は1.5秒/コマで記録された。C）ズームインされた領域65ミリ秒/フレームで画像化した。D）C言語で黄色のROIからの蛍光を経時的にプロットし、アクションに対応GCaMP3蛍光の一過性の増加（赤）を示している潜在的に誘導されるのCa 2 +流入のエピソード。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600"> 図4固有の光学信号をイメージングによる覚醒マウスの皮質における機能的応答の空間分布をマッピングする例。モバイルホにおけるベースライン活性の頭蓋窓を介して表面的な血管のA）明視野図である。B）マグニチュード·マップ0.05ヘルツの周波数で感覚毛の刺激に反応して体性感覚野に沿って伝搬する神経活動の6分間のエピソード。C）マグニチュードマップ中にmecage。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600"> 図5。モバイルホームケージの周りを移動起きてマウスの皮質の全細胞パッチクランプ記録の例。マウス皮質層2/3のニューロンからA）の電流クランプ記録。 （トレースの下に示されている）0.5秒、100-PA電流注入は、活動電位のバーストになる。細胞は錐体細胞のためのスパイク頻度順応特性を示した。B）連続電流クランプ記録を（トレース上のピンク色で示されている）マウスの '自発運動と相関し、同じニューロンから。マウスの（C）を休止および（D）を実行している期間中のレイヤ2/3のニューロンの代表的な自発活動は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600"> モバイルホームケージでのトレーニングセッションの間に図6。動物の体重減少とhead-fixed/non-fixedマウスの自発運動。トレーニングセッションの前にA）動物の体重（+ SD、％を意味する）。その体重減少が完全に7-8 回目のトレーニングセッション、モバイルホームケージにマウスの水平移動の相対的な。B）弾道で逆転される注意、ヘッド固定（円）のどのトレーニングセッション、第 8の間、モバイルホームケージの追跡動きから外挿した。C）トレーニングセッション、第 8の間に丸いケージを模索非ヘッド固定マウスの動きを追跡した。D）持続し、訓練の1-4日目の間に固定されていない（三角）マウスの動き（+ SD、％を意味する）。 4日目に、ヘッドを固定したマウスは、いずれも（1日目として）凍結や過度の運動活性を示すことに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

こんにちは、ヘルシンキ大学ニアサイエンスセンターの大学院生、ヘル・リンです。今日は、同僚と私が、覚醒状態での光学的および電気生理学的記録の実行方法を紹介しますが、それ以外は自由に動き、動物を行動させます。私たちの方法は、マウスがナビゲートして探索するための具体的で身近な環境を作り出します。顕微鏡イメージングやシングルセル電気生理学的記録では、動物の頭部をしっかりと固定する必要があるため、慢性的な頭蓋窓を埋め込み、マウスを空輸された移動式ホームケージに慣れさせ、動物の足元を滑るようにします。平らな面での移動中、モバイルホームケージは、2光子イメージングのために標準的な直立顕微鏡の下に配置したり、ウェイクマウスの脳内でパッチクランプ記録用に設定された電気生理学に配置したりすることができます。ここで紹介するすべての実験手順は、地元の倫理委員会によって承認されています。私たちは、公開されたプロトコルに従って頭蓋窓を移植し、頭蓋窓の埋め込み時にわずかな変更を加えます。動物は、この回復期間中に少なくとも2〜3週間回復することが許され、ウィンドウは通常、その透明性を取り戻します。術後炎症が残っている動物は、実験から除外されます。.研究のために選択された動物を訓練して、頭の固定に慣れさせます。モバイルホームケージでは、マウスを5〜10分間落ち着いて扱い、急な動きや音を避けてから、マウスをホームケージに戻します。この手順を不等間隔で2〜3回繰り返します。トレーラーハウスケージは、頭部固定前に動物に麻酔をかけずに頭部固定を可能にします。雑巾を使用して、マウスを不均等な間隔で2〜3回包みます。動物が包まれている間、落ち着いていることを確認してください。それ以外の場合は、マウスが完全に慣れるまで手順を繰り返します。取り扱いが完了した後、翌日にモバイルホームケージでのマウスの1日2回のトレーニングを開始します。各トレーニングセッションの前に動物の体重を量ります。10%を超える体重減少を示す動物は、研究から除外されるべきです。.頭の固定アームの位置を、訓練した動物のサイズに合わせて調整します。モバイルホームケージデバイスの吸気口を標準の実験室の加圧空気出口に接続します。空気圧が、空輸されたホームケージの自由浮揚に十分であることを確認してください。トレーラーハウスケージで慣れ親しんだ動物の訓練を始めます。マウスを雑巾で包んで固定します。動物の頭部に取り付けられている金属製のホルダーを頭部固定アームに挿入し、ネジを締めてしっかりと固定します。エアフローをオンにして、空輸されたホームケージを浮上させます。雑巾を取り外し、マウスがホームケージを探索できるようにします。最初のトレーニングセッション中に、マウスは凍結および震えの行動および尾の勃起を示すことがあります。動物を騒音に慣れさせるために、すべてのトレーニングセッション中および実験中に、たとえばラジオの翻訳や録音された音楽やスピーチを使用して、周囲の音に常にさらされるようにします。慢性的なストレスを避けるため、トレーニングセッションの最初の1時間は明るい照明を使用してください。最初の1時間後、暗闇の中でトレーニングを行い、近赤外線カメラを使用して動物の行動を監視します。トレーニングセッションが完了したら、ネジをなくして動物を頭部固定アームから解放します。次のトレーニングセッションの前に、少なくとも2時間動物を自宅のケージに戻します。マウスを他の2匹以上のマウスと一緒にケージに入れておくと、ストレスレベルが下がります。オプションで、空輸されたケージを動物と一緒にホームケージに置くことができます。これにより、環境が豊かになり、モバイルホームケージへの動物の居住が強化される可能性があります。最後のトレーニングセッションでは、マウスは頭部固定に慣れており、空輸されたホームケージの周りを落ち着いて移動するストレスレスな行動を示すはずです。可視光がない場合、マウスの移動の軌跡は、近赤外線カメラまたは光学コンピューターマウスでケージの動きを監視することによって追跡できます。1時間または2時間以上続く長時間のトレーニングセッションでは、手動で、またはモバイルホームケージフレームに取り付けられたピペットホルダーを使用して、マウスに飲料水を提供することを検討してください。次の図は、一般的な実験研究のタイムラインをまとめたものです。この研究は、マウスの取り扱いの2週間前に頭蓋窓を埋め込むことから始まり、1日2回のトレーニングセッションを8回行います。典型的な研究には、数時間から数日または数週間の間隔で間隔を空けた多数のイメージングセッションまたはパッチクランプ記録セッションが含まれます。光学実験と電気生理学的実験はどちらも、認知的または行動的な刺激と読み出しと並行して行うことができます。2光子顕微鏡は、げっ歯類の脳の深部皮質層における細胞構造、さらには細胞内構造をリアルタイムで可視化できる独自の非線形光学技術です。2光子顕微鏡イメージング実験を行うには、訓練を受けた動物をモバイルホームケージに入れ、ストッパーを調整して顕微鏡光学系を偶発的な損傷から保護します。頭蓋窓のカバーガラスを清掃して、ほこりの粒子を取り除きます。カバーガラスに液浸液を滴下します。水分が急速に蒸発するため、粘性溶液の使用をお勧めします。このプラットフォームは、蛍光顕微鏡の広視野モードとロングパス発光フィルターを使用して、一般的な電動光学テーブルの上に配置できます。脳の血管系を評価し、関心のある領域を選択します。頭に固定され、固定された動物の尾静脈に注入される皮質血管系を画像化するために、70キロのダルトン、テキサス州の赤い抱合テキストトラン。この画像シーケンスは、モバイルホームケージの周りを移動しながら、行動するマウスの皮質内の会場と動脈のタイムラプス記録を示しています。血管内腔を横切って引かれた線のプロファイルをプロットすることにより、血管の直径の変化と個々の血管セグメントの運動性を測定できます。動脈や静脈の血流速度は、血管壁に平行に引かれた線に沿ってラインスキャンすることで測定できます。いい。ニューロンの形態の詳細は、台湾プロモーター下のニューロンの亜集団でYFPを発現するトランスジェニックマウスで視覚化できます。これらの2つのZacksは、麻酔をかけた動物と覚醒した動物との間のイメージングの安定性を比較します。右側のパネルは、ケタミンキシラジン混合物で麻酔をかけた動物の樹状突起を示しています。左側のパネルには、覚醒した動物の樹状突起の画像が表示され、トレーラーハウスのケージの周りを歩いています。覚醒状態の動物の個々の脊椎の形態は、麻酔をかけたマウスと同じ信頼性と精度で解析することができます。動物が走っているときの脳の変位は、通常、1〜1.5マイクロメートルを超えません。これらの動きは水平方向に発生し、結像面がずれることはめったになく、モーションアーチファクトの補正が不要になります。ほとんどの場合、覚醒している生きた脳の神経活動を慢性的に監視する能力は、神経系の組織と機能を理解するために不可欠です。タイ1 G Camp 3トランスジェニックマウスを用いて、モバイルホームケージ内で行動する覚醒マウスの自発的な神経活動をイメージングします。このタイムラプス画像シーケンスは、ニューロン細胞体、ナイト、軸索におけるカルシウムスパイクの代表的な例を示しています。内因性信号に基づく光学イメージングにより、機能ドメインの空間分布をマッピングして、内因性光学イメージング実験を行うことができます。訓練された動物を、カメラ対物レンズの下にあるホームケージに入れます。カバーガラスをほこりから取り除きます。グリセロールを一滴入れ、5ミリメートルの丸いカバースリップで覆います。ハイスピードカメラの位置を調整します。対側バイブレーションの反対側にエアブローチューブを備えたマニピュレーターを配置します。緑色のライトを使用して、船舶の地図をイメージします。皮質血管の約400マイクロメートル下にある皮質の奥深くに焦点を合わせます。カメラの前にバンドパスフィルターを置き、赤いライトで皮質を照らします。マウスがプラットフォームに少なくとも30分間適応するのを待ちます。6 分間のエピソードでベースライン アクティビティを記録します。合計6分間、エアパフで10秒ごとにバイブレーションを刺激します。この画像は、0.05ヘルツの周波数でビブラ刺激に応答して体性感覚皮質に沿って伝播する神経活動を示しています。シングルセルの電気生理学的記録を行うには、逆頭蓋窓を埋め込んだ訓練済みの動物をモバイルホームケージに入れます。ゆっくりと慎重に、金属ホルダーからカバーガラスを取り外します。皮質バッファーをリフレッシュし、止血タンポンで頭蓋窓を破片からきれいにします。接地電極を皮質バッファーに配置します。パッチクランプピペットに細胞内溶液を充填します。電動マイクロマニピュレータを使用して記録ピペットに正圧を加え、ピペットを皮質に深くして、目的の細胞とのギガシール接触を得る。記録後、ピペットを取り外し、皮質バッファーをリフレッシュし、カバーガラスを金属ホルダーに接着して頭蓋窓を閉じます。空輸されたホームケージを使用すると、イメージングと電気生理学を、学習、リハビリテーション、不安関連行動などの古典的な行動パラダイムと組み合わせることができます。嗅覚はマウスにとって重要な感覚入力であり、記憶テストでの刺激や新規性に対する反応の評価に使用できます。慣れ嗅覚試験を行うには、訓練を受けた動物をトレーラーハウスケージに入れ、養子縁組を許可します。水道水に浸した清潔な綿をトレーラーハウスケージの内壁に両面粘着テープで30分間貼り付けます。5分後、ホームケージの壁に貼られている清潔な綿を、バニラの香りがする液体に浸した新しい綿と交換します。バニラの香りへの5分間の曝露を、セッションの間に5分間隔で3回繰り返します。匂いへの関心のレベルを測定するため。動物がターゲットゾーンに面して過ごした累積時間と、モバイルホームケージの移動の合計時間を数えます。最後の5回目のセッションでは、社会的に重要な匂いを嗅ぎます。新しい綿のアプリケーターを、異性のマウスからの尿を数滴濡らします。新規性に対する反応を評価するには、モバイルホームケージを4つのゾーンに分割します。2枚の綿片を向かい合わせに取り付けます。色。最初の試行中に、ホームケージの壁の外側にマーカーでそれらをコーディングします。きれいな綿を2枚置きます。次に、両方をバニラの1%抽出物に浸した綿と交換します。3回目の試行では、バニラコットンをゾーン番号1に入れ、1%バナナ抽出物に浸した綿をゾーンに入れます。その2、匂いがしないことへの嗜好を測定することです。動物が無臭に直面するのに費やす時間を、他のゾーンに直面する累積時間の割合として計算します。こんにちは、ヘルシンキ大学神経科学センターの主任研究員であるレオ・キロです。このビデオを楽しんでいただき、お役に立てたでしょうか。私たちは過去5年間、in vivoでの顕微鏡検査に2つの側面から取り組んできましたが、美学が脳機能、血流、その他すべてに干渉するため、一般的な審美的な使用は常に大きな懸念事項でした。そして今日、覚醒した動物で作業を行い、安定した顕微鏡イメージング実験を行い、以前に麻酔をかけた動物で得られた結果を検証および検証できることを嬉しく思います。モバイルホームケージの使用と本日発表した方法は、in vivo研究全般の関連性を高め、新しく画期的な結果につながると確信しており、楽しみにしています。

flat-floored-air-lifted-platform-new-method-for-combining-behavior

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

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皮質局所電界電位、心電図、筋電図、呼吸リズム自由行動ラットからの同時録音

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私たちは、2つの登山繊維依存連想学習タスク中の動物の行動を追跡するための単一のプラットフォームを開発しました。低コストの設計により、繊維関連小脳活動の登山に向けられた光遺伝学的またはイメージング実験との統合が可能になります。...

小脳依存感覚連想学習を監視するための柔軟なプラットフォーム

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覚醒した頭部固定ラットのニューロイメージングのための頭部インプラント

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自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録

学ぶ マウスの頭部固定と自由移動を両立させた新しい神経科学手法。空輸式ホームケージを用いて、覚醒状態での2光子顕微鏡観察やパッチクランプ記録を可能にし、自然な行動下での脳機能研究を実現する。

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

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