フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

こんにちは、ヘルシンキ大学ニアサイエンスセンターの大学院生、ヘル・リンです。今日は、同僚と私が、覚醒状態での光学的および電気生理学的記録の実行方法を紹介しますが、それ以外は自由に動き、動物を行動させます。私たちの方法は、マウスがナビゲートして探索するための具体的で身近な環境を作り出します。

顕微鏡イメージングやシングルセル電気生理学的記録では、動物の頭部をしっかりと固定する必要があるため、慢性的な頭蓋窓を埋め込み、マウスを空輸された移動式ホームケージに慣れさせ、動物の足元を滑るようにします。平らな面での移動中、モバイルホームケージは、2光子イメージングのために標準的な直立顕微鏡の下に配置したり、ウェイクマウスの脳内でパッチクランプ記録用に設定された電気生理学に配置したりすることができます。ここで紹介するすべての実験手順は、地元の倫理委員会によって承認されています。

私たちは、公開されたプロトコルに従って頭蓋窓を移植し、頭蓋窓の埋め込み時にわずかな変更を加えます。動物は、この回復期間中に少なくとも2〜3週間回復することが許され、ウィンドウは通常、その透明性を取り戻します。術後炎症が残っている動物は、実験から除外されます。.

研究のために選択された動物を訓練して、頭の固定に慣れさせます。モバイルホームケージでは、マウスを5〜10分間落ち着いて扱い、急な動きや音を避けてから、マウスをホームケージに戻します。この手順を不等間隔で2〜3回繰り返します。

トレーラーハウスケージは、頭部固定前に動物に麻酔をかけずに頭部固定を可能にします。雑巾を使用して、マウスを不均等な間隔で2〜3回包みます。動物が包まれている間、落ち着いていることを確認してください。

それ以外の場合は、マウスが完全に慣れるまで手順を繰り返します。取り扱いが完了した後、翌日にモバイルホームケージでのマウスの1日2回のトレーニングを開始します。各トレーニングセッションの前に動物の体重を量ります。

10%を超える体重減少を示す動物は、研究から除外されるべきです。.頭の固定アームの位置を、訓練した動物のサイズに合わせて調整します。モバイルホームケージデバイスの吸気口を標準の実験室の加圧空気出口に接続します。

空気圧が、空輸されたホームケージの自由浮揚に十分であることを確認してください。トレーラーハウスケージで慣れ親しんだ動物の訓練を始めます。マウスを雑巾で包んで固定します。

動物の頭部に取り付けられている金属製のホルダーを頭部固定アームに挿入し、ネジを締めてしっかりと固定します。エアフローをオンにして、空輸されたホームケージを浮上させます。雑巾を取り外し、マウスがホームケージを探索できるようにします。

最初のトレーニングセッション中に、マウスは凍結および震えの行動および尾の勃起を示すことがあります。動物を騒音に慣れさせるために、すべてのトレーニングセッション中および実験中に、たとえばラジオの翻訳や録音された音楽やスピーチを使用して、周囲の音に常にさらされるようにします。慢性的なストレスを避けるため、トレーニングセッションの最初の1時間は明るい照明を使用してください。

最初の1時間後、暗闇の中でトレーニングを行い、近赤外線カメラを使用して動物の行動を監視します。トレーニングセッションが完了したら、ネジをなくして動物を頭部固定アームから解放します。次のトレーニングセッションの前に、少なくとも2時間動物を自宅のケージに戻します。

マウスを他の2匹以上のマウスと一緒にケージに入れておくと、ストレスレベルが下がります。オプションで、空輸されたケージを動物と一緒にホームケージに置くことができます。これにより、環境が豊かになり、モバイルホームケージへの動物の居住が強化される可能性があります。

最後のトレーニングセッションでは、マウスは頭部固定に慣れており、空輸されたホームケージの周りを落ち着いて移動するストレスレスな行動を示すはずです。可視光がない場合、マウスの移動の軌跡は、近赤外線カメラまたは光学コンピューターマウスでケージの動きを監視することによって追跡できます。1時間または2時間以上続く長時間のトレーニングセッションでは、手動で、またはモバイルホームケージフレームに取り付けられたピペットホルダーを使用して、マウスに飲料水を提供することを検討してください。

次の図は、一般的な実験研究のタイムラインをまとめたものです。この研究は、マウスの取り扱いの2週間前に頭蓋窓を埋め込むことから始まり、1日2回のトレーニングセッションを8回行います。典型的な研究には、数時間から数日または数週間の間隔で間隔を空けた多数のイメージングセッションまたはパッチクランプ記録セッションが含まれます。

光学実験と電気生理学的実験はどちらも、認知的または行動的な刺激と読み出しと並行して行うことができます。2光子顕微鏡は、げっ歯類の脳の深部皮質層における細胞構造、さらには細胞内構造をリアルタイムで可視化できる独自の非線形光学技術です。2光子顕微鏡イメージング実験を行うには、訓練を受けた動物をモバイルホームケージに入れ、ストッパーを調整して顕微鏡光学系を偶発的な損傷から保護します。

頭蓋窓のカバーガラスを清掃して、ほこりの粒子を取り除きます。カバーガラスに液浸液を滴下します。水分が急速に蒸発するため、粘性溶液の使用をお勧めします。

このプラットフォームは、蛍光顕微鏡の広視野モードとロングパス発光フィルターを使用して、一般的な電動光学テーブルの上に配置できます。脳の血管系を評価し、関心のある領域を選択します。頭に固定され、固定された動物の尾静脈に注入される皮質血管系を画像化するために、70キロのダルトン、テキサス州の赤い抱合テキストトラン。

この画像シーケンスは、モバイルホームケージの周りを移動しながら、行動するマウスの皮質内の会場と動脈のタイムラプス記録を示しています。血管内腔を横切って引かれた線のプロファイルをプロットすることにより、血管の直径の変化と個々の血管セグメントの運動性を測定できます。動脈や静脈の血流速度は、血管壁に平行に引かれた線に沿ってラインスキャンすることで測定できます。いい。

ニューロンの形態の詳細は、台湾プロモーター下のニューロンの亜集団でYFPを発現するトランスジェニックマウスで視覚化できます。これらの2つのZacksは、麻酔をかけた動物と覚醒した動物との間のイメージングの安定性を比較します。右側のパネルは、ケタミンキシラジン混合物で麻酔をかけた動物の樹状突起を示しています。

左側のパネルには、覚醒した動物の樹状突起の画像が表示され、トレーラーハウスのケージの周りを歩いています。覚醒状態の動物の個々の脊椎の形態は、麻酔をかけたマウスと同じ信頼性と精度で解析することができます。動物が走っているときの脳の変位は、通常、1〜1.5マイクロメートルを超えません。

これらの動きは水平方向に発生し、結像面がずれることはめったになく、モーションアーチファクトの補正が不要になります。ほとんどの場合、覚醒している生きた脳の神経活動を慢性的に監視する能力は、神経系の組織と機能を理解するために不可欠です。タイ1 G Camp 3トランスジェニックマウスを用いて、モバイルホームケージ内で行動する覚醒マウスの自発的な神経活動をイメージングします。

このタイムラプス画像シーケンスは、ニューロン細胞体、ナイト、軸索におけるカルシウムスパイクの代表的な例を示しています。内因性信号に基づく光学イメージングにより、機能ドメインの空間分布をマッピングして、内因性光学イメージング実験を行うことができます。訓練された動物を、カメラ対物レンズの下にあるホームケージに入れます。

カバーガラスをほこりから取り除きます。グリセロールを一滴入れ、5ミリメートルの丸いカバースリップで覆います。ハイスピードカメラの位置を調整します。

対側バイブレーションの反対側にエアブローチューブを備えたマニピュレーターを配置します。緑色のライトを使用して、船舶の地図をイメージします。皮質血管の約400マイクロメートル下にある皮質の奥深くに焦点を合わせます。

カメラの前にバンドパスフィルターを置き、赤いライトで皮質を照らします。マウスがプラットフォームに少なくとも30分間適応するのを待ちます。6 分間のエピソードでベースライン アクティビティを記録します。

合計6分間、エアパフで10秒ごとにバイブレーションを刺激します。この画像は、0.05ヘルツの周波数でビブラ刺激に応答して体性感覚皮質に沿って伝播する神経活動を示しています。シングルセルの電気生理学的記録を行うには、逆頭蓋窓を埋め込んだ訓練済みの動物をモバイルホームケージに入れます。

ゆっくりと慎重に、金属ホルダーからカバーガラスを取り外します。皮質バッファーをリフレッシュし、止血タンポンで頭蓋窓を破片からきれいにします。接地電極を皮質バッファーに配置します。

パッチクランプピペットに細胞内溶液を充填します。電動マイクロマニピュレータを使用して記録ピペットに正圧を加え、ピペットを皮質に深くして、目的の細胞とのギガシール接触を得る。記録後、ピペットを取り外し、皮質バッファーをリフレッシュし、カバーガラスを金属ホルダーに接着して頭蓋窓を閉じます。

空輸されたホームケージを使用すると、イメージングと電気生理学を、学習、リハビリテーション、不安関連行動などの古典的な行動パラダイムと組み合わせることができます。嗅覚はマウスにとって重要な感覚入力であり、記憶テストでの刺激や新規性に対する反応の評価に使用できます。慣れ嗅覚試験を行うには、訓練を受けた動物をトレーラーハウスケージに入れ、養子縁組を許可します。

水道水に浸した清潔な綿をトレーラーハウスケージの内壁に両面粘着テープで30分間貼り付けます。5分後、ホームケージの壁に貼られている清潔な綿を、バニラの香りがする液体に浸した新しい綿と交換します。バニラの香りへの5分間の曝露を、セッションの間に5分間隔で3回繰り返します。

匂いへの関心のレベルを測定するため。動物がターゲットゾーンに面して過ごした累積時間と、モバイルホームケージの移動の合計時間を数えます。最後の5回目のセッションでは、社会的に重要な匂いを嗅ぎます。

新しい綿のアプリケーターを、異性のマウスからの尿を数滴濡らします。新規性に対する反応を評価するには、モバイルホームケージを4つのゾーンに分割します。2枚の綿片を向かい合わせに取り付けます。色。

最初の試行中に、ホームケージの壁の外側にマーカーでそれらをコーディングします。きれいな綿を2枚置きます。次に、両方をバニラの1%抽出物に浸した綿と交換します。

3回目の試行では、バニラコットンをゾーン番号1に入れ、1%バナナ抽出物に浸した綿をゾーンに入れます。その2、匂いがしないことへの嗜好を測定することです。動物が無臭に直面するのに費やす時間を、他のゾーンに直面する累積時間の割合として計算します。

こんにちは、ヘルシンキ大学神経科学センターの主任研究員であるレオ・キロです。このビデオを楽しんでいただき、お役に立てたでしょうか。私たちは過去5年間、in vivoでの顕微鏡検査に2つの側面から取り組んできましたが、美学が脳機能、血流、その他すべてに干渉するため、一般的な審美的な使用は常に大きな懸念事項でした。

そして今日、覚醒した動物で作業を行い、安定した顕微鏡イメージング実験を行い、以前に麻酔をかけた動物で得られた結果を検証および検証できることを嬉しく思います。モバイルホームケージの使用と本日発表した方法は、in vivo研究全般の関連性を高め、新しく画期的な結果につながると確信しており、